Quadruple Immunfärbung der olfaktorischen Glühbirne zur Visualisierung von olfaktorischen sensorischen Axon Molecular Identity Codes
5. Juni 2017
Olfaktorische sensorische Neuronen exprimieren eine Vielzahl von Axon-sortierenden Molekülen, um eine korrekte neuronale Schaltung zu etablieren. Dieses Protokoll beschreibt eine immunhistochemische Färbemethode, um kombinatorische Ausdrücke von Axon-sortierenden Molekülen an den Axon-Termini von olfaktorischen sensorischen Neuronen zu visualisieren.
Das übergeordnete Ziel dieser immunhistochemischen Färbungsmethode besteht darin, die kombinierte Expression von Axonsortiermolekülen an den Axonendigungen olfaktorischer Sinnesneuronen sichtbar zu machen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Prozesse im Bereich der olfaktorischen Entwicklung zu charakterisieren, wie beispielsweise die Axonführung, die Bildung von Synapsen und die Regeneration olfaktorischer Sinnesneuronen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie es Wissenschaftlern ermöglicht, Expressionsmuster von Axonsortiermolekülen im Riechkolben zu vergleichen und zu analysieren, ohne dass Variationen zwischen den Schnitten auftreten.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da der Einbettungsschritt schwer zu erlernen ist, weil die Position und der Winkel der Riechgewebeprobe in der Form schwer in Worte zu fassen sind. Beginnen Sie mit den Köpfen von Mäusen im Alter von einer bis zwei Wochen, die durch intrakardiale Perfusion mit 4 % Paraformaldehyd fixiert wurden. Führen Sie eine Schere zwischen den oberen und unteren Zähnen ein und schneiden Sie horizontal, um den Unterkiefer zu entfernen.
Entfernen Sie anschließend mit Pinzette und Schere überschüssiges Gewebe, sodass das Riechgewebe einschließlich Bulbus olfactorius und Epithelium olfactorium erhalten bleibt. Tauchen Sie das Riechgewebe in PBS, um Luft aus der Nasenhöhle zu entfernen, führen Sie dann einen vertikalen Schnitt durch, um den hinteren Teil des Gehirns zu entfernen, und legen Sie das Riechgewebe mit der Schnittfläche nach unten auf den Boden einer Einbettform. Füllen Sie die Form mit Schnitttemperatur-Optimum-Verbindung (OCT) auf und tauchen Sie sie anschließend in flüssigen Stickstoff ein.
Nachdem das Gewebe und OCT vollständig eingefroren sind, akklimatisieren Sie das Gewebe im Kryostaten bei 20 Grad Celsius für eine Stunde. Erstellen Sie nun serielle parasagittale Schnitte der Riechwurzel mit dem Kryostaten und sammeln Sie diese, indem Sie sie auf MAS-beschichteten Objektträgern aufbringen. Trocknen Sie die Objektträger unmittelbar nach dem Aufbringen mit einem Föhn.
Beginnen Sie die Immunfärbung, indem Sie die getrockneten Objektträger fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS waschen. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen, indem Sie die Objektträger eine Stunde lang mit 5 % Blockierungslösung bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie anschließend 400 µL einer Cocktaillösung aus primären Antikörpern, die in 1 % Blockierungslösung verdünnt wurden, auf jeden Objektträger.
Die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Am nächsten Tag die primäre Antikörperlösung verwerfen und die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBST bei Raumtemperatur waschen. Anschließend 400 Mikroliter einer Mischung aus sekundären Antikörpern und PBS zu jedem Objektträger geben.
Vor Licht schützen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation die Lösung verwerfen und die Objektträger anschließend dreimal je fünf Minuten mit PBS bei Raumtemperatur waschen. Zum Schluss Deckgläser auf die Objektträger aufbringen, indem zwei Tropfen Eindeckmedium auf jeden Objektträger gegeben werden, das Deckglas platziert wird und Luftblasen entfernt werden.
Erlangen Sie fluoreszierende Bilder mit dem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des geeigneten Filters für jeden Fluorophor. Passen Sie die Belichtungszeit an, um fluoreszierende Signale des Bildes ohne Sättigung zu erhalten. Definieren Sie die glomeruläre Struktur anhand der immunfluoreszierenden Signale von GLUT2.
Verwenden Sie ImageJ, um die Färbungsintensitäten von Axonsortiermolekülen innerhalb der Glomeruli zu messen. Dieses Bild zeigt einen parasagittalen Schnitt durch die Riechbülbe einer zweiwöchigen Maus, die mit Antikörpern gegen VGLUT2, Kirrel2 in Rot, Semaphorin 7A in Grün und OLPC in Blau immungefärbt wurde. Das überlagerte Bild zeigt, dass die an der Glomerulartrennung beteiligten Axonsortiermoleküle in einem positionsunabhängigen Muster angeordnet sind.
Jeder Glomerulus wird durch fluoreszierende Signale des präsynaptischen Markers VGLUT2 definiert. Die glomerulären Strukturen sind von gestrichelten Linien umgeben. Die Signalintensitäten von Axon-sortierenden Molekülen wurden in jedem Glomerulus gemessen.
Wie hier zu sehen ist, werden Axonsortiermoleküle in jedem Glomerulum unterschiedlich exprimiert. Beispielsweise weist Glomerulum 3 hohe Konzentrationen von OLPC, intermediäre Konzentrationen von Semaphorin 7A und geringere Konzentrationen von Kirrel2 auf, und dieser Unterschied kann durch die Messung der Färbungsintensität quantifiziert werden. Glomerulum 4 hingegen weist hohe Konzentrationen von OLPC sowie geringere Konzentrationen von Kirrel2 und Semaphorin 7A auf.
Auch dieser Unterschied kann durch die Messung der Färbungsintensität quantifiziert werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, die Nachfixierung mit PFA sowie die Behandlung mit Saccharoselösung wegzulassen, die normalerweise empfohlen werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mehr Glomeruli auf einem einzelnen Schnitt des Riechkolbens plaziert und wie man hochwertige Immunfärbungen mit mehreren Antikörpern durchführt, die auch auf andere Hirnareale angewendet werden können.
Vergessen Sie nicht zu hoffen, diese Methode wird Ihnen helfen, in Ihren zukünftigen Experimenten erfolgreich zu sein.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine immunhistochemische Färbungsmethode, um die Expression von Axon-sortierenden Molekülen an den Axonendigungen olfaktorischer Sinnesneuronen sichtbar zu machen. Diese Technik ist entscheidend für das Verständnis von Entwicklungsprozessen des Geruchssinns, wie der Axonführung und der Synapsenbildung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Riechentwicklung
- Immunhistochemie
Hintergrund
- Olfaktorische Sinnesneuronen spielen eine Schlüsselrolle beim Geruchssinn.
- Axon-sortierende Moleküle sind entscheidend für die Ausbildung einer korrekten neuronalen Verschaltung.
- Das Verständnis ihrer Expressionsmuster kann Einblicke in die Funktionen des olfaktorischen Systems liefern.
- Die Visualisierung dieser Expressionen kann bei der Untersuchung von Regenerationsprozessen in olfaktorischen Sinnesneuronen helfen.
Zweck der Studie
- Um die kombinierte Expression von Axon-sortierenden Molekülen zu visualisieren.
- Um Schlüsselprozesse in der Entwicklung des Geruchssystems zu charakterisieren.
- Um den Vergleich von Expressionsmustern im Riechkolben zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Immunhistochemische Färbetechnik.
- Verwendung von Mäuseköpfen im Alter von einer bis zwei Wochen.
- Intrakardiale Perfusion mit 4 % Paraformaldehyd zur Fixierung.
- Einbetten und Schneiden von Geruchsgewebeproben.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Expressionen von Axon-sortierenden Molekülen.
- Nachweis der Fähigkeit, Expressionsmuster ohne Schnittvarianz zu analysieren.
- Bereitstellung einer klaren Methode zur Einbettung von Riechgeweben.
- Hervorhebung der Bedeutung visueller Demonstrationen für das Erlernen der Technik.
Schlussfolgerungen
- Die immunhistochemische Methode eignet sich zur Untersuchung olfaktorischer Sinnesneuronen.
- Das Verständnis von Axon-Sortierungs-Molekülen kann das Wissen über die Entwicklung des Geruchssystems vertiefen.
- Diese Technik kann ein wertvolles Hilfsmittel für zukünftige Forschung zur olfaktorischen Regeneration sein.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine präzise molekulare Kartierung von Axonsortierungs-Molekülen im Riechkolben und unterstützt die Zielvalidierung in der neurodevelopmentalen Forschung. Durch die quantitative Vergleichbarkeit von Proteinexpressionsmustern über Glomeruli hinweg ohne Abschnitt-zu-Abschnitt-Variabilität erhöht sie das Vorhersagevertrauen in mechanistischen Studien zur Entstehung neuronaler Schaltkreise. Der Ansatz bietet eine skalierbare, reproduzierbare Plattform zur Risikominimierung von Hypothesen bezüglich Axonführung und synaptischer Spezifität in präklinischen Entdeckungsprozessen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung molekularer Identitätsmuster an Axonendigungen, um die Mechanismen der Zielstruktur-Anbindung bei der Entwicklung olfaktorischer Sinnesneuronen aufzuklären.
- Operativer Wert: Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch Korrelation des Expressionsmusters axonaler Sortiermoleküle mit den Organisationsmustern der Glomeruli.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Screening-Verfahren vor, indem standardisierte Immunfärbungsprotokolle für die multiplexe Proteindetektion etabliert werden.
- Operationaler Wert: Trägt zur Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays bei, indem die glomeruläre Definition mithilfe von VGLUT2 als präsynaptischem Marker konsistent erfolgt.
- Strategischer Wert: Unterstreicht die Eignung für Screening durch quantitative Intensitätsmessungen, die einen zuverlässigen Vergleich der molekularen Expression unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erläutert die Krankheitsrelevanz, indem molekulare Codes für Axonsortierung mit Prozessen der neuronalen Schaltkreisbildung verknüpft werden, die auf Modelle neurodegenerativer Erkrankungen anwendbar sind.
- Operationaler Wert: Beschreibt den Zusammenhang von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem eine Längsschnittanalyse von Mustern der axonalen Regeneration und Reinnervation ermöglicht wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Testung von Zielhypothesen bis hin zur Identifizierung von Wirkstoffkandidaten ein, indem sie eine molekulare Auflösung der für die neurotherapeutische Entwicklung entscheidenden Mechanismen der Axonführung bereitstellt.
- Entdeckungsbiologie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung zur rezeptorspezifischen Axonführung durch Visualisierung kombinatorischer molekularer Codes an Axonendigungen unterstützt.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays anhand standardisierter Schnittsammlung und Immunfärbung, die technische Variationen zwischen Proben minimieren.
- Analytik: Betont quantitative Auswertungen auf Basis von Intensitätsmessungen mit ImageJ, die statistische Vergleiche der Expression von Axonsortierungsmolekülen zwischen Glomeruli ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem sie die Analyse von Riechregenerationsprozessen ermöglicht, die für Verletzungsmodelle relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit für multiplexe Proteinprofilierungen in anderen Gehirnregionen jenseits des Riechsystems dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung durch direkte Visualisierung der molekularen Determinanten der axonalen Segregation.
- Operativer Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch konsistente Protokolle zur Gewebeeinbettung und -schnittführung.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung mechanistischer Unschärfen in Modellen neuronaler Bahnen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung anhand quantitativer, biomarkerähnlicher Messwerte für die Co-Expressionsmuster von Axon-sortierenden Molekülen.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in Immunhistochemie, Kryoschnittechnik und Fluoreszenzmikroskopie.
- Erforderliche instrumentelle und analytische Infrastruktur, einschließlich Kryostat, Fluoreszenzmikroskop und Bildanalyse-Software.
- Anforderungen an die Standardisierung zwischen Teams hinsichtlich der Antikörper-Validierung und der Konsistenz der Färbeprotokolle.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, insbesondere bei Geweben mit unterschiedlichen Einbettungseigenschaften.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die technische Herausforderung der Gewebeorientierung in Einbettungsformen, die eine praktische Schulung zur Beherrschung erfordert.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:05
Title
5:42
Conclusion
4:26
Results: Quantification of Axon-sorting Molecules in the Olfactory Bulb
1:11
Preparation of Parasagittal Olfactory Bulb Sections
2:33
Day 1: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:07
Day 2: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:56
The Use of Fluorescence Intensity Measurements
