Quadruple Immunfärbung der olfaktorischen Glühbirne zur Visualisierung von olfaktorischen sensorischen Axon Molecular Identity Codes

Das übergeordnete Ziel dieser immunhistochemischen Färbemethode ist es, die kombinierte Expression von Axonsortiermolekülen an den Axonenden olfaktorischer sensorischer Neuronen sichtbar zu machen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselprozesse im Bereich der olfaktorischen Entwicklung zu charakterisieren, wie z. B. die Axonführung, die Synapsenbildung und die Regeneration olfaktorischer sensorischer Neuronen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es den Wissenschaftlern ermöglicht, die Expressionsmuster von Axonsortiermolekülen im Riechkolben zu vergleichen und zu analysieren, ohne dass es zu Schwankungen zwischen den Abschnitten kommt.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der Einbettungsschritt schwer zu erlernen ist, da die Position und der Winkel der olfaktorischen Gewebeprobe in der Form schwer mit Worten zu beschreiben sind. Beginnen Sie mit Köpfen von Mäusen im Alter von ein bis zwei Wochen, die durch intrakardiale Perfusion von 4 % Paraformaldehyd fixiert wurden. Führen Sie eine Scherenklinge in den Raum zwischen den oberen und unteren Zähnen ein und schneiden Sie horizontal, um den Unterkieferknochen zu entfernen.

Schneiden Sie dann überschüssiges Gewebe mit Pinzette und Schere ab, um das Riechgewebe einschließlich des Riechkolbens und des Riechepithels zu erhalten. Tauchen Sie das olfaktorische Gewebe in PBS ein, um Luft in der Nasenhöhle zu entfernen, führen Sie dann einen vertikalen Schnitt durch, um den hinteren Teil des Gehirns zu entfernen, und legen Sie das olfaktorische Gewebe mit dem abgeschnittenen Ende nach unten auf den Boden einer Einbettungsform. Füllen Sie die Form mit der Flüssigkeit für die optimale Schnitttemperatur und tauchen Sie sie dann in flüssigen Stickstoff.

Nachdem das Gewebe und das OCT vollständig eingefroren sind, äquilibrieren Sie das Gewebe im Kryostaten bei 20 Grad Celsius für eine Stunde. Machen Sie nun mit dem Kryostaten serielle parasaggitale Schnitte des Riechkolbens und sammeln Sie sie, indem Sie sie auf MAS-beschichtete Objektträger kleben. Trocknen Sie die Objektträger nach dem Verkleben sofort mit einem Fön.

Beginnen Sie mit der Immunfärbung, indem Sie die getrockneten Objektträger fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS waschen. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen, indem Sie die Objektträger eine Stunde lang mit 5%iger Blockierungslösung bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie dann 400 Mikroliter eines Cocktails aus Primärantikörpern, verdünnt in 1%-Blockierungslösung, zu jedem Objektträger.

Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag verwerfen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur mit PBST. Geben Sie dann 400 Mikroliter eines Cocktails aus Sekundärantikörpern und PBS zu jedem Objektträger.

Vor Licht schützen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation verwerfen Sie die Lösung und waschen Sie die Objektträger erneut dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS bei Raumtemperatur. Montieren Sie abschließend Deckgläser auf den Objektträgern, indem Sie zwei Tropfen Eindeckmedium auf jede Folie auftragen, das Deckglas platzieren und Luftblasen entfernen.

Erhalten Sie Fluoreszenzbilder mit dem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des entsprechenden Filters für jeden Fluorophor. Passen Sie die Belichtungszeit an, um fluoreszierende Signale des Bildes ohne Sättigung zu erhalten. Definieren Sie die glomeruläre Struktur durch Immunfluoreszenzsignale von GLUT2.

Verwenden Sie Bild J, um die Färbeintensität von Axonsortiermolekülen in Glomeruli zu messen. Dieses Bild zeigt einen parasaggitalen Riechkolbenschnitt von einer zwei Wochen alten Maus, die mit Antikörpern gegen VGLUT2 immungefärbt wurde, Kirrel2 in rot, Semaphorin 7A in grün und OLPC in blau. Das zusammengefügte Bild zeigt, dass die Axonsortiermoleküle, die an der glomerulären Segregation beteiligt sind, in einem positionsunabhängigen Mosaikmuster exprimiert werden.

Jeder Glomerulus wird durch Fluoreszenzsignale des präsynaptischen Markers VGLUT2 definiert. Die glomerulären Strukturen sind von gestrichelten Linien umgeben. Die Signalintensitäten der axonsortierenden Moleküle wurden in jedem Glomerulus gemessen.

Wie hier zu sehen ist, werden Axonsortiermoleküle in jedem Glomerulus unterschiedlich exprimiert. Zum Beispiel hat Glomerulus 3 hohe OLPC-Werte, mittlere Spiegel von Semaphorin 7A und niedrigere Spiegel von Kirrel2, und dieser Unterschied kann durch Messung der Färbeintensität quantifiziert werden. Während Glomerulus 4 einen hohen OLPC-Spiegel und einen niedrigeren Spiegel von Kirrel2 und Semaphorin 7A aufweist.

Auch dieser Unterschied kann durch Messung der Färbeintensität quantifiziert werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Nachfixierung mit PFA und die Behandlung mit Saccharoselösung, die normalerweise empfohlen werden, zu unterlassen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mehr Glomeruli auf dem einzelnen Riechkolbenabschnitt platzieren und wie Sie eine qualitativ hochwertige Immunfärbung mit mehreren Antikörpern durchführen, die auf andere Gehirnbereiche angewendet werden können.

Vergessen Sie nicht zu hoffen, dass diese Methode Ihnen helfen wird, Ihre zukünftigen Experimente erfolgreich durchzuführen.