Quadruple Immunfärbung der olfaktorischen Glühbirne zur Visualisierung von olfaktorischen sensorischen Axon Molecular Identity Codes
5. Juni 2017
Olfaktorische sensorische Neuronen exprimieren eine Vielzahl von Axon-sortierenden Molekülen, um eine korrekte neuronale Schaltung zu etablieren. Dieses Protokoll beschreibt eine immunhistochemische Färbemethode, um kombinatorische Ausdrücke von Axon-sortierenden Molekülen an den Axon-Termini von olfaktorischen sensorischen Neuronen zu visualisieren.
Das übergeordnete Ziel dieser immunhistochemischen Färbemethode ist es, die kombinierte Expression von Axonsortiermolekülen an den Axonenden olfaktorischer sensorischer Neuronen sichtbar zu machen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselprozesse im Bereich der olfaktorischen Entwicklung zu charakterisieren, wie z. B. die Axonführung, die Synapsenbildung und die Regeneration olfaktorischer sensorischer Neuronen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es den Wissenschaftlern ermöglicht, die Expressionsmuster von Axonsortiermolekülen im Riechkolben zu vergleichen und zu analysieren, ohne dass es zu Schwankungen zwischen den Abschnitten kommt.
Dievisuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der Einbettungsschritt schwer zu erlernen ist, da die Position und der Winkel der olfaktorischen Gewebeprobe in der Form schwer mit Worten zu beschreiben sind. Beginnen Sie mit Köpfen von Mäusen im Alter von ein bis zwei Wochen, die durch intrakardiale Perfusion von 4 % Paraformaldehyd fixiert wurden. Führen Sie eine Scherenklinge in den Raum zwischen den oberen und unteren Zähnen ein und schneiden Sie horizontal, um den Unterkieferknochen zu entfernen.
Schneiden Sie dann überschüssiges Gewebe mit Pinzette und Schere ab, um das Riechgewebe einschließlich des Riechkolbens und des Riechepithels zu erhalten. Tauchen Sie das olfaktorische Gewebe in PBS ein, um Luft in der Nasenhöhle zu entfernen, führen Sie dann einen vertikalen Schnitt durch, um den hinteren Teil des Gehirns zu entfernen, und legen Sie das olfaktorische Gewebe mit dem abgeschnittenen Ende nach unten auf den Boden einer Einbettungsform. Füllen Sie die Form mit der Flüssigkeit für die optimale Schnitttemperatur und tauchen Sie sie dann in flüssigen Stickstoff.
Nachdem das Gewebe und das OCT vollständig eingefroren sind, äquilibrieren Sie das Gewebe im Kryostaten bei 20 Grad Celsius für eine Stunde. Machen Sie nun mit dem Kryostaten serielle parasaggitale Schnitte des Riechkolbens und sammeln Sie sie, indem Sie sie auf MAS-beschichtete Objektträger kleben. Trocknen Sie die Objektträger nach dem Verkleben sofort mit einem Fön.
Beginnen Sie mit der Immunfärbung, indem Sie die getrockneten Objektträger fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS waschen. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen, indem Sie die Objektträger eine Stunde lang mit 5%iger Blockierungslösung bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie dann 400 Mikroliter eines Cocktails aus Primärantikörpern, verdünnt in 1%-Blockierungslösung, zu jedem Objektträger.
Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag verwerfen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur mit PBST. Geben Sie dann 400 Mikroliter eines Cocktails aus Sekundärantikörpern und PBS zu jedem Objektträger.
Vor Licht schützen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation verwerfen Sie die Lösung und waschen Sie die Objektträger erneut dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS bei Raumtemperatur. Montieren Sie abschließend Deckgläser auf den Objektträgern, indem Sie zwei Tropfen Eindeckmedium auf jede Folie auftragen, das Deckglas platzieren und Luftblasen entfernen.
Erhalten Sie Fluoreszenzbilder mit dem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des entsprechenden Filters für jeden Fluorophor. Passen Sie die Belichtungszeit an, um fluoreszierende Signale des Bildes ohne Sättigung zu erhalten. Definieren Sie die glomeruläre Struktur durch Immunfluoreszenzsignale von GLUT2.
Verwenden Sie Bild J, um die Färbeintensität von Axonsortiermolekülen in Glomeruli zu messen. Dieses Bild zeigt einen parasaggitalen Riechkolbenschnitt von einer zwei Wochen alten Maus, die mit Antikörpern gegen VGLUT2 immungefärbt wurde, Kirrel2 in rot, Semaphorin 7A in grün und OLPC in blau. Das zusammengefügte Bild zeigt, dass die Axonsortiermoleküle, die an der glomerulären Segregation beteiligt sind, in einem positionsunabhängigen Mosaikmuster exprimiert werden.
Jeder Glomerulus wird durch Fluoreszenzsignale des präsynaptischen Markers VGLUT2 definiert. Die glomerulären Strukturen sind von gestrichelten Linien umgeben. Die Signalintensitäten der axonsortierenden Moleküle wurden in jedem Glomerulus gemessen.
Wie hier zu sehen ist, werden Axonsortiermoleküle in jedem Glomerulus unterschiedlich exprimiert. Zum Beispiel hat Glomerulus 3 hohe OLPC-Werte, mittlere Spiegel von Semaphorin 7A und niedrigere Spiegel von Kirrel2, und dieser Unterschied kann durch Messung der Färbeintensität quantifiziert werden. Während Glomerulus 4 einen hohen OLPC-Spiegel und einen niedrigeren Spiegel von Kirrel2 und Semaphorin 7A aufweist.
Auch dieser Unterschied kann durch Messung der Färbeintensität quantifiziert werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Nachfixierung mit PFA und die Behandlung mit Saccharoselösung, die normalerweise empfohlen werden, zu unterlassen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mehr Glomeruli auf dem einzelnen Riechkolbenabschnitt platzieren und wie Sie eine qualitativ hochwertige Immunfärbung mit mehreren Antikörpern durchführen, die auf andere Gehirnbereiche angewendet werden können.
Vergessen Sie nicht zu hoffen, dass diese Methode Ihnen helfen wird, Ihre zukünftigen Experimente erfolgreich durchzuführen.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt eine immunhistochemische Färbemethode zur Visualisierung der Expression von Axon-Sortiermolekülen an den Axon-Enden olfaktorischer sensorischer Neuronen. Diese Technik ist entscheidend für das Verständnis olfaktorischer Entwicklungsprozesse wie Axon-Leitung und Synapsenbildung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Olfaktorische Entwicklung
- Immunhistochemie
Hintergrund
- Olfaktorische sensorische Neuronen spielen eine Schlüsselrolle im Geruchssinn.
- Axon-Sortiermoleküle sind für die Etablierung korrekter neuronaler Schaltkreise unerlässlich.
- Das Verständnis ihrer Expressionsmuster kann Einblicke in die Funktionen des olfaktorischen Systems liefern.
- Die Visualisierung dieser Expressionen kann bei der Untersuchung von Regenerationsprozessen in olfaktorischen sensorischen Neuronen helfen.
Zweck der Studie
- Visualisierung der kombinierten Expression von Axon-Sortiermolekülen.
- Charakterisierung wichtiger Prozesse in der olfaktorischen Entwicklung.
- Erleichterung des Vergleichs von Expressionsmustern in der Bulbus olfactorius.
Verwendete Methoden
- Immunhistochemische Färbetechnik.
- Verwendung von Mäusen im Alter von ein bis zwei Wochen.
- Intrakardiale Perfusion mit 4% Paraformaldehyd zur Fixierung.
- Einbettung und Schnittführung von olfaktorischen Gewebeproben.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Expression von Axon-Sortiermolekülen.
- Gezeigte Fähigkeit, Expressionsmuster ohne Schnittvariation zu analysieren.
- Bietet eine klare Methode zur Einbettung olfaktorischer Gewebe.
- Hervorhebung der Bedeutung visueller Demonstrationen für das Erlernen der Technik.
Schlussfolgerungen
- Die immunhistochemische Methode ist effektiv für die Untersuchung olfaktorischer sensorischer Neuronen.
- Das Verständnis von Axon-Sortiermolekülen kann das Wissen über die Entwicklung des olfaktorischen Systems erweitern.
- Diese Technik kann ein wertvolles Werkzeug für zukünftige Forschungen zur olfaktorischen Regeneration sein.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This method enables precise molecular mapping of axon-sorting molecules in the olfactory bulb, supporting target validation in neurodevelopmental research. By allowing quantitative comparison of protein expression patterns across glomeruli without section-to-section variability, it enhances predictive confidence in mechanistic studies of neural circuit formation. The approach provides a scalable, reproducible platform for de-risking hypotheses related to axon guidance and synaptic specificity in preclinical discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of molecular identity codes at axon termini to clarify target engagement mechanisms in olfactory sensory neuron development.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating axon-sorting molecule expression with glomerular organization patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing standardized immunostaining protocols for multiplex protein detection.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent glomerular definition using VGLUT2 as a presynaptic marker.
- Strategic Value: Highlights screening readiness via quantitative intensity measurements that enable reliable comparison of molecular expression across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking axon-sorting molecule codes to neural circuit formation processes applicable to neurodegenerative models.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal analysis of axonal regeneration and reinnervation patterns.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing molecular resolution of axon guidance mechanisms critical for neurotherapeutic development.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing of OR-specific axon guidance through combinatorial molecular code visualization at axon termini.
- Screening: Describes assay readiness through standardized section collection and immunostaining that minimizes technical variation across samples.
- Analytics: Highlights quantitative readouts from ImageJ-based intensity measurements that enable statistical comparison of axon-sorting molecule expression across glomeruli.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling analysis of olfactory regeneration processes relevant to injury models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for multiplex protein profiling in other brain regions beyond the olfactory system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct visualization of molecular determinants of axonal segregation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via consistent tissue embedding and sectioning protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neural pathway models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative biomarker-like readouts of axon-sorting molecule co-expression patterns.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in immunohistochemistry, cryosectioning, and fluorescent microscopy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including cryostat, fluorescence microscope, and image analysis software.
- Cross-team standardization requirements for antibody validation and staining protocol consistency.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for tissues with different embedding properties.
- Practical limitations include the technical challenge of tissue orientation in embedding molds, which requires hands-on training to master.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
5:42
Conclusion
4:26
Results: Quantification of Axon-sorting Molecules in the Olfactory Bulb
1:11
Preparation of Parasagittal Olfactory Bulb Sections
2:33
Day 1: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:07
Day 2: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:56
The Use of Fluorescence Intensity Measurements
