Name: Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung von Stromulus-Frequenz in Pflanzenzellen mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie an Nicotiana benthamiana. Diese Methode liefert reproduzierbare Daten zur Chloroplasten-Dynamik.

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J.O.B. und A.M.R. wurden durch Predoctoral Fellowships der National Science Foundation unterstützt.

HINWEIS: Für dieses Protokoll haben wir auf Testen Stromulus Frequenz in der Epidermis von N. fokussiert benthamiana verlässt. Mehrere stabile transgene Linien erzeugt worden , die für diesen Zweck verwendet werden können, einschließlich 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 und NRIP1: Cerulean 6. Beide Linien zeigen robuste Expression von Fluorophoren in den Chloroplasten Stroma der Blätter unter einer Vielzahl von Bedingungen gewachsen. Alternativ Chloroplasten-bezogene Fluorophore transient in N. ausgedrückt werden kann benthamiana unter Verwendung von Agrobacterium - Transformationen 13. Dies ist weniger ideal als die transgenen Linien, da einige basalen Abwehrreaktionen in N. induzieren Agrobacterium Infiltrationen benthamiana und Wechselwirkungen mit Agrobacterium kann Stromulus Frequenz in dem Blatt 14, die möglicherweise zu verkomplizieren Interpretation der Ergebnisse zu ändern. Schließlich Stromulus Bildung in vitro zu visualisieren,Chloroplasten können aus jeder beliebigen Pflanzenspezies, entweder genetisch codierten Fluorophore oder einen fluoreszierenden Farbstoff extrahiert werden, wie in Kapitel 5 unten. 9,15 HINWEIS:. Detaillierte Beschreibung der Methoden für Pflanzenanbau wurden bereits beschrieben 16 Kurz gesagt, wachsen N. benthamiana Pflanzen in 4 &quot;Töpfe mit jeder professionellen Bodenmischung gefüllt , die eine gute Drainage zur Verfügung stellt. Decken Sie Sämlinge mit einem durchsichtigen Kunststoff - Kuppel in den ersten 10 bis 14 Tage , um eine feuchte Umgebung für die Keimung zur Verfügung zu stellen. In jedem Standard - Dünger - Mix Anweisungen folgen Herstellers zu 14- Tage alten Pflanzen. wachsen Pflanzen unter weißem Licht, mit ~ 100 &amp; mgr; mol Photonen m -2 s -1 Lichtintensität. Wasserpflanzen regelmäßig. 1. Vorbereiten Blattproben für Visualisierung HINWEIS: Stromulus Dynamik durch Verwundung 8 betroffen, so sollten Gewebepräparation sofort durchgeführt werden , bevor Stromulus Visualisierungs durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie. Idealerweise sollte eine Probe mit 15 min nach Entnahme aus der Anlage visualisiert werden. <ol><li> Schneiden Sie einen kleinen Abschnitt des Blattes eine sehr scharfe Rasierklinge. Verwenden Sie immer den gleichen Bereich des Blattes für Konsistenz, und sicher sein, die gleiche Oberfläche (adaxial oder abaxial) in allen Versuchen zu visualisieren. </li><li> Unmittelbar nach dem Blattschneidabschnitt, die Blattabschnitt in einem 5 ml nadellose Spritze mit Wasser gefüllt unterzutauchen Entfernen von Luft aus der Spritze und ein Vakuum anzuwenden, indem die Spritzenöffnung mit einem Finger abdecken und den Kolben zu ziehen. <ol><li> Lassen Sie den Kolben sanft zu vermeiden, dass die Blattabschnitt zu beschädigen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- oder dreimal, oder bis die meisten der Luft entfernt worden ist und das Blatt erscheint tiefgrün sein. Hinweis: Dieser Schritt Luft in dem Blatt entfernt, die genaue Visualisierung von stromules stören können. </li></ol></li><li> Fügen Sie einen Tropfen Wasser zu einer Folie und legen Sie den Blattabschnitt auf diesen Rückgang. Dann fügen Sie eine weitere drop Wasser an die Spitze des Blattes, und legen Sie eine Deckglas über das Blatt. Wenn es irgendwelche Luftblasen sind, vorsichtig das Deckglas klopfen, bis sie entfernt werden. Der Schlitten ist nun bereit für die Mikroskopie und sollten sofort sichtbar gemacht werden. </li></ol> 2. Visualizing Stromules mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Mit durchgehendem Licht, konzentrieren sich auf ein Sichtfeld in der Nähe der Mitte des Blattes Abschnitt (weg von den durch die Rasierklinge geschädigte Zellen). Verwenden Sie ein 20x-Objektiv, so dass viele Chloroplasten gleichzeitig sichtbar gemacht werden kann. Speichern eines Bildes mit Durchlicht, so dass Zelltypen später unterschieden werden kann, falls erforderlich. </li><li> Schalten Sie die Beleuchtungsquelle einen Laser mit geeigneten Anregungs- und Emissionsfiltern für das Fluorophor verwendet wird. Beispielsweise GFP mit einem 488 nm Laser erregt und Emissionen zwischen 500 nm und 525 nm erhalten. <ol><li> Mit Hilfe der Software des Mikroskops, wählen Sie die GFP-Kanal und klicken Sie auf die Lochblende auf 1 Ai einzustellenry Einheit. Wählen Sie Laserscanning, starten die Probe zu visualisieren, und klicken Sie dann auf das GFP-Kanal, um die Laserintensität einzustellen und die Detektorverstärkung der Laserleistung zu minimieren, während immer noch deutlich stromules zu visualisieren. Sobald diese Einstellungen festgelegt worden sind, halten sie so konsequent wie möglich in allen Experimenten. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine z -stack Experiment , das eine Reihe von Bildern durch die Blattepidermis im Sichtfeld sammeln. <ol><li> Für die z -stack, umfassen alle epidermalen Chloroplasten in dem Sichtfeld Verzerrungen zu vermeiden (zum Beispiel, wenn die Chloroplasten in der Nähe der Blattoberfläche mehr stromules unter Bedingungen getestet haben). </li><li> Nehmen Bilder mit der maximalen Intervall möglich , dass alle stromules beinhalten wird , aber minimiert die Zeit für eine z -stack erforderlich. Wenn zum Beispiel 1 Airy Einheit entspricht einem fokussierten konfokalen Abschnitt, der 2 &amp; mgr; m tief ist, um ein Bild nehmen alle 2 &amp; mgr; m wahrscheinlich ideal ist. HINWEIS: Das Blatt epidermis ist eine unebene Oberfläche, so dass die Gesamttiefe der z -stack auf der Probe abhängig variieren; die meisten z -stacks werden 10-20 Bilder erfordern, kann aber mehr beinhalten. </li><li> Passen Scangeschwindigkeit und Bildauflösung als notwendig , um sicherzustellen , dass die z -stack schnell gesammelt wird ( in der Regel innerhalb von 5-10 min, wenn möglich). Speichern Sie die z -stack für eine spätere Analyse. </li></ol></li></ol> 3. Bildverarbeitung <ol><li> Bestimmen Sie Stromulus Frequenz unter Verwendung eines beliebigen Bildanalyse-Software. Für dieses Protokoll, empfehlen wir die Verwendung ImageJ, die von der National Institutes of Health öffentlich zugänglich ist (http://imagej.nih.gov/ij/) oder dem beliebten Upgrade von ImageJ, Fidschi (http://fiji.sc / Fidschi). </li><li> Zusammenführen der z -stack in einem einzigen Bild die maximale Intensitätsprojektion in der Software. </li><li> Identifizieren und von Hand alle Chloroplasten im Bild zu zählen. </li><li> Für jede Chloroplasten bestimmen visuell, ob ein oder mehrere stromulessind zu sehen in der fusionierten z -stack Bild von den Chloroplasten erstreckt. Beispiele siehe Abbildung 1. Hinweis: Da die biologischen Funktionen von stromules nicht bekannt sind, jede dünne, Stroma gefüllten, röhrenförmige Verlängerung aus dem Chloroplast kann ein &quot;Stromulus&quot; angesehen werden, unabhängig von der Länge. Als allgemeine Regel wird ein Stroma gefüllte Verlängerung von der Chloroplast ist ein Stromulus wenn es weniger als etwa 1 um im Durchmesser über den grßten Teil seiner Länge 7 ist. Stellen Sie sicher, dass eine Person alle Bilder Analysen zur subjektiven Unterschiede zur Kontrolle bei der Bestimmung, ob ein Chloroplasten ein Stromulus hat. Ein zweiter Forscher sollten die Stromulus Frequenzen unabhängig überprüfen zu weiteren subjektive Vorurteile reduzieren. </li></ol> 4. Experimentelles Design und Sampling HINWEIS: Stromulus Frequenz ist sehr variabel zwischen Blättern, aber mehrere Berichte deuten darauf hin, daß es wenig Variation in Stromulus Frequenz innerhalb eines indiviDoppelblatt 9,17. <ol><li> Berechne die Blatt Stromulus Frequenz von einem einzigen Sichtfeld eines Blattes. Nehmen Sie das Blatt, und betrachten dies eine unabhängige Probe. Achten Sie nicht auf separaten Sichtfelder von einem Blatt als unabhängige Stichproben. HINWEIS: Es gibt keinen Konsens darüber, wie man am besten messen Veränderungen in Stromulus Aktivität, und bis die Funktion von stromules mehr klar definiert, Forscher sollten weiterhin bei der Quantifizierung Stromulus Dynamik, kreativ zu sein. Zum Vergleich: in der Literatur sollten jedoch gemeinsame Standards für die Berichterstattung zusätzlich zu mehr kreative Ansätze verwendet werden. Bei einem Minimum, können immer die Frequenz von Chloroplasten, die eine oder mehrere stromules haben. </li><li> Bestimmen Sie die Häufigkeit der Chloroplasten, die stromules in einem Sichtfeld haben. Verwenden ImageJ um alle Chloroplasten identifizieren, in einem Sichtfeld. Dann wird für jede Chloroplasten, bestimmen, ob die Chloroplasten mindestens eine Stromulus gebildet hat. Bericht Stromulus Frequenz wie die Percentage von Chloroplasten mit einem Stromulus. ANMERKUNG: Manche Forscher Transformations den Prozentsatz, beispielsweise mit dem Arcussinus-Transformation vor Stromulus Frequenzen Berichterstattung; Während dies eine Option für die statistische Analyse, ist die Arkussinus Stromulus Frequenz nicht ein intuitives Wert und muss nicht im Haupttext oder Zahlen einer Studie berichtet werden. <ol><li> Als alternativer Ansatz, die Gesamtzahl der stromules zählen und teilen sie durch die Gesamtzahl der Chloroplasten. HINWEIS: In den meisten Fällen diese ähnliche Ergebnisse liefern wird 4.2 zu nähern; es kann die Stromulus Frequenz, aber überschätzen, wenn ein einzelner Chloroplasten viele stromules gebildet hat. Im Beispiel unter repräsentativen Ergebnisse gezeigt, haben beispielsweise mehrere Chloroplasten zwei oder mehr stromules, die Anzahl der pro stromules Chloroplasten zu 40/87 Anhebung (im Vergleich zu einer Stromulus Frequenz von 33/87). </li><li> Alternativ bestimmen die Stromulus Länge anstelle von Stromulus Frequenz. Länge gemessen werdenin ImageJ durch die Stromulus mit dem freihändig Zeilen-Tool zu verfolgen. HINWEIS: Da die biologische Rolle von stromules unbekannt bleibt, ist es nicht klar, dass Stromulus Länge ihrer Funktion beeinträchtigt. Bericht erhebliche Unterschiede in Stromulus Länge, wenn sie beobachtet werden, sondern auch die Stromulus Frequenzen aus (wie in 4.2 beschrieben). HINWEIS: Stromulus Frequenz kann zwischen verschiedenen Blättern unter den gleichen Wachstumsbedingungen stark variieren. Daher wird, obwohl Stromulus frequenzbestimmendes kann sollten sorgfältig große Probengrößen enthalten ausgelegt werden zeitraubend, Experimente sein. Mit Datensätze aus unserem Labor haben wir festgestellt, dass eine Stichprobengröße von mindestens 16 Pflanzen für jede Behandlung in der Regel stark genug ist, um zu bestimmen, ob es einen statistisch signifikanten Unterschied von mindestens einem 1,5-fache Veränderung der Stromulus Frequenz zwischen zwei Zuständen ist (mit Standard α = 0,05 und β = 0,80). </li></ol></li><li> Die statistische Analyse der Ergebnisse. <ol><li> Zum Vergleich der mirein Stromulus Frequenzen von zwei Behandlungen, verwenden Sie die t - Test Welch (auch als heteroscedastic t - Test oder t - Test unter der Annahme , ungleiche Varianz bekannt). HINWEIS: Dieser Test ist nicht so mächtig wie die t - Test herkömmlichen Student, aber Welch t - Test ist vorteilhaft , da sie nicht davon ausgehen , dass die Varianz in Stromulus Häufigkeitsverteilung zwischen den Behandlungen ähnlich ist. HINWEIS: Da Stromulus Frequenz ein &quot;Verhältnis&quot;, wird seine Stichprobenverteilung vorhergesagt binomischen zu sein, anstatt normal, die Skew statistische Analyse theoretisch könnte, wenn Probengrößen sehr niedrig sind oder wenn Stromulus Frequenz ist sehr gering (nahe 0%) oder sehr hoch (nahezu 100%). Einige Berichte haben verwendet Arkussinus Transformationen vor der statistischen Analyse, die dazu bestimmt ist binomialverteilt zu einer Normalverteilung zu transformieren und damit die Standardanforderungen eines Studenten-t - Test oder ANOVA erfüllen. In der Praxis wird jedoch einrcsine Transformationen haben wenig oder keine Wirkung auf die statistische Analyse, und werden daher nicht empfohlen. Stattdessen wiederholen Experimente Probengröße zu erhöhen, was die statistische Aussagekraft zu erhöhen und reduzieren Fehler bei der Interpretation der Daten. </li><li> Was auch immer statistischer Ansatz verwendet wird, sollten Sie sorgfältig zu berichten über die Strategie der Probenahme, Probengröße, statistischen Test, und p - Wert für jedes Experiment. Hinweis: Wie bei anderen Bereichen der Biologie, einen p - Wert von weniger als 0,05 betrachtet werden kann &quot;statistisch signifikant&quot;, obwohl Forscher sicherlich die genaue p - Wert erhalten berichten. Wenn p etwas über 0,05 ist, kann die Stichprobengröße mit zwei oder drei Versuchen zu erhöhen helfen , zu klären , ob der beobachtete Unterschied ist reproduzierbar und statistisch signifikant. </li></ol></li></ol> 5. Extrahieren von Intact Chloroplasten Stromulus Dynamics zu visualisieren HINWEIS: Mehrere Methodeneinem etwas anderes Protokoll zu isolieren Chloroplasten von Blättern verwendet werden, einschließlich in einer aktuellen Studie über Stromulus Bildung in vitro 15 wurden. Das Protokoll detailliert unten verwendet eine relativ einfache Methode , die nicht biochemisch reinen Chloroplasten Proben nicht fließt, sondern hat stattdessen eine große Menge an intakten, gesunden Chloroplasten 9,18 isolieren. <ol><li> Bereiten kalten Extraktionspuffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM Sorbitol, 2 mM EDTA, 1,0 mM MgCl 2 und 1,0 mM MnCl 2. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,9 mit NaOH und HCl, und im Kühlschrank lagern vor dem Gebrauch. HINWEIS: Obwohl es nicht notwendig, kalte Puffern und Proben auf Eis zu halten, wenn möglich, einen höheren Anteil an intakten Chloroplasten ergibt. </li><li> Bereiten Sie Isolationspuffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM Sorbit, 2 mM EDTA, 1,0 mM MnCl 2, 1,0 mM MgCl 2, 10 mM KCl und 1,0 mM NaCl. Der pH-Wert auf 7,6 mit NaOH und HCl und im Kühlschrank lagern vor dem Gebrauch. </li><li> Wenn die Blätter sind nichteine genetisch kodierte Stromatumoren Fluorophore, bereiten Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) Lösung zum Ausdruck: 50 mM CFDA-Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) (2,3 mg CFDA pro 1,0 ml DMSO). HINWEIS: Die genaue Konzentration ist nicht kritisch. Halten Sie CFDA Lager im Dunkeln zu allen Zeiten. Speichern von kleinen Aliquots von 50 mM CFDA bei -20 ° C. </li><li> Zur Isolierung Chloroplasten, entfernen ~ 5-10 g Blätter von verschiedenen Pflanzen und spülen Sie kurz in kaltem Wasser. Ab sofort übertragen zu 50 ml kaltem Extraktionspuffer. Grind Blätter einen Mixer mit mehreren kurzen Impulsen. Man filtriert durch zwei oder drei Schichten Seihtuch Blattreste zu entfernen, unterteilen die extrahierte Chloroplasten in zwei 50 ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren für 1 min bei 750 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren die grünen Chloroplasten in 10 ml Isolationspuffer. Zentrifuge erneut für 1 min bei 750 xg, Überstand verwerfen und Resuspension Chloroplasten in Isolationspuffer Endvolumen auf 5 ml zu bringen. </li><li> Transfer 201; l der Chloroplasten zu einer Folie, Deckel mit einem Deckglas und beginnen Mikroskopie. HINWEIS: Chloroplasten aus transgenen Pflanzen plastidenspezifische gezielte fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, sind nun bereit für die Visualisierung durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Stain Chloroplasten von Pflanzen, die nicht plastidenspezifische gezielte fluoreszierende Proteine ​​exprimieren stromules zu visualisieren. <ol><li> In 5 ul 50 mM CFDA Lager zu den 5 ml in Isolationspuffer-Chloroplasten suspendiert. Bringen Sie die Endkonzentration auf 50 &amp; mgr; M. </li><li> Lassen Sie Chloroplasten für 5 min inkubiert und dann übertragen Sie eine kleine Teilmenge (~ 50 &amp; mgr; l) zu einer Folie, Deckel mit einem Deckglas und beginnen Mikroskopie. </li><li> Verwenden Sie ein FITC oder GFP-Filtersatz. Verwenden Sie ein 20X Ziel vieler Chloroplasten gleichzeitig sichtbar zu machen, oder ein höheres Ziel, einen einzelnen isolierten Chloroplasten zu visualisieren. HINWEIS: CFDA innerhalb des Stroma von intakten Chloroplasten fluoresziert. </li><li> Wenn es eine starke Hintergrundfluoreszenz, waschen Sie die chloroplasts wieder in 10 ml Isolationspuffer nach der 5 min Inkubation mit CFDA, Zentrifuge für 1 min bei 750 · g, Überstand verwerfen und Resuspension in 5 ml Isolationspuffer. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wenn stromules untersuchen, drei wichtige Faktoren müssen in allen in Betracht gezogen werden: (i) Manipulation des Pflanzengewebes muss auf ein absolutes Minimum beschränkt werden, (ii) das experimentelle System muss konsistent gehalten werden, und (iii) Probenahmestrategien sorgfältig geplant werden müssen, um sicherzustellen, robust, sind reproduzierbare Daten analysiert. Stromules sind bemerkenswert dynamisch: sie, bevor ein Beobachter die Augen unter dem Mikroskop schnell ein- und ausfa...

Chloroplasten sind dynamische Organellen in Pflanzenzellen, die für die Photosynthese und eine Vielzahl anderer Stoffwechselprozesse verantwortlich sind. Die Signalwege des Chloroplasten haben ebenfalls einen signifikanten Einfluss auf die Physiologie und Entwicklung der Pflanzen und koordinieren die Reaktionen der Pflanzen auf Umweltstress, Krankheitserreger und sogar die Blattform1-6. In jüngster Zeit haben Biologen Interesse an einem wenig verstandenen Aspekt der Chloroplastenstruktur geweckt: Stromuli, sehr dünne, mit Stroma gefüllte Tubuli, die sich von der Oberfläche des Chloroplasten7 erstrecken.
Die biologischen Funktionen von Stromulen sind unbekannt, obwohl bekannt ist, dass die Stromulenfrequenz als Reaktion auf Umweltreizevariiert 7-9, und Stromulen möglicherweise in der Lage sind, Signalmoleküle zwischen Organellen zu übertragen6. Alle Arten von Plastiden (nicht nur die grünen, photosynthetischen Chloroplasten, sondern auch klare Leukoplasten, stärkegefüllte Amyloplasten und pigmentierte Chromoplasten, um nur einige Arten von Plastiden zu nennen) bilden Stromulen, und Stromuli kommen bei allen bisher untersuchten Landpflanzenarten vor. Stromulen können sich dynamisch aus- und zurückziehen und innerhalb von Sekunden erscheinen oder verschwinden, oder sie können über lange Zeit relativ stationär bleiben. Eine der größten Hürden für Stromule-Biologen besteht darin, dass Stromula oft mit dramatisch unterschiedlichen Methoden, Geweben und Spezies untersucht werden, was Vergleiche in der Literatur zur Stromule-Biologie erschwert. In Zukunft werden Standardpraktiken und gründliche Beschreibungen der experimentellen Systeme, die zur Untersuchung von Stromulen verwendet werden, entscheidend sein, um die Funktion dieser allgegenwärtigen Merkmale der Chloroplastenmorphologie zu entdecken.
Hier beschreiben wir Methoden zur Visualisierung der Stromulenbildung in den epidermalen Chloroplasten von Nicotiana benthamiana Blättern. Im Mesophyll sind die Chloroplasten dicht in großen, dreidimensionalen Zellen gepackt, was es schwierig macht, Stromula durch konfokale Mikroskopie genau und schnell sichtbar zu machen. Im Gegensatz dazu sind epidermale Zellen relativ flach, enthalten weniger Chloroplasten und befinden sich an der Oberfläche des Blattes, was eine einfache und schnelle Visualisierung von Stromula ermöglicht. N. benthamiana ist ein ideales Modellsystem für diese Experimente, da im Gegensatz zu vielen Pflanzenarten alle Zellen in der Epidermis von N. benthamiana Chloroplasten 10 bilden. In der Epidermis der meisten Pflanzen, einschließlich Arabidopsis thaliana, haben nur die stomatären Schließzellen Chloroplasten, während andere Epidermiszellen "Leukoplasten" haben, Plastiden, die klar, relativ amorph und nicht photosynthetisch sind9,11,12. Während also ein einzelnes Sichtfeld einer A. thaliana-Epidermis nur eine Handvoll Chloroplasten in einem Paar Schließzellen zeigen kann, umfasst das Sichtfeld einer N. benthamiana-Epidermis Dutzende oder sogar Hunderte von Chloroplasten. Alle hier beschriebenen Methoden können jedoch modifiziert werden, um andere Fragen der Stromule-Biologie zu untersuchen; zum Beispiel haben wir den gleichen Ansatz verwendet, um die Leukoplastenstromula von A. thaliana9 zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fischer-Scientific</td><td>S320-1</td><td></td></tr><tr><td>Sorbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fischer-Biotech</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Modell: LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21879&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>EMD</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Waring Mixer</td><td>Waring&nbsp;</td><td>Modell: 31BL92</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>fiji.sc</td><td></td><td>Open-Source-Software zur Analyse biologischer Bilder</td></tr></tbody></table>

visualizing stromulus frequenz mit fluoreszenzmikroskopie

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromuli oder "stromagefüllte Tubuli" sind schmale, röhrenförmige Fortsätze von der Oberfläche des Chloroplasten, die universell in Pflanzenzellen beobachtet werden, deren Funktionen jedoch rätselhaft bleiben. Neben der wachsenden Aufmerksamkeit für die Rolle von Chloroplasten bei der Koordination von Pflanzenreaktionen auf Stress hat das Interesse an Stromulen und ihrer Beziehung zur Dynamik der Chloroplasten-Signalgebung in den letzten Jahren zugenommen, unterstützt durch Fortschritte in der Fluoreszenzmikroskopie und Proteinfluorophore, die eine schnelle und genaue Visualisierung der Stromulendynamik ermöglichen. Hier stellen wir detaillierte Protokolle zur Verfügung, um die Stromulenfrequenz in den epidermalen Chloroplasten von Nicotiana benthamiana zu testen, einem hervorragenden Modellsystem zur Untersuchung der Biologie von Chloroplastenstromula. Wir bieten auch Methoden zur Visualisierung von Chloroplastenstromulen in vitro an, indem wir Chloroplasten aus Blättern extrahieren. Schließlich skizzieren wir Stichprobenstrategien und statistische Ansätze, um Unterschiede in den Stromule-Frequenzen als Reaktion auf Stimuli wie Umweltstress, chemische Behandlungen oder Gen-Silencing zu analysieren. Forscher können diese Protokolle als Ausgangspunkt nutzen, um neue Methoden für innovative Experimente zu entwickeln, um zu erforschen, wie und warum Chloroplasten Stromulen bilden.

Dieses Protokoll wurde verwendet , Stromulus Frequenz am Tag sichtbar zu machen und in der Nacht in den Kotyledonen der jungen N. benthamiana Sämlinge. Scheiben von einem z- Stapel wurden in einem einzigen Bild (Abbildung 1A) verschmolzen. Zur visuellen Zwecken wurde das Bild dann entsättigt und invertiert , so daß Stroma erscheint schwarz (1B). Die Chloroplasten wurden beschriftet entweder als keine stromules mit (grüner Stern) oder mi...

Protokolle zur Untersuchung der Dynamik von Chloroplastenstromuli, den stromagefüllten Tubuli, die sich von der Oberfläche der Chloroplasten erstrecken, werden beschrieben.

Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der lebendzellulären konfokalen Fluoreszenzmikroskopie die Häufigkeit von Stromulen in Blättern sichtbar zu machen und zu bestimmen sowie Stromulen in vitro mittels aus Blättern isolierter Chloroplasten zu visualisieren. Diese experimentellen Methoden können helfen, zentrale Fragen der Pflanzenzellenbiologie und der Chloroplastenforschung zu beantworten, indem sie aufklären, wie Stromulen funktionieren. Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt darin, dass sie reproduzierbare und robuste Daten liefern, selbst für diese hochdynamischen Chloroplastenstrukturen. Wir hatten die Idee für die Studie zur Chloroplastenisolierung, weil einige Untersuchungen darauf hindeuteten, dass die Bildung von Stromula zytosolische Strukturen wie das Cytoskelett erforderten. Daher beschlossen wir, die Zelle zu homogenisieren und zu untersuchen, ob Stromula weiterhin gebildet werden könnten. Um Blattproben vorzubereiten, schneiden Sie zunächst mit einer sehr scharfen Rasierklinge einen kleinen Abschnitt eines Nicotiana benthamiana-Blattes ab.Unmittelbar nach dem Abschneiden des Blattstücks dieses in eine mit Wasser gefüllte Fünf-Milliliter-Spritze eintauchen. Anschließend die Luft aus der Spritze entfernen und ein Vakuum erzeugen, indem die Öffnung der Spritze mit einem Finger verschlossen und der Kolben zurückgezogen wird. Den Kolben vorsichtig loslassen, um das Blattstück nicht zu beschädigen.Wiederholen Sie dann das Entfernen der Luft zwei- oder dreimal, oder bis die Luft vollständig entfernt ist und das Blatt dunkelgrün erscheint. Geben Sie einen Tropfen Wasser auf einen Objektträger und legen Sie das Blattstück auf den Tropfen. Geben Sie anschließend einen weiteren Tropfen Wasser auf das Blattstück und setzen Sie ein Deckglas auf.Wenn Luftblasen vorhanden sind, klopfen Sie vorsichtig auf die Deckglasabdeckung, bis sie entfernt sind. Fokussieren Sie mit durchgehendem Licht und einem 20x-Objektiv auf ein Blickfeld nahe der Mitte des Blattschnitts, wobei mehrere Chloroplasten gleichzeitig sichtbar werden. Speichern Sie ein Bild mit durchgehendem Licht, sodass Zelltypen gegebenenfalls später unterschieden werden können.Wechseln Sie dann zur Laserbeleuchtung mit den geeigneten Anregungs- und Emissionsfiltern für den verwendeten Fluorophor und speichern Sie ein weiteres Bild. Wählen Sie im Mikroskop-Software die GFP-Kanal aus und klicken Sie, um die Lochblende auf eine Airy-Einheit einzustellen. Wählen Sie den Laserscan, um die Probe zu visualisieren, und klicken Sie dann auf den GFP-Kanal und die Detektorverstärkung, um die Laserleistung zu minimieren, während die Stromule dennoch klar sichtbar bleiben.Bereiten Sie als Nächstes ein Z-Stapel-Experiment vor, das die Reihe von Bildern durch das Blatt-Epidermis im Sichtfeld aufnimmt. Passen Sie die Scangeschwindigkeit und Bildauflösung entsprechend an, um sicherzustellen, dass der Z-Stapel schnell erfasst wird. Speichern Sie anschließend den Z-Stapel für die spätere Analyse.Verwenden Sie ImageJ, um den Z-Stack mit der maximalen Intensität in der Software zu einer einzigen Aufnahme zusammenzuführen. Identifizieren Sie anschließend alle Chloroplasten in der Aufnahme und zählen Sie sie manuell. Bestimmen Sie für jeden Chloroplasten visuell, ob ein oder mehrere Stromuli im zusammengeführten Z-Stack-Bild vom Chloroplasten ausgehen.Um intakte Chloroplasten zu gewinnen, bereiten Sie einen kalten Extraktionspuffer mit den folgenden Reagenzien vor. Anschließend stellen Sie mit NaOH und HCl den pH-Wert auf 6,9 ein und kühlen den Puffer vor der Verwendung. Bereiten Sie den Isolationspuffer vor und stellen Sie den pH-Wert auf 7,6 ein.Wenn die Blätter keinen genetisch codierten Stromofluorophor exprimieren, bereiten Sie eine Carboxyfluorescein-diacetat- oder CFDA-Lösung vor. Um Chloroplasten zu isolieren, entfernen Sie etwa 5 bis 10 Gramm Blätter von mehreren Pflanzen und spülen Sie sie kurz mit kaltem Wasser ab. Überführen Sie die Blätter anschließend unverzüglich in 50 Milliliter kalte Extraktionspufferlösung.Zerkleinern Sie die Blätter mithilfe eines Mixers mit mehreren kurzen Impulsen und filtrieren Sie die Mischung anschließend durch zwei bis drei Lagen Mullbinde, um Blatttrümmer zu entfernen. Geben Sie das extrahierte Chloroplastenmaterial auf zwei 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf und zentrifugieren Sie eine Minute bei 750 × g. Entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie 10 Milliliter Isolierungspuffer, um die grünen Chloroplasten erneut aufzuschwemmen.Anschließend erneut eine Minute bei 750 × g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und die Chloroplasten mit Isolationspuffer bis zu einem Endvolumen von fünf Millilitern resuspendieren. Falls die Chloroplasten von transgenen Pflanzen stammen, die plastidengesteuerte fluoreszierende Proteine exprimieren, 20 Mikroliter der Chloroplasten auf einen Objektträger überführen und einen Deckglaser hinzufügen. Danach die Mikroskopie durchführen.Um Chloroplasten von Pflanzen zu färben, die keine plastidzielgerichteten fluoreszierenden Proteine exprimieren, geben Sie fünf Mikroliter einer 50 Millimolar CFDA-Stammlösung zu den fünf Milliliter Chloroplasten in Isolationspuffer hinzu. Nach einer fünfminütigen Inkubationszeit überführen Sie eine kleine Aliquotprobe auf einen Objektträger, setzen ein Deckglas auf und führen die Mikroskopie durch. Abschließend visualisieren Sie mehrere Chloroplasten gleichzeitig mithilfe eines FITC- oder GFP-Filter-Sets und eines 20x-Objektivs. Oder ein Objektiv mit höherer Vergrößerung, um einen einzelnen, isolierten Chloroplasten sichtbar zu machen. Hier ist ein zusammengefügter Stapel dargestellt, der die GFP-Stomulen-Frequenz im Kollodium junger N. benthamiana-Sämlinge zeigt. In diesem Panel wurde das Bild entsättigt und invertiert, sodass das Stroma schwarz erscheint.Die Chloroplasten wurden entweder als ohne Stromule oder mit mindestens einer Stromula gekennzeichnet. Von den 87 sichtbaren epidermalen Chloroplasten besaßen 33 Stromula, was einer Häufigkeit von 37,9 Prozent in diesem Blatt entspricht. Dieses Diagramm zeigt die Analyse von über 23.000 Chloroplasten sowie mehrerer hundert Zellen aus einem einzelnen Blatt von 21 verschiedenen Pflanzen. Die durchschnittliche Stromelfrequenz während des Tages betrug 20,8 ± 1,8 Prozent und die durchschnittliche nächtliche Stromelfrequenz betrug 12,8 ± 0,9 Prozent, was auf eine signifikant höhere Frequenz am Tag hinweist, wie durch den Welch-T-Test ermittelt wurde. In dieser Abbildung wurden Chloroplasten-Stromel in vitro beobachtet, nachdem sie aus N. benthamiana, die plastid-targetiertes GFP exprimieren, isoliert worden waren, oder nach Färbung der Chloroplasten aus N. benthamiana oder Spinachia oleracea mit CFDA. Bei der Live-Cell-Bildgebung von Stromeln ist es wichtig, schnell zu arbeiten und das Pflanzengewebe so wenig wie möglich zu manipulieren.Nach dieser Methode können andere Verfahren wie die Gen-Silenzierung oder chemische Behandlungen angewendet werden, um weitere molekulare Akteure oder Signalwege, die an der Bildung und Funktion von Stromuli beteiligt sind, zu identifizieren. Diese Technik wurde von Forschern der Pflanzenzellenbiologie und Pflanzenimmunität genutzt, um die Rolle von Stromuli in zellulären Signalwegen und die Reaktionen von Pflanzen auf Krankheitserreger zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Stromuli-Frequenz in einem Blatt berechnet wird und wie Stromuli in isolierten Chloroplasten beobachtet werden können.Beachten Sie, dass die Laser und die elektrische Spannung, die ein konfokales Rasterelektronenmikroskop versorgen, äußerst gefährlich sein können, und es wichtig ist, die Systemanforderungen für die Verwendung dieses Geräts zu verstehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Quelle: Schlimpert, S. et al. Fluoreszenz-Zeitraffer-Bildgebung des kompletten Lebenszyklus von S. venezuelae mit einem mikrofluidischen Gerät. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Fluoreszenz-Zeitraffer-Bildgebung des gesamten Lebenszyklus des Bakteriums Streptomyces venezuelae mit einem mikrofluidischen Gerät, um die Keimung, das Hyphenwachstum und die Sporulation in Echtzeit zu visualisieren.

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