Protokolle für orale Infektion von Schmetterlingslarven mit Baculovirus

In diesem Video zeigen wir, orale Infektion Techniken der Schmetterlingslarven mit Baculovirus um insektizide Wirksamkeit zu bestimmen.

Das Vao-Virus wird häufig als DNA-Vektor verwendet, der in Kombination mit Insektenzelllinien für die Proteinexpression verwendet wird. Die Tatsache, dass dieses Virus Insekten effizient mit tödlichen Folgen infiziert, macht es aber auch zu einem wirksamen Insektizid. In Brasilien zum Beispiel wird das Wildtyp-Balo-Virus jährlich auf mehr als 1 Million Hektar Sojabohnenkulturen ausgebracht, um die Raupe der Samtbohne zu bekämpfen und ihre insektizide Wirksamkeit zu verbessern. Balo-Viren wurden gentechnisch mit Genen verändert, die für insektenspezifische Toxine kodieren, die im HemosIL des Insekts aktiv sind.

In diesem Video zeigen wir Methoden zur oralen Infektion von Schmetterlingslarven mit dem Bacao-Virus, um die insektizide Wirksamkeit zu analysieren. Hallo, ich komme vom Blind Boning Labor in der Abteilung für Augenheilkunde und der Iowa State University, und ich bin Wendy Sparks, ebenfalls vom Knochenlabor. Heute zeigen wir Ihnen zwei Verfahren zur VA-Virusinfektion von Lter und Larven.

Zunächst zeigt Ihnen harran, wie Sie Neugeborenenlarven mit einem Tröpfchenfütterungs-Bioassay infizieren können. Und dann zeige ich Ihnen, wie Sie Larven im mittleren bis späten Stadium mit einem Diät-Blutbioassay infizieren können. Also lasst uns loslegen.

Bioassays zur Tröpfchenfütterung können zur Bestimmung der letalen Dosis von Abacavir und des Überlebens verwendet werden. Zeitpunkt der mit dem Balovirus infizierten Larven. Für diesen Assay werden in der Regel Larven im Frühstadium oder im Neugeborenenstadium verwendet.

Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass Sie Diätbecher mit der richtigen Diät zur Hand haben. Bereiten Sie auch die entsprechenden Virusverdünnungen vor, die grünen Lebensmittelfarbstoff mit einer Konzentration von 4 Vol.-% enthalten. Um die letale Viruskonzentration zu bestimmen, sollte die Verdünnung einen Bereich der Mortalität zwischen eins und 99 % ergeben. Vorläufige Biotests können erforderlich sein, um einen geeigneten Bereich von Viruskonzentrationen zu bestimmen. Nach dem Vortexen des Röhrchens, um ein Absetzen der Polyeder zu verhindern, machen Sie zwei konzentrische Kreise aus kleinen Tröpfchen der Viruslösung in einer 60-Millimeter-Petrischale.

Denken Sie daran, für jede verwendete Viruskonzentration auch eine Scheininfektion mit Negativkontrolle einzurichten. Als nächstes werden 25 bis 30 Neugeborenenlarven mit einem sterilen Pinsel in die Mitte der konzentrischen Kreise gebracht. Den Deckel auf die Schale legen und mit Paraform verschließen, um ein Entweichen der Larven zu verhindern.

Verwenden Sie idealerweise unterschiedliche Pinsel für die Übertragung auf jeden Virustyp, um eine Kontamination zwischen den Behandlungen zu vermeiden. Lassen Sie das Gericht 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen, während dieser Zeit trinken die Larven. Die Lösungslarven, die gefüttert haben, können durch die grüne Färbung des vorderen Darms identifiziert werden, die sich aus dem grünen Lebensmittelfarbstoff ergibt, übertragen nur diejenigen Larven, die gefüttert haben, in eine Unze Plastikbecher, die eine Diätübertragung von einer Larve pro Tasse enthalten.

Nach dem Transfer der Larven die Becher mit Deckeln abdecken und 24 Stunden nach der Infektion bei 28 Grad Celsius inkubieren. Beseitigen Sie alle Becher mit toten Larven. Diese frühen Todesfälle sind wahrscheinlich auf Verletzungen beim Umgang mit ihnen zurückzuführen.

Bei der Verwendung dieses Bioassays zur Bestimmung der letalen Dosis sollten die Larven alle zwei bis drei Tage überprüft werden, bis die scheininfizierten Larven und alle überlebenden virusbehandelten Larven sich gereinigt haben oder begonnen haben, sich zu leihen, um virusinfizierte Larven zu verpuppen, auf der Oberseite des Futters verbleiben und dann nach einigen Tagen absterben. Tote Larven werden manchmal mein und verwandeln sich in schwarze Larven, die an einer Infektion sterben, im Wesentlichen zu Säcken mit Polyedern, die sich vollständig auflösen. Wenn zu diesem Zeitpunkt eine mechanische Störung auftritt, ist die Larvensterblichkeit bei jeder Behandlung zu bewerten.

Bioassays der letalen Konzentration sollten drei- oder viermal zu unterschiedlichen Anlässen repliziert werden. Verwenden Sie 30 Personen pro Dosis für jede Virus- oder Kontrollbehandlung. Verwenden Sie ein geeignetes Nachlassanalyseprogramm wie Polo oder SAS, um lc 50-Werte, 95%-Konfidenzintervalle und die entsprechenden Statistiken zu berechnen.

Dieser Tröpfchenfütterungsassay kann auch zur Bestimmung der ST 50-Überlebenszeitwerte verwendet werden. In diesem Fall wird die Larvensterblichkeit alle vier bis acht Stunden gemessen, wobei die Beobachtungen häufiger sind. Wenn die Mortalitätsrate hoch ist, werden Bioassays mit einer lc 99-Dosis der medianen Überlebenszeiten des Virus durchgeführt, und die 95%-Konfidenzgrenzen werden unter Verwendung des Kaplan-Mayer-Schätzers unter Verwendung eines s plus- oder SAS-Programms berechnet.

Nachdem Harang Ihnen nun den Bioassay für die Tröpfchenfütterung gezeigt hat, zeige ich Ihnen den Diät-Plug-Bioassay Im Diät-Plug-Bioassay. Mittlere bis späte Instar-Larven werden mit einem Diätpfropfen gefüttert, der mit einer bekannten Virusdosis behandelt wurde, um die letale Dosis oder LD 50 am Tag vor der Durchführung dieses Assays zu bestimmen. Nehmen Sie das Futter aus dem Becher, um die Larven über Nacht auszuhungern.

Dieser Schritt erhöht die Geschwindigkeit, mit der die Larven das Virus konsumieren. Geimpfter Diätwürfel am nächsten Tag, bereiten Sie die Diät vor, indem Sie ihn in kleine Würfel von etwa zwei Kubikmillimetern schneiden. Sind die Diätwürfel zu klein, trocknen sie aus.

Sind die Futterwürfel zu groß, können die Larven nicht von heute auf morgen den gesamten Futterwürfel verzehren. Gib nun ein bis zwei Mikroliter Polyeder-Suspension in jeden Diätwürfel. Die Suspension enthält 4 Vol.-% Lebensmittelfarbstoff.

Lassen Sie die Suspension fünf bis 15 Minuten lang in die Diät einziehen. Denken Sie daran, auch einen mit Viren behandelten Diätwürfel als Negativkontrolle vorzubereiten. Übertragen Sie als Nächstes einen Futterwürfel auf jede vierte Larve im Stadium in jeder Tasse.

Stellen Sie dann am nächsten Tag bei 28 Grad Celsius die Becher über Nacht in den Inkubator, entsorgen Sie alle Larven, die den Futterwürfel nicht vollständig aufgefressen haben. Geben Sie dann für die restlichen Larven ein großes Stück Futter in jede Tasse. Halten Sie die Larven bei 28 Grad Celsius und fügen Sie bei Bedarf zusätzliches Futter hinzu, bis die scheininfizierten Larven und die überlebenden virusinfizierten Larven gefressen oder begonnen haben, sich zu verpuppen.

Notieren Sie zu diesem Zeitpunkt die Anzahl der toten und überlebenden Insekten. Wir zeigen Ihnen nur zwei Methoden zur Infektion von Insekten mit Rückenviren, Blutungen, Fütterungsbiopsie und die Diät-Plaque-Biopsie. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die vom Vao-Virus abgetöteten Larven in der Regel zerbrechlich sind und das freigesetzte Virus leicht zerreißen kann.

Sterilisieren Sie also Arbeitsflächen und entsorgen Sie kontaminierte Handschuhe und Einwegmaterialien in geeigneter Weise, um eine Kontamination zu vermeiden. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.