La constante de unión de equilibrio y la fuerza de unión

La constante de unión de equilibrio (Kb) cuantifica la fuerza de una interacción proteína-ligando. Kb se puede calcular de la siguiente manera cuando la reacción está en equilibrio:

donde P y L son la proteína y el ligando no unidos, respectivamente, y PL es el complejo proteína-ligando.

Como la cantidad de ligando unido también está relacionada con la tasa de unión del ligando, los experimentos también pueden determinar Kb examinando las tasas de asociación proteína-ligando (kon) y disociación (koff) utilizando la siguiente proporción:

Por lo tanto, se utilizan dos categorías de ensayos de unión para determinar la constante de unión en equilibrio: los que miden las concentraciones de equilibrio y los que miden la cinética de una reacción. En este caso, la reacción debe estar en equilibrio en el momento de la medición.

El método para determinar las concentraciones de equilibrio depende de la sensibilidad deseada y la facilidad de detección de la señal. Por estas razones, los ensayos espectroscópicos son los más utilizados. En estos experimentos, la reacción produce un cambio de absorbancia de un reactivo o de un producto a una longitud de onda determinada, detectable mediante un espectrofotómetro UV-Vis. Alternativamente, el reactivo o producto puede marcarse con una sonda fluorescente o puede contener un fluoróforo intrínseco. Entonces, el progreso de la reacción se puede medir a partir del cambio de fluorescencia. Estos ensayos se realizan variando las concentraciones de un reactivo mientras el resto del experimento se mantiene constante. Por tanto, los resultados se pueden representar gráficamente y analizar con varios métodos de ajuste de curvas.

Las interacciones entre proteínas y ligandos también se estudian utilizando una variedad de técnicas bioquímicas y espectroscópicas. El análisis estructural, mediante cristalografía de rayos X y espectroscopia de RMN, ayuda a predecir las interacciones proteína-ligando mediante simulaciones moleculares. Los enfoques teóricos y computacionales, como los estudios de acoplamiento de proteínas y ligandos, se utilizan ampliamente para caracterizar la posición y las interacciones de ligandos de moléculas pequeñas, incluidos los candidatos a fármacos. El diseño de fármacos asistido por computadora es una alternativa rápida y de bajo costo para acelerar el ritmo de las pruebas de fármacos convencionales de prueba y error.