Dynamische Multiparameter-Bewertung der Thrombozytenfunktion mit einem kapazitiven Biosensor

Wir entwickeln einen Assay zur Bewertung der Thrombozytenfunktion in physiologischen Umgebungen, um die Einschränkungen der aktuellen Assays durch Aktivierung von Thrombozyten in einer halbstarren Mikroumgebung mit einem Membrankapazitätssensor zu beheben. Der Assay misst die Thrombozytenzahl, die Stimulationsstärke und die Aktivierungswege. Dieses Tool bietet einen umfassenden Ansatz zur Untersuchung der Thrombozytenmechanismen während der Blutstillung.

Unser Protokoll ist in der Lage, mehrere Parameter des Blutplättchens in einem einzigen Assay unter physiologischen Bedingungen zu bewerten. Wir werden uns auf die Verbesserung dieses Protokolls und die Entwicklung anderer Sensoren zur Blutstillungsbewertung konzentrieren. Beginnen Sie mit der Verwendung von Standard-CAD-Layoutsoftware, um das Layout des Teammembran-Kapazitätschips (MCC) für ein vier Zoll großes Siliziumwafersubstrat für den Mikrofabrikationsprozess zu entwerfen, wie im Manuskript beschrieben.

Für die Biofunktionalisierung reinigen Sie die Sensorelektrode des TMCC 45 Sekunden lang mit Sauerstoffplasma bei 100 Watt. Geben Sie eine Do Decanal-Lösung in 200 Proof Ethanol in die Probenvertiefung auf den TMCCs. Geben Sie die TMCCs in einen mit trockenem Stickstoff gefüllten Behälter.

Verschließen Sie den Behälter und wickeln Sie ihn 24 bis 48 Stunden lang mit Parafilm ein. Spülen Sie nach zwei Tagen die Goldoberfläche von TMCC mit entionisiertem Wasser und 200 Proof Ethanol ab. Trocknen Sie die TMCCs mit Stickstoffgas bei Raumtemperatur.

Geben Sie humane Fibronektinlösung in PBS in die Probenvertiefung von TMCC und inkubieren Sie sie zwei bis acht Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie für die Einrichtung des Kapazitätssensors ein LCR-Messgerät mit Mikropositionierern und Nadelsonden, um den elektrischen Kontakt mit dem Sensor herzustellen. Verwenden Sie 3D-gedruckte Kunststoffvorrichtungen, um das TMCC und BMCC sicher zu platzieren.

Stellen Sie sicher, dass die untere Halterung mit Stoppern auf der XY-Achse ausgestattet ist, um das TMCC genau über dem BMCC auszurichten und einen Kondensator zu bilden. Legen Sie ein sinusförmiges Signal von 0,5 Volt bei 100 Kilohertz mit einer Abtastrate von acht Hertz an. Um konzentriertes plättchenreiches Plasma (CPRP) zu erhalten, zentrifugieren Sie die menschlichen Blutproben.

Übertragen Sie das CPRP in einen sterilen Behälter und führen Sie die Thrombozytenzählung durch. Für Inhibitorstudien inkubieren Sie das CPRP mit einer vordefinierten Konzentration von Aspirin in Tyrode-Puffer. Für den Thrombozyten-Funktionstest montieren Sie TMCC und BMCC in den 3D-gedruckten Vorrichtungen.

Messen Sie fünf Minuten lang die Ausgangskapazität der assemblierten MCCs, geben Sie dann 45 Mikroliter CPRP in die Probenvertiefung im TMCC und warten Sie 30 Minuten, damit die Blutplättchen an der Fibronektin-beschichteten Elektrode im TMCC haften können. Entfernen Sie anschließend 30 Mikroliter CPRP aus der Probenvertiefung, ohne die anhaftenden Blutplättchen zu stören, und füllen Sie die Vertiefung mit Tyrode-Puffer auf. Nach dem letzten Waschen 10 Mikroliter der Agonistenlösung in der gewünschten Konzentration zugeben und die Probe 80 Minuten lang äquilibrieren.

Messen Sie die maximale Kapazitätsänderung nach 30 Minuten, um die Delta-C-Adhäsion zu bestimmen. Messen Sie für die Aktivierungsphase die maximale Kapazitätsänderung, die als Delta-C-Aktivierung bezeichnet wird. Berechnen Sie die Steigung der Kapazitätskurve zwischen 200 und 300 Sekunden nach der Aktivierung, um die S-Aktivierung zu bestimmen.

Führen Sie eine statistische Analyse durch, indem Sie die Varianzanalyse mit dem postoperativen Test von Tukey durchführen, um die Ergebnisse zwischen den Gruppen zu vergleichen. Verwenden Sie die Shapiro-Wilk-Anpassungsgüte, um die Normalverteilung zu testen. Eine CPRP-Lösung mit einer vorgegebenen Thrombozytenzahl zeigte eine lineare Abnahme der Kapazität während der Adhäsion.

Nach der Thrombinaktivierung wurde eine exponentielle Abnahme des Steady-State beobachtet. Die Delta-C-Adhäsionswerte zeigten eine starke Korrelation mit der Thrombozytenzahl über einen Bereich von Thrombozytenzahlen, mit einer signifikanten Verringerung bei einer Aspirinkonzentration von 1,3 Millimol. Die Rate der exponentiellen Abnahme der Kapazität nach der Thrombozytenstimulation nahm mit der Zellkonzentration zu.

Das Ausmaß des Kapazitätsverlusts nahm mit höheren Konzentrationen ebenfalls zu, was einen klaren Aufwärtstrend bei der Delta-C-Aktivierung zeigt. Ein ähnlicher Trend wurde bei der S-Aktivierung und der Thrombozytenzahl beobachtet. Mit zunehmender Aspirin-Dosierung zeigten die Kapazität, die Delta-C-Aktivierung und die S-Aktivierung abnehmende Trends.

Ein statistisch signifikanter Unterschied in der S-Aktivierung wurde zwischen hohen und mittleren Dosen beobachtet, während kein signifikanter Unterschied bei der Delta-C-Aktivierung festgestellt wurde. Kapazitätssignale für CPRP-Proben, die mit Thrombin aktiviert wurden, zeigten, dass die Kapazitätsreduktion mit zunehmender Thrombinkonzentration ausgeprägter wurde. Sowohl die Delta-C-Aktivierung als auch die S-Aktivierung zeigten einen statistisch signifikanten Trend bei den Thrombinspiegeln.