Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Visualisierung und Bestimmung der Stromula-Frequenz mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen in Blättern und die Visualisierung von Stromula in vitro mit Hilfe von Chloroplasten, die aus Blättern extrahiert werden. Diese experimentellen Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen in der pflanzlichen Zellbiologie und der Chloroplastenforschung zu beantworten, indem sie herausfinden, wie Stromula funktionieren. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie reproduzierbare und robuste Daten liefern, selbst von diesen hochdynamischen Chloroplastenstrukturen.

Wir hatten die Idee für die Chloroplasten-Isolierungsstudie, weil einige Untersuchungen darauf hindeuteten, dass die Stromulenbildung zytosolische Strukturen wie das Zytoskelett erfordert, um sich zu bilden. Also beschlossen wir, die Zelle zu mischen und zu sehen, ob sich noch Stromula bilden können. Um Blattproben vorzubereiten, schneiden Sie zunächst mit einer sehr scharfen Rasierklinge einen kleinen Abschnitt eines Nicotiana benthamiana-Blattes ab.

das Blattstück sofort nach dem Schneiden in eine mit Wasser gefüllte Fünf-Milliliter-Spritze. Entfernen Sie dann die Luft aus der Spritze und üben Sie ein Vakuum aus, indem Sie mit einem Finger die Spritzenöffnung abdecken, bevor Sie den Kolben ziehen. Lassen Sie den Kolben vorsichtig los, um eine Beschädigung des Blattabschnitts zu vermeiden.

Wiederholen Sie dann die Entlüftung zwei- bis dreimal oder bis die Luft entfernt wurde und das Blatt tiefgrün erscheint. Geben Sie einen Tropfen Wasser auf eine Folie und legen Sie den Blattabschnitt auf den Tropfen. Geben Sie dann einen weiteren Tropfen Wasser auf die Oberseite des Blattes und fügen Sie eine Deckfolie hinzu.

Wenn Luftblasen vorhanden sind, klopfen Sie vorsichtig auf den Deckglas, bis sie entfernt werden. Fokussieren Sie mit Durchlicht und einem 20-fachen Objektiv auf ein Sichtfeld in der Nähe der Mitte des Blattabschnitts und visualisieren Sie mehrere Chloroplasten gleichzeitig. Speichern Sie ein Bild mit Durchlicht, damit Zelltypen später bei Bedarf unterschieden werden können.

Schalten Sie dann auf Laserbeleuchtung mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionsfiltern für das verwendete Fluorophor um und speichern Sie ein weiteres Bild. Wählen Sie mit der Mikroskopsoftware den GFP-Kanal aus und klicken Sie, um die Lochblende auf eine luftige Einheit einzustellen. Wählen Sie Laserscanning, um mit der Visualisierung der Probe zu beginnen, und klicken Sie dann auf den GFP-Kanal und die Detektorverstärkung, um die Laserleistung zu minimieren und gleichzeitig die Stromula deutlich zu visualisieren.

Bereiten Sie als Nächstes ein Z-Stapel-Experiment vor, bei dem die Bildserie durch die Blattepidermis im Sichtfeld erfasst wird. Passen Sie die Scangeschwindigkeit und die Bildauflösung nach Bedarf an, um sicherzustellen, dass der Z-Stapel schnell erfasst wird. Speichern Sie dann den Z-Stapel für eine spätere Analyse.

Führen Sie den Z-Stapel mit Bild J mit der maximalen Intensität in der Software zu einem einzelnen Bild zusammen. Identifizieren und zählen Sie dann manuell alle Chloroplasten im Bild. Bestimmen Sie für jeden Chloroplasten visuell, ob ein oder mehrere Stromulen zu sehen sind, die sich vom Chloroplasten aus im zusammengeführten Z-Stapelbild erstrecken.

Um intakte Chloroplasten zu extrahieren, bereiten Sie einen Kaltextraktionspuffer mit den folgenden Reagenzien vor. Stellen Sie dann mit NaOH und HCl den pH-Wert auf 6,9 ein und kühlen Sie es vor der Verwendung. Bereiten Sie einen Isolationspuffer vor und stellen Sie den pH-Wert auf 7,6 ein.

Wenn die Blätter kein genetisch kodiertes Stromofluorophor exprimieren, bereiten Sie Carboxyfluoresceindiacetat oder CFDA-Lösung vor. Um Chloroplasten zu isolieren, entfernen Sie etwa 5 bis 10 Gramm Blätter von mehreren Pflanzen und spülen Sie sie kurz in kaltem Wasser ab. Dann sofort die Blätter in 50 Milliliter Kaltextraktionspuffer umfüllen.

Mahlen Sie die Blätter mit einem Mixer mit mehreren kurzen Hülsenfrüchten und filtern Sie die Mischung dann durch zwei bis drei Schichten Käsetuch, um Blattreste zu entfernen. Das extrahierte Chloroplast wird auf zwei 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aufgeteilt und eine Minute lang bei 750 x g zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie 10 Milliter Isolationspuffer, um die grünen Chloroplasten wieder zu suspendieren.

Dann wird erneut eine Minute lang bei 750 x g zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Chloroplasten mit Isolationspuffer bis zu einem Endvolumen von fünf Millilitern wieder suspendiert. Wenn die Chloroplasten von transgenen Pflanzen stammen, die Plastiden-gezielte fluoreszierende Proteine exprimieren, übertragen Sie 20 Mikroliter der Chloroplasten auf einen Objektträger und fügen Sie einen Deckschirm hinzu. Führen Sie anschließend eine Mikroskopie durch.

Um Chloroplasten von Pflanzen zu färben, die keine auf Plastiden ausgerichteten fluoreszierenden Proteine exprimieren, fügen Sie fünf Mikroliter 50 Millimolar CFDA-Stamm zu den fünf Millilitern Chloroplasten im Isolationspuffer hinzu. Nachdem Sie die Chloroplasten fünf Minuten lang inkubiert haben, übertragen Sie ein kleines Aliquot auf einen Objektträger, fügen Sie ein Deckglas hinzu und führen Sie eine Mikroskopie durch. Verwenden Sie schließlich ein FITC- oder GFP-Filterset und ein 20x-Objektiv, um mehrere Chloroplasten gleichzeitig sichtbar zu machen.

Oder ein höheres Ziel, um einen einzelnen isolierten Chloroplasten sichtbar zu machen. Hier ist ein verschmolzener Stack zu sehen, der die GFP-Stomule-Häufigkeit in der Codoledenz junger N.Benthamiana-Sämlinge zeigt. In diesem Panel wurde das Bild entsättigt und invertiert, so dass das Stroma schwarz erscheint.

Die Chloroplasten wurden entweder als stromulfrei oder mit mindestens einer Stromule gekennzeichnet. Von den 87 sichtbaren epidermalen Chloroplasten haben 33 Stromuli, was einer Häufigkeit von 37,9 Prozent in diesem Blatt entspricht. Diese Grafik zeigt die Analyse von über 23.000 Chloroplasten und mehreren hundert Zellen aus einem einzigen Blatt von 21 verschiedenen Pflanzen.

Die durchschnittliche Stromstoßhäufigkeit während des Tages betrug 20,8 plus oder minus 1,8 Prozent, und die durchschnittliche nächtliche Stromstoßhäufigkeit betrug 12,8 plus oder minus 0,9 Prozent, was auf eine signifikant höhere Tagesfrequenz hinweist, wie durch den Welch-T-Test bestimmt. In dieser Abbildung wurden Chloroplastenstromula in vitro nach Isolierung aus N. benthamiana beobachtet, die Plastiden-zielgerichtetes GFP exprimierte, oder nach Verwendung von CFDA zur Färbung von Chloroplasten aus N. benthamiana oder Spinachia oleracea. Bei der Bildgebung von Stromulen ist es wichtig, schnell zu arbeiten und das Pflanzengewebe so wenig wie möglich zu manipulieren.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Gen-Silencing oder chemische Behandlungen verwendet werden, um zusätzliche molekulare Akteure oder Signalwege zu entdecken, die an der Bildung und Funktion von Stromula beteiligt sind. Diese Technik wurde von Forschern in der Pflanzenzellbiologie und Pflanzenimmunität verwendet, um die Rolle von Stromulen in zellulären Signalwegen und pflanzlichen Reaktionen auf Krankheitserreger zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Stromulafrequenz in einem Blatt berechnet und wie man Stromuli in extrahierten Chloroplasten beobachtet.

Und denken Sie daran, dass die Laser und die elektrische Spannung, die ein konfokales Rasterelektronenmikroskop versorgen, extrem gefährlich sein können, und es ist wichtig, die Systemanforderungen für die Verwendung dieses Geräts zu verstehen.