Optimierung eines Multiplex-RNA-basierten Ausdruck-Assays mit Brust-Krebs-Archivmaterial

Diese Methode ist erfolgreich optimiert, um Brustkrebspatientinnen in bekannte und nicht bekannte Therapiegruppen einzuteilen. Die hohe Empfindlichkeit dieses Assays identifiziert heterogene Proben, die mittels Lasermikrodissektion weiter untersucht werden können. Der Hauptvorteil des RNA-basierten Multiplex-Assays ist die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mit Hämatoxylin- und Eosin-gefärbtem, formalinfixiertem, paraffineingebettetem Archivmaterial, das hochauflösende Ausgaben und die Validierung von Biomarkern ermöglicht.

Bereiten Sie das Tuch wie im Textprotokoll beschrieben vor. Um mit der Dissektion zu beginnen, stellen Sie die Objektträgergrenzen ein und kalibrieren Sie die Tischbewegung des Mikroskops. Scannen Sie nun die gefärbten Objektträger mit dem 4X-Objektiv

Wählen Sie die Zielbereiche für die Mikrodissektion auf dem Membranobjektträger aus und kreisen Sie sie ein. Behalten Sie den Überblick über die Gesamtfläche. Für eine adäquate Downstream-RNA-Analyse werden mindestens 42 Quadratmillimeter benötigt.

Starten Sie dann das Laserschneiden bei den definierten Parametern. Verwenden Sie als Nächstes den Kappen-Lift-Mechanismus, um den präparierten Abschnitt zu entnehmen, und setzen Sie den Abschnitt auf die Diffusorkappe eines beschrifteten Rohrs, das an einem mechanischen Anhängsel befestigt ist. Wenn der präparierte Schnitt nicht auf die Kappe übertragen werden kann, wiederholen Sie das Präparieren des Zielbereichs.

Die Genauigkeit der Mikrodissektion ist ein kritischer Schritt, und es sollte immer sichergestellt werden, dass der auf der Kappe vorhandene mikropräparierte Bereich mit dem markierten, gescannten Bild übereinstimmt. Entnehmen Sie so viele Gewebeschnitte wie gewünscht, jedes in einem separaten Röhrchen, und fahren Sie dann mit der Lyse der Gewebeproben fort. Für die Lyse tragen Sie 2,4 Mikroliter Homogenisierungslösung auf einen Quadratmillimeter Gewebefläche in jede Probe auf und wirbeln Sie die Proben dann 10 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit vortexen.

Als nächstes schleudern Sie die Proben fünf Sekunden lang bei 2.500 g herunter. Füllen Sie die Proben dann bei Bedarf in 1,5-Milliliter-Röhrchen um und legen Sie sie in einen Schüttelheizblock bei 65 Grad Celsius. Schütteln Sie sie bei 600 U/min für 12 bis 18 Stunden.

Dann zentrifugieren Sie die Lysate bei 21.000 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Sammeln Sie den klaren Überstand vorsichtig in einem neuen beschrifteten Röhrchen. Vermeiden Sie die Übertragung von Gewebefragmenten.

Die Überstände können bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Nachdem Sie alle Reagenzien für den Hybridisierungs-basierten Assay vorbereitet haben, laden Sie bis zu 90 Wells einer 96-Well-Platte zur magnetischen Trennung mit 25 Mikrolitern Gewebehomogenat. Laden Sie 25 Mikroliter Kontrollproben in drei dafür vorgesehene Vertiefungen und laden Sie eine 25-Mikroliter-Homogenisierungslösung in drei Vertiefungen als Blindproben.

Verschließen Sie dann die magnetische Trennplatte mit einem durchsichtigen Druckverschluss aus Kunststoff und legen Sie die Platte für 18 bis 22 Stunden unter Schütteln in einen 54 Grad Celsius heißen Inkubator. Montieren und verriegeln Sie die Platte am nächsten Tag an einer tragbaren magnetischen Plattenwaschmaschine, entfernen Sie dann die Druckdichtung und warten Sie eine Minute, bis sich die Magnetperlen gesetzt haben. Führen Sie nun eine Wäsche durch.

Lassen Sie die Platte über einem Waschbecken abtropfen und tupfen Sie sie mit einem Seidenpapier vorsichtig trocken, befüllen Sie dann alle Vertiefungen mit 100 Mikrolitern 1X Waschpuffer und warten Sie 15 Sekunden. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, um den Waschschritt abzuschließen. Nachdem Sie die letzte Wäsche entfernt haben, befüllen Sie die Vertiefungen erneut mit 50 Mikrolitern des Vorverstärkerreagenzes, versiegeln Sie die Platte mit einem Aluminiumplattenversiegeler und schütteln Sie die Platte eine Minute lang bei 800 U/min bei Raumtemperatur.

Schütteln Sie dann den Teller eine Stunde lang bei 50 Grad Celsius weiter. Wenn dies abgeschlossen ist, führen Sie einen weiteren Waschschritt durch. Befüllen Sie anschließend die Vertiefungen mit 50 Mikrolitern des Verstärkerreagenzes, versiegeln Sie die Platte mit einer Aluminiumplattendichtung und wiederholen Sie die Schüttelinkubation von einer Minute bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Stunde bei 50 Grad Celsius, gefolgt von einem weiteren Waschschritt.

Drehen Sie nun die Markierungssonde 10 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit vor und geben Sie dann 50 Mikroliter Markierungssonde in jede Vertiefung. Verschließen Sie dann die Platte wieder und wiederholen Sie die Schüttelinkubation wie zuvor, gefolgt von einem weiteren Waschschritt. Beladen Sie anschließend die Vertiefungen mit 50 Mikrolitern frisch gemischtem Streptavidin-Phycoerythrin und führen Sie dann eine Schüttelinkubation bei Raumtemperatur bei 600 U/min durch, gefolgt von einem Waschschritt mit Streptavidin-Waschpuffer.

Nach Abschluss des Waschschritts befüllen Sie jede Vertiefung mit 100 Mikrolitern Streptavidin-Waschpuffer und versiegeln Sie die Platte mit einer Aluminiumplattendichtung, dann schütteln Sie die Platte bei 800 U/min bei Raumtemperatur drei Minuten lang. Starten Sie während des letzten Inkubationsschritts den magnetischen Bead-Analysator und stellen Sie sicher, dass das Gerät kalibriert ist und Validierungsprotokolle durchgeführt wurden. Fügen Sie in der Software eine neue Analyse hinzu, indem Sie auf der Registerkarte Stapel die Option Batch mit einem vorhandenen Protokoll erstellen auswählen.

Kennzeichnen Sie anschließend im Plattenlayout die Vertiefungen als unbekannt oder leer, und geben Sie für jede Vertiefung im Feld Beispiel eine Beschriftung an. Entfernen Sie nun die Aluminiumdichtung von der Reaktionsplatte, werfen Sie die Plattenladerschale aus und legen Sie die Platte in den Analysator ein. Klicken Sie anschließend auf Zurückziehen und dann auf Batch ausführen, um den Analysator zu starten.

Werfen Sie nach dem Ablesen die Platte aus und reinigen Sie den magnetischen Bead-Analysator wie vom Hersteller empfohlen. Wechseln Sie zur Analyse auf die Registerkarte Chargenergebnisse. Wählen Sie die entsprechende Analysedatei aus und verwenden Sie die Option, sie als CSV-Datei zu exportieren, und erstellen Sie dann Durchschnittswerte und Rohergebnisse mit einer Tabellenkalkulationssoftware.

Stellen Sie sicher, dass die Bedienelemente die erwarteten Signale anzeigen. Normalisieren Sie die Probenrohdaten und analysieren Sie die Datenverteilung mithilfe einer Data-Science-Plattform oder unter Verwendung definierter Algorithmen, um eine Hauptkomponentenanalyse durchzuführen. Die Leistung des Multiplex-Bead-Readers und -Assays ist von entscheidender Bedeutung, und die Durchführung serieller Verdünnungen von gut annotierten Kontrollproben vor wertvollen Patientenproben gewährleistet korrekte Ergebnisse.

Wählen Sie als Attribute die Teilmenge der normalisierten Gendaten und eine nominale Variable aus, z. B. einen Brustkrebs-Subtyp. Wenden Sie einen trainierten und validierten Klassifizierungsalgorithmus an, um unbekannte Proben zu charakterisieren. Die beschriebene Methode wurde für die gleichzeitige Messung von 40 Transkripten in H&E-gefärbtem, mikrodissektioniertem, stark degradiertem FFPE-Material angewendet.

Mit dieser Methode ist es möglich, eine genaue Charakterisierung des Rezeptorstatus und der differentiellen Expression des mesenchymalen Markers FN1 beim Vergleich von Tumor- und gematchtem Kontrollgewebe in den verschiedenen rezeptorpositiven und -negativen Subtypen zu zeigen. Die Heterogenität innerhalb von Tumoren kann mit dieser Methode charakterisiert werden. Ein ER-positiver Tumor zeigt eine räumlich differentielle Expression von FN1 innerhalb von Bereichen, die eine ausgeprägte Tumormorphologie und mitotische Aktivität aufweisen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mehrere Gene direkt aus Gewebelysaten nach der Hybridisierung von Ziel-RNA zu Kügelchen, der Signalamplifikation und der Quantifizierung messen können. Die Assay-Empfindlichkeit ermöglicht die Verwendung von lasermikropräpariertem Material. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Gerät vor jedem Assay zu kalibrieren und den Sensitivitätsbereich mit Hilfe von Qualitätskontrollmaterial zu bestimmen, bevor wertvolle Patientenproben entnommen werden.

Der Assay-Workflow lässt sich leicht an klinische Labore anpassen. Die RNA-Profilierung von bis zu 90 Proben kann in 12 Stunden über zwei Tage durchgeführt werden. Die Messung des Brustkrebsrezeptorstatus in einem Pathologielabor ist zeitaufwändig und erfordert erfahrene Pathologen.

Mit diesem digitalisierten, Multiplex-Bead-basierten Assay wird die RNA-Expression genau quantifiziert. Die Analyse von fraktionierten Biomarkern in Biopsien in der Primärdiagnose ist eine Darstellung des Tumors. Die Verwendung dieser Methodik mit einem breiteren Biomarker-Panel und auch die Verwendung ganzer Abschnitte identifiziert heterogene Proben.

Die Entwicklung von Assays mit dieser Methodik ist vielseitig und erfordert einen geringen Probeneinsatz. Die Probe umfasst klinische, annotierte Proben, die für die Validierung von Biomarkern wichtig sind, sowie Flüssigbiopsien, die für die Patientenüberwachung und Frühdiagnose wichtig sind.