Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der lebendzellulären konfokalen Fluoreszenzmikroskopie die Häufigkeit von Stromulen in Blättern sichtbar zu machen und zu bestimmen sowie Stromulen in vitro mittels aus Blättern isolierter Chloroplasten zu visualisieren. Diese experimentellen Methoden können helfen, zentrale Fragen der Pflanzenzellenbiologie und der Chloroplastenforschung zu beantworten, indem sie aufklären, wie Stromulen funktionieren. Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt darin, dass sie reproduzierbare und robuste Daten liefern, selbst für diese hochdynamischen Chloroplastenstrukturen.

Wir hatten die Idee für die Studie zur Chloroplastenisolierung, weil einige Untersuchungen darauf hindeuteten, dass die Bildung von Stromula zytosolische Strukturen wie das Cytoskelett erforderten. Daher beschlossen wir, die Zelle zu homogenisieren und zu untersuchen, ob Stromula weiterhin gebildet werden könnten. Um Blattproben vorzubereiten, schneiden Sie zunächst mit einer sehr scharfen Rasierklinge einen kleinen Abschnitt eines Nicotiana benthamiana-Blattes ab.

Unmittelbar nach dem Abschneiden des Blattstücks dieses in eine mit Wasser gefüllte Fünf-Milliliter-Spritze eintauchen. Anschließend die Luft aus der Spritze entfernen und ein Vakuum erzeugen, indem die Öffnung der Spritze mit einem Finger verschlossen und der Kolben zurückgezogen wird. Den Kolben vorsichtig loslassen, um das Blattstück nicht zu beschädigen.

Wiederholen Sie dann das Entfernen der Luft zwei- oder dreimal, oder bis die Luft vollständig entfernt ist und das Blatt dunkelgrün erscheint. Geben Sie einen Tropfen Wasser auf einen Objektträger und legen Sie das Blattstück auf den Tropfen. Geben Sie anschließend einen weiteren Tropfen Wasser auf das Blattstück und setzen Sie ein Deckglas auf.

Wenn Luftblasen vorhanden sind, klopfen Sie vorsichtig auf die Deckglasabdeckung, bis sie entfernt sind. Fokussieren Sie mit durchgehendem Licht und einem 20x-Objektiv auf ein Blickfeld nahe der Mitte des Blattschnitts, wobei mehrere Chloroplasten gleichzeitig sichtbar werden. Speichern Sie ein Bild mit durchgehendem Licht, sodass Zelltypen gegebenenfalls später unterschieden werden können.

Wechseln Sie dann zur Laserbeleuchtung mit den geeigneten Anregungs- und Emissionsfiltern für den verwendeten Fluorophor und speichern Sie ein weiteres Bild. Wählen Sie im Mikroskop-Software die GFP-Kanal aus und klicken Sie, um die Lochblende auf eine Airy-Einheit einzustellen. Wählen Sie den Laserscan, um die Probe zu visualisieren, und klicken Sie dann auf den GFP-Kanal und die Detektorverstärkung, um die Laserleistung zu minimieren, während die Stromule dennoch klar sichtbar bleiben.

Bereiten Sie als Nächstes ein Z-Stapel-Experiment vor, das die Reihe von Bildern durch das Blatt-Epidermis im Sichtfeld aufnimmt. Passen Sie die Scangeschwindigkeit und Bildauflösung entsprechend an, um sicherzustellen, dass der Z-Stapel schnell erfasst wird. Speichern Sie anschließend den Z-Stapel für die spätere Analyse.

Verwenden Sie ImageJ, um den Z-Stack mit der maximalen Intensität in der Software zu einer einzigen Aufnahme zusammenzuführen. Identifizieren Sie anschließend alle Chloroplasten in der Aufnahme und zählen Sie sie manuell. Bestimmen Sie für jeden Chloroplasten visuell, ob ein oder mehrere Stromuli im zusammengeführten Z-Stack-Bild vom Chloroplasten ausgehen.

Um intakte Chloroplasten zu gewinnen, bereiten Sie einen kalten Extraktionspuffer mit den folgenden Reagenzien vor. Anschließend stellen Sie mit NaOH und HCl den pH-Wert auf 6,9 ein und kühlen den Puffer vor der Verwendung. Bereiten Sie den Isolationspuffer vor und stellen Sie den pH-Wert auf 7,6 ein.

Wenn die Blätter keinen genetisch codierten Stromofluorophor exprimieren, bereiten Sie eine Carboxyfluorescein-diacetat- oder CFDA-Lösung vor. Um Chloroplasten zu isolieren, entfernen Sie etwa 5 bis 10 Gramm Blätter von mehreren Pflanzen und spülen Sie sie kurz mit kaltem Wasser ab. Überführen Sie die Blätter anschließend unverzüglich in 50 Milliliter kalte Extraktionspufferlösung.

Zerkleinern Sie die Blätter mithilfe eines Mixers mit mehreren kurzen Impulsen und filtrieren Sie die Mischung anschließend durch zwei bis drei Lagen Mullbinde, um Blatttrümmer zu entfernen. Geben Sie das extrahierte Chloroplastenmaterial auf zwei 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf und zentrifugieren Sie eine Minute bei 750 × g. Entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie 10 Milliliter Isolierungspuffer, um die grünen Chloroplasten erneut aufzuschwemmen.

Anschließend erneut eine Minute bei 750 × g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und die Chloroplasten mit Isolationspuffer bis zu einem Endvolumen von fünf Millilitern resuspendieren. Falls die Chloroplasten von transgenen Pflanzen stammen, die plastidengesteuerte fluoreszierende Proteine exprimieren, 20 Mikroliter der Chloroplasten auf einen Objektträger überführen und einen Deckglaser hinzufügen. Danach die Mikroskopie durchführen.

Um Chloroplasten von Pflanzen zu färben, die keine plastidzielgerichteten fluoreszierenden Proteine exprimieren, geben Sie fünf Mikroliter einer 50 Millimolar CFDA-Stammlösung zu den fünf Milliliter Chloroplasten in Isolationspuffer hinzu. Nach einer fünfminütigen Inkubationszeit überführen Sie eine kleine Aliquotprobe auf einen Objektträger, setzen ein Deckglas auf und führen die Mikroskopie durch. Abschließend visualisieren Sie mehrere Chloroplasten gleichzeitig mithilfe eines FITC- oder GFP-Filter-Sets und eines 20x-Objektivs.

Oder ein Objektiv mit höherer Vergrößerung, um einen einzelnen, isolierten Chloroplasten sichtbar zu machen. Hier ist ein zusammengefügter Stapel dargestellt, der die GFP-Stomulen-Frequenz im Kollodium junger N. benthamiana-Sämlinge zeigt. In diesem Panel wurde das Bild entsättigt und invertiert, sodass das Stroma schwarz erscheint.

Die Chloroplasten wurden entweder als ohne Stromule oder mit mindestens einer Stromula gekennzeichnet. Von den 87 sichtbaren epidermalen Chloroplasten besaßen 33 Stromula, was einer Häufigkeit von 37,9 Prozent in diesem Blatt entspricht. Dieses Diagramm zeigt die Analyse von über 23.000 Chloroplasten sowie mehrerer hundert Zellen aus einem einzelnen Blatt von 21 verschiedenen Pflanzen.

Die durchschnittliche Stromelfrequenz während des Tages betrug 20,8 ± 1,8 Prozent und die durchschnittliche nächtliche Stromelfrequenz betrug 12,8 ± 0,9 Prozent, was auf eine signifikant höhere Frequenz am Tag hinweist, wie durch den Welch-T-Test ermittelt wurde. In dieser Abbildung wurden Chloroplasten-Stromel in vitro beobachtet, nachdem sie aus N. benthamiana, die plastid-targetiertes GFP exprimieren, isoliert worden waren, oder nach Färbung der Chloroplasten aus N. benthamiana oder Spinachia oleracea mit CFDA. Bei der Live-Cell-Bildgebung von Stromeln ist es wichtig, schnell zu arbeiten und das Pflanzengewebe so wenig wie möglich zu manipulieren.

Nach dieser Methode können andere Verfahren wie die Gen-Silenzierung oder chemische Behandlungen angewendet werden, um weitere molekulare Akteure oder Signalwege, die an der Bildung und Funktion von Stromuli beteiligt sind, zu identifizieren. Diese Technik wurde von Forschern der Pflanzenzellenbiologie und Pflanzenimmunität genutzt, um die Rolle von Stromuli in zellulären Signalwegen und die Reaktionen von Pflanzen auf Krankheitserreger zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Stromuli-Frequenz in einem Blatt berechnet wird und wie Stromuli in isolierten Chloroplasten beobachtet werden können.

Beachten Sie, dass die Laser und die elektrische Spannung, die ein konfokales Rasterelektronenmikroskop versorgen, äußerst gefährlich sein können, und es wichtig ist, die Systemanforderungen für die Verwendung dieses Geräts zu verstehen.