Summary
Nous décrivons les protocoles de nos arteriosclerois de greffe de souris (GA) des modèles qui impliquent interposition d'un segment de vaisseau de la souris sur un receveur de la même souche consanguine. Par rétrocroisant changements génétiques dans le donneur de navire, le modèle permet d'évaluer l'effet de gènes spécifiques sur GA.
Abstract
Arteriosclerois greffés (GA), également appelés vasculopathie d'allogreffe, est une lésion pathologique qui se développe au fil des mois ou des années dans les organes transplantés caractérisées par diffus, une sténose circonférentielle de l'ensemble de l'arborescence vasculaire du greffon. L'élément le plus critique de GA pathogénie est la prolifération des cellules musculaires lisses, comme au sein de l'intima. Quand un segment d'artère coronaire humaine est intercalé dans la aorte sous-rénale de souris immunodéficientes, les intimas pourraient être développer en réponse à lymphocytes T humains par transfert adoptif allogénique pour le donateur de l'artère ou exogène humain IFN-γ en l'absence de cellules T humaines. Interposition d'une aorte de souris d'une souche dans un autre destinataire de la souche de souris est limitée comme un modèle pour le rejet chronique chez l'homme, car la réponse de rejet à médiation cellulaire aigu dans ce modèle de souris élimine complètement toutes les cellules vasculaires dérivées du donneur de la greffe dans les deux-trois semaines. Nous avons récemment développé deux nouveaux mOuse modèles de contourner ces problèmes. Le premier modèle comporte l'interposition d'un segment de vaisseau à partir d'une souris mâle dans une femelle receveuse de la même souche pure (C57BL/6J). Le rejet de greffe dans cette affaire est dirigée uniquement contre les antigènes mineurs d'histocompatibilité codées par le chromosome Y (présent chez l'homme, mais pas la femelle) et la réponse de rejet qui s'ensuit est assez indolent de préserver les cellules musculaires lisses dérivées du donneur pendant plusieurs semaines. Le deuxième modèle comprend l'interposition d'un segment d'artère d'un type C57BL/6J donneur de souris sauvage dans une souris hôte de la même souche et le sexe qui n'a pas le récepteur de l'IFN-γ, suivi par l'administration de souris IFN-γ (envoyé par l'infection de la souris foie avec un vecteur adénoviral. Il n'ya pas de rejet dans ce cas comme donneur et souris receveuses sont de la même souche et le sexe, mais les cellules musculaires lisses des donateurs prolifèrent en réponse à la cytokine tandis que les cellules dérivées de l'hôte, manquant de récepteurs pourcette cytokine, sont insensibles. Par rétrocroisant changements génétiques dans le donneur de navire, les deux modèles peuvent être utilisés pour évaluer l'effet de gènes spécifiques sur la progression GA. Ici, nous décrivons des protocoles détaillés pour nos modèles GA de souris.
Introduction
Arteriosclerois greffés (GA), également appelés vasculopathie d'allogreffe, est une lésion pathologique qui se développe au fil des mois ou des années dans les organes transplantés caractérisées par diffus, une sténose circonférentielle de l'ensemble de l'arborescence vasculaire du greffon 7. Les stades précoces peuvent provoquer des sténoses excentriques et focal qui sont plus évidentes dans les artères, ce qui ressemble davantage sténoses observées dans l'athérosclérose conventionnel. La perte de la lumière des vaisseaux greffés résulte de l'expansion intimale due à l'infiltration de cellules et les macrophages T hôte et en particulier à l'accumulation de matrice extracellulaire et le muscle lisse en forme de cellules provient de greffon, l'hôte ou les deux 5, 13, 19, qui est insuffisamment compensée par le remodelage vasculaire vers l'extérieur. En allogreffes cardiaques, les lésions les plus cliniquement significatifs sont ceux dans les artères coronaires épicardiques et intramyocardique. En fin de compte, GA des artères coronaires provoquer une insuffisance cardiaque ischémique. GA est la principale cause de gr cardiaque tardperte arrière. Les sténoses de GA s'arrêtent pas aux lignes de suture, impliquant fortement la réponse de l'hôte à alloantigènes greffés dans sa pathogénie et qui nous conduit à classer GA comme une forme de rejet chronique 3. Cependant, d'autres formes de lésions artérielles peuvent augmenter le risque de GA, soit par l'augmentation de la charge nette de blessure ou en intensifiant et / ou la modulation de la réponse allo-immune. La cellule (CE) paroi endothéliale des artères greffe est conservé dans GA humaine et les régions les plus superficielles de l'intima à côté de la doublure CE est le site le plus fortement infiltré par dérivée de l'hôte IFN-γ-production des cellules T et les macrophages 11; dans certains patients GA est associé avec le développement de allo-anticorps donneur-spécifiques qui se lient au greffe CE 16, mais les vaisseaux montrent peu de signes de la nécrose fibrinoid qui est caractéristique de rejet humoral aigu 11.
L'élément le plus critique de GA pathogénie est l'la prolifération des cellules musculaires lisses, comme au sein de l'intima, si ce processus peut être arrêté, GA est peu probable pour progresser. Les travaux antérieurs de notre groupe avait montré que intimas des segments des artères coronaires humaines interposés dans la aorte sous-rénale de souris immunodéficientes développer en réponse à lymphocytes T humains par transfert adoptif allogéniques pour le donateur de l'artère et que ce processus pouvait être inhibée par la neutralisation humain IFN- γ 18. En outre IFN-γ exogène humaine pourrait causer intimale (et médiane) des cellules musculaires lisses (CMLV) prolifération vasculaire dans ces greffons artériels en l'absence de lymphocytes T humains 15, 17. (Il est important de noter que l'homme et la souris IFN-γ ne traversent pas les espèces, en excluant les effets indirects sur l'hôte de la souris dans ce système expérimental.) Ces modèles humanisés de souris ont l'avantage de récapituler les cellules T humaines / interactions cellulaires vasculaires et l'intima lésions sont largement composées de cellules humaines (c.-à-greffe dérivé),comme cela a été observé dans des échantillons cliniques, mais ils ne récapituler pas entièrement la situation clinique parce qu'ils ignorent le rôle des macrophages de l'hôte et éventuellement d'autres types cellulaires impliqués dans les lésions de transplantation clinique. Un modèle classique de la souris de ce processus pourrait théoriquement remédier à ce problème, en complément des limites du modèle humanisé en impliquant le système immunitaire de l'hôte complet et offrant l'avantage supplémentaire de permettre l'alimentation des approches génétiques de souris à appliquer à l'AG. Les deux modèles de souris plus largement utilisés impliquent la transplantation cardiaque hétérotopique et l'artère orthotopique transplantation 1. Les lésions qui se développent dans les artères de greffes cardiaques hétérotopiques sont en grande partie constitués de cellules de l'hôte, probablement d'origine de la moelle osseuse, tandis que les cellules intima des artères dans les greffes cardiaques humaines sont en majorité d'origine du greffon 5, 13, 19. Il s'agit d'une distinction importante qui a conduit à développer des modèles alternatifs de souris. Interposition d'une aorte de souris d'une souche à un autre destinataire de la souche de souris est encore plus limitée de modèle pour le rejet chronique chez l'homme parce que la réponse à médiation cellulaire de rejet aigu dans ce modèle de souris élimine complètement toutes les cellules vasculaires dérivées du donneur de la greffe à l'intérieur de deux, trois, 19 semaines. Par conséquent, les modifications ultérieures vu dans le segment de vaisseau interposé sont uniquement une réponse des cellules hôtes qui ont repeuplées le décellularisé navire échafaudage, créant une situation très artefact d'une pertinence limitée comme un modèle pour les changements dans les vaisseaux greffés qui se produisent dans la clinique. Nous avons récemment développé deux nouveaux modèles de souris pour contourner ces problèmes 21. Le premier modèle comporte l'interposition d'un segment de vaisseau à partir d'une souris mâle dans une femelle receveuse de la même souche pure (C57BL/6J). Le deuxième modèle consiste à interposer un segment d'artère d'un type C57BL/6J donneur de souris sauvage dans une souris hôte de la même souche et le sexe qui n'a pas la receptor IFN-γ pour (IFN-yR-KO), suivie par l'administration d'IFN-γ souris (envoyé par infection du foie de souris avec un vecteur adénoviral. Ici, nous décrivons les protocoles détaillés et les avantages de nos modèles GA de souris.
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Protocol
allogreffe de la souris et syngénéique modèle de transplantation de greffe
Toutes les études sur les animaux ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et comités de l'utilisation de l'Université de Yale. Pour le modèle d'allogreffe, les segments de l'aorte thoracique du mâle, semaine 4-5 ancien WT (C57BL/6J) ou souris IFN-yR-KO sont interposés dans l'aorte abdominale du récipiendaire féminine, 8-12 semaine WT aide d'un bout à la fin de microchirurgie technique d'anastomose (voir prochaine pour plus de détails). Pour le modèle de greffe syngénique, des segments de aorte thoracique de Male, 4-5 semaines vieilles souris WT ont été intercalés dans la aorte abdominale du mâle, 8-12 semaine IFN-γR1-KO en utilisant une technique de microchirurgie anastomose de bout en bout. Après 1 semaine après l'opération, les animaux ont été inoculés avec iv Ad5.CMV-souris IFN-γ ou Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) à 1 x 10 9 PFU. Sérum de souris IFN-γ ont été mesurés par ELISA (eBioscience) à 1 et 5 semaines après l'administration de l'adénovirus. Certains animaux ont reçu BrdU(Sigma-Aldrich) à 100 mg / kg sc pendant 2 semaines avant le sacrifice.
End-to-end microchirurgie technique d'anastomose (vidéo sera prise pour cette partie):
1. Procédure de donateurs
- Anesthésier les souris donneuses avec injection intrapéritonéale de kétamine (50 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg).
- Après s'être assuré une anesthésie adéquate, placer les souris donneuses sous le microscope opératoire à X8-30 grossissement sur un plateau dans une position couchée, et utiliser un tampon à l'iode et un tampon à l'alcool pour la préparation de la paroi thoracique.
- Inciser la paroi antérieure du thorax par les nervures et le diaphragme afin d'exposer le coeur.
- Ouvrez l'oreillette droite, injecter 10 ml d'héparine (100 U / ml) solution saline dans le ventricule gauche pour chasser les souris en utilisant une seringue de 10 ml avec une aiguille de calibre 25.
- Réséquer le cœur et les poumons pour exposer toute la longueur de l'aorte thoracique.
- Disséquer l'aorte thoracique soigneusement afin de minimiser le traumatisme direct, tout en recueillante identifier, ligaturer et diviser les branches de bois à l'aide de 11-0 suture près de l'aorte.
- Une fois l'aorte thoracique est libre de tissu environnant, l'accise l'ensemble aorte thoracique pour une transplantation.
- Rincer l'extrémité coupée de l'aorte du donneur avec une solution saline héparine (100 U / ml), et le ranger dans la même solution sur la glace (jusqu'à 6 heures) jusqu'à la transplantation.
2. Procédure de destinataire
- Injecter les souris receveuses avec le kétoprofène ip (5 mg / kg) pour l'analgésie, et thenanesthetize les souris avec de la kétamine ip (50 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Les souris receveuses sont profondément anesthésiés dans les 10 minutes pour une durée de 60-90 minutes. Pendant l'opération, le niveau de l'anesthésie est évaluée toutes les 15 min en pinçant la paroi abdominale antérieure ou pied à l'aide de pinces. Si l'animal réagit aux stimuli nocifs à tout moment pendant l'intervention chirurgicale, une dose supplémentaire de kétamine et de xylazine (1/4 ou 1/3 de la dose initiale) sera administré par SC ou IM
- Après s'être assuré une anesthésie adéquate, raser la fourrure dans la paroi abdominale antérieure avec un rasoir électrique, nettoyer la peau en utilisant Prep Pad d'iode et Pad Prep alcool, couvrir les yeux à l'aide pommade ophtalmique. Pendant la chirurgie, les techniques d'asepsie suivants seront utilisés pour les opérations, y compris le nettoyage de la table d'opération avec 10% de javel, le port de gants stériles et en utilisant des instruments de microchirurgie stérilisés (instruments stérilisés à la vapeur pour le début de l'opération, puis verre chaud perle stérilisé instruments entre plusieurs opérations, etc.)
- Placez les souris receveuses sous le microscope opératoire à un grossissement de X8-30 sur un plateau dans une position couchée.
- Inciser la paroi abdominale à partir de la ligne médiane à xiphoïde pubis, et la propagation de la paroi abdominale en dehors à l'aide d'un micro-enrouleur pour exposer la cavité abdominale.
- Rentrez les intestins haut et envelopper avec de la gaze humidifiée avec une solution saline. Les souris receveuses se refroidir par la perte de HEAt par les intestins extériorisés. Il est important de maintenir la chaleur animale. Toutefois, le conseil de chauffage n'est pas utilisé pendant la chirurgie que l'hypothermie modérée est bénéfique dans la prévention des lésions de la moelle pendant l'occlusion du flux sanguin aortique ainsi que, il ya transfert de chaleur inefficace avec le flux sanguin absent dans la moitié inférieure du corps de la souris.
- Déplacez les organes reproducteurs inferiorly, envelopper les domaines de l'abdomen de souris receveuses avec de la gaze de solution saline solution humidifié, et l'utiliser pour rentrer le rectum à droite de l'abdomen. Les tissus exposés sont irrigués régulièrement avec une solution saline lors de la transplantation.
- Disséquer carrément un segment d'aorte entre le navire rénale proximale et distale bifurcation aortique et se séparer de la veine cave inférieure (VCI) soigneusement.
- Identifier et ligaturer toutes les petites branches provenant de ce segment de l'aorte abdominale à l'aide 11-0 Polyamide monofilament suture.
- Clampage du segment isolé d'unaorte bdominal l'aide de deux pinces vasculaires approximativement 5 mm d'intervalle, un à chaque extrémité.
- Transect l'aorte abdominale entre les pinces à l'aide de micro-ciseaux pointus pour créer des sites anastomotiques.
- Réséquer un petit segment de l'aorte abdominale (jusqu'à 0,4 mm de longueur) d'une extrémité de coupe de l'aorte sectionnée destinataire pour s'adapter à la prothèse aortique de donneur.
- Rincer les segments aortiques entre les pinces en utilisant une solution saline héparinée pour enlever le sang résiduel. Les segments de l'aorte entre les pinces et le greffon aortique de donneur sont irrigués périodiquement (100 U / ml) solution saline héparine (jusqu'à 40 ml / kg) au cours de l'anastomose.
- Sectionner les deux côtés de l'aorte du donneur avec des micro-ciseaux pointus afin de créer un greffon de segment de 2,5 mm de longueur pour la transplantation.
- Placer la prothèse aortique de donneur en position orthotopique, anastomose extrémité proximale et distale du donneur de greffe à proximale et distale extrémité coupée du destinataire de l'aorte abdominale, respectivement, avec une fin-tmotif o-end en utilisant 11-0 Polyamide monofilament suture.
- Pour les sutures continues, placer les sutures de séjour à 3 et 9 heures premièrement. Entre deux sutures de séjour de chaque côté de la greffe, s'anastomosent les deux bords coupés à 3-4 points de suture à l'aide des sutures de course, et nouer les sutures de course pour rester sutures avec un double nœud. Comme les deux couches de fermeture sont continues, le risque de déhiscence est augmentée. Le greffon aortique donneur doit être d'une longueur appropriée pour relier proximale et distale extrémité coupée du destinataire de l'aorte abdominale.
- Pour les sutures interrompues, de construire quatre anastomose à 3 et 9 heures dans les deux côtés de la greffe d'une part, et anastomoser deux bords coupés à 3-4 points entre deux sutures de séjour de chaque côté de la greffe.
- Relâcher la pince distale pour permettre l'écoulement rétrograde en greffe, identifier les sites de saignement et de faire des points supplémentaires dans les 3 minutes.
- Après avoir vérifié l'hémostase satisfaisante, relâchez la pince proximale.
- Confirmer la perméabilité du greffon selon la présence d'une pulsation vigoureuse dans la greffe et le segment adjacent proximale de l'aorte abdominale natif, en particulier dans le segment adjacent distale de l'aorte abdominale et l'artère mésentérique inférieure. Considérez thrombose dans des sites anastomotiques si la pulsation diminue au bout de quelques minutes après le rétablissement de la circulation sanguine.
- Retourner les intestins dans la cavité abdominale.
- Suturer fermer la paroi abdominale en utilisant 5-0 Nylon suture dans la couche musculaire et la couche de peau, respectivement.
- Placez les souris receveuses dans une cage propre sur le dessus d'un coussin chauffant, et d'attendre 1-2 heures pour les souris à reprendre conscience et se remettre de l'anesthésie. Il est important de maintenir la chaleur animale adéquate lors de la récupération. Gardez les souris dans la cage chaud et au sec avant sillage des animaux de l'anesthésie.
- Évaluer la fonction motrice des membres inférieurs après récupération de la souris, et encore le deuxième jour. Une chirurgie de transplantation réussie sera confirmée if aucun dysfonctionnement des membres postérieurs est observée chez les souris receveuses de la deuxième journée.
- Administrer les souris receveuses au kétoprofène dans l'eau potable (5 mg / kg / j = 27 ug / ml dans l'eau potable) pendant 48 heures. Si des souris receveuses souffrent de douleur non soulagée par les analgésiques postopératoires comme en témoigne la perte de mobilité, absence de toilettage, anormale bottes posture, etc, ils seront euthanasiés. Les animaux seront euthanasiés à la fin des points prédéfinis après 1-60 jours.
Analyse Graft
greffons artériels dans allogreffe ont été achetés à 4 semaines et greffes dans le modèle de greffe syngénique ont 6 semaines après l'opération (5 semaines après l'infection virale) et analysés par les techniques histologiques standard pour Elastica-van Gieson (EVG) coloration, hématoxyline et l'éosine (HE) coloration et immunofluorescence. Les photos ont été prises à l'aide d'un système de microscope immunofluorescence (Zeiss). Le comptage des cellules des noyaux entouré par immunomarquage positif a effectuered à fort grossissement et une moyenne de 5 sections pour chaque greffon. Les mesures de surface greffés de la lumière (à l'intérieur de l'endothélium), intima (entre la limitante élastique endothélium et interne, IEL), les médias (entre l'IEL et limitante élastique externe, anguille), épaisseur de paroi (entre la limitante élastique endothélium et externe) et tout navire (à l'intérieur de l'anguille) ont été calculés à partir de 5 sections de série, 150 um d'intervalle pour chaque greffon, en utilisant l'analyse d'image assistée par ordinateur et NIH image 1.60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).
L'analyse statistique
Toutes les données sont exprimées en moyenne ± SEM. À deux queues, des tests t appariés et une analyse ANOVA à deux voies ont été effectuées en utilisant le logiciel Prism (GraphPad Software). Différences avec P <0,05 ont été considérées pour indiquer la signification statistique.
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Representative Results
Modèle souris allogreffe artériosclérose (GA): Dans ce modèle, une aorte du donneur masculin est transplanté dans récipiendaire féminine afin que l'hôte induit réponses T allo-immunes à médiation cellulaire alloréactives contre un antigène mineur de Y (l'antigène d'histocompatibilité mineure HY spécifiques au mâle) exprimé sur le greffon 12, et à son tour des cellules T IFN-γ produite lecteurs VSMC prolifération 20 comme on l'observe dans d'autres modèles de transplantation d'allogreffes 2, 6, 8-10, 14. Un segment de l'aorte thoracique d'un mâle donneur a été chirurgicalement interposé dans une aorte abdominale d'un récipiendaire féminine, et aortes ont été récoltées après 4 semaines post-transplantation (figure 1A). L'analyse histologique des greffons artériels a été réalisée par Elastica-van Gieson (EVG), H & E et immunologique avec SMA marqueur de cellules musculaires lisses vasculaires et le marqueur pan-leucocytaire CD45. Aucun rejet de greffe n'a été observée entre les souris mâles C57BL/6J dans la transplantation de l'aorte. Homme à transplantat fémininion induite GA, caractérisée par une infiltration de leucocytes et la formation de néo-intima avec une accumulation de cellules musculaires lisses vasculaires (figure 1B). Pour déterminer le rôle de l'IFN-γ signalisation en GA, aortes de souris WT ou IFN-yR-KO ont été transplantés au destinataire femelle WT. Suppression de l'IFN-yR dans les greffes de donneurs a montré une infiltration réduite de leucocytes et la formation de néo-intima avec des baisses de cellules SMA-positifs par rapport à WT (non représenté). Ces résultats confirment le rôle critique de l'IFN-γ signalisation en progression GA comme observé précédemment dans humanisé souris xénogreffe transplantation modèle 4, 15, 17, 18.
Artériosclérose de greffe IFN-γ induite: Il a été établi que l'IFN-γalone est suffisante pour induire la formation de néo-intima dans une souris humanisée GA modèle 15, 17. Ici, nous avons établi un modèle syngénique de l'artériosclérose de greffe souris IFN-γ induite. Dans ce modèle, WT aortes de sexe masculin ont été transplantésdans des souris receveuses IFN-yR déficientes suivie d'une injection intraveineuse d'un adénovirus à réplication déficiente codant pour l'IFN-γ de souris transgénique (Ad-IFN-γ) ou le gène LacZ contrôle (Ad-LacZ) (figure 2A). infection hépatique et de l'expression du transgène de foie de Ad-LacZ a été vérifiée par coloration X-gal dans le groupe Ad-LacZ mais pas les Ad-IFN-γ groupes comme décrit précédemment 17. Expression systémique de l'IFN-γ dans le sérum a été détecté à un niveau de 120-150 ng / ml au jour 3 et conservé jusqu'à 5 semaines dans le Ad-IFN-γ, mais pas dans le groupe LacZ. Aortes ont été récoltés à 5 semaines après l'injection de l'adénovirus pour l'analyse histologique et morphométrique évaluation de l'artère du greffon intima, media, lumière et la zone de la cuve. Expression de l'IFN-γ, mais pas le contrôle LacZ, la formation néo-intimale induite. Pas évident infiltration des leucocytes a été détecté par rapport au modèle d'allogreffe (figure 2B). Ces données sont cohérentes avec la précédenteobservations dans le modèle de xénogreffe de souris humanisée que l'IFN-γ seule est suffisante pour induire la formation de néo-intima 15, 17.
Figure 1. Illustration et l'économie de l'allogreffe artère modèle transplantation souris. A. Une illustration de la procédure de transplantation d'allogreffe. Un segment du donneur masculin aorte thoracique a été chirurgicalement interposé dans l'aorte abdominale chez un receveur femelle. Aortes ont été récoltées après 4 semaines post-transplantation. Comme contrôle, un segment de donneur masculin aorte thoracique a été chirurgicalement interposé dans une aorte abdominale chez un receveur masculin. B. L'analyse histologique des greffons artériels par Elastica-van Gieson (EVG), H & E et immunologique avec des anticorps anti-a-SMA et anti-CD45. microphotographies représentatifs sont présentés. Pointes de flèches marquent la limitante élastique interne pour délimiter l'intima des médias. Échellebar: 50 mm. Pas artériosclérose de greffe a été observée chez les mâles à un groupe masculin.
Figure 2. IFN-γ induite souris syngénique artère modèle transplantation. A. Un schéma du modèle syngénique souris IFN-γ induite. Homme donateurs artère thoracique a été disséqué et transplanté dans l'aorte abdominale chez les bénéficiaires IFN-yR KO souris mâles. Un post chirurgie de semaine, 1X10 9 pfu Ad-mIFN-γ ou Ad-LacZ a été injecté dans des souris receveuses via la veine jugulaire. Le sérum a été recueilli au jour 3, 7 et 35 post-injection de virus pour l'IFN-γ mesure. Les greffes ont été récoltés 6 semaines évaluation morphométrique. B. L'analyse histologique des greffons artériels par immunologique avec des anticorps anti-a-SMA et anti-CD45. microphotographies représentatifs sont présentés. Pointes de flèches marquent la limitante élastique interne pour délimiter l'intima des médias. Échelle bAR: 50 mm. Pas artériosclérose de greffe a été observée dans le groupe LacZ.
| Étape | Problème | Raison possible | Solution |
| 2.17 | L'hémorragie sévère | L'écart (distance entre deux points) est trop important, en particulier des points séparés. | La distance entre chaque deux points doit être uniforme au cours de l'anastomose. Ajouter un point de saignement site. |
| Seul l'adventice est cousue. | L'identification et la couture de la totalité de la paroi de l'aorte | ||
| Branches de bois non ligaturées | Ligature des branches de bois | ||
| Utiliser trop de l'héparine | Utiliser jusqu'à 40 ml / kg héparine (100 U / ml) solution saline pour irriguer le champ de la chirurgie au cours de l'anastomose. | ||
| 2.19 | Thrombose | Lumen est trop étroite au niveau du site d'anastomose, en particulier des fils de suture continue. | Évitez anastomosing trop paroi aortique à chaque point. La taille de l'aorte de souris est très petite. Pour point trop paroi aortique au cours de l'anastomose entraînera lumière étroite et la thrombose, cependant, point trop paroi aortique moins se traduira par une hémorragie sévère. |
| Le passage de fil de suture à travers la paroi de l'aorte du côté opposé. | Identification de la paroi de l'aorte, puis faire des points. Si cela s'est produit, l'opérateur doit couper le nœud de suture et re-point à cet endroit. | ||
| Les cellules endothéliales sont blessés au cours de l'anastomose. | En utilisant les sutures de séjour pour l'anastomose. Ne tenez pas / presser tout le mur arotic par descèpes pour l'anastomose. | ||
| L'héparine n'est pas utilisé pendant une anastomose. | La taille de l'aorte de souris est très petite. Il est très facile pour la formation de thrombose dans les greffons après anastomose. Donner l'héparine pour irriguer le champ de la chirurgie est très important pour la réduction de la thrombose. Le taux de réussite de la greffe de vaisseau chez la souris est d'environ 50% sans l'aide de l'héparine et de 95-100% avec l'utilisation de l'héparine. Si la thrombose se trouve à quelques minutes après le rétablissement de la circulation sanguine, une approche alternative pour enlever la thrombose consiste à injecter une solution saline 30-50 heparinied ul (100 U / ml) par IVC. Ne pas injecter trop héparine juste au cas d'hémorragie sévère. | ||
| 2.23 | Transplantation échoué | Saignement et de thrombose tardive, ou d'autres | La transplantation des navires dans les souris est une intervention chirurgicale très difficile pour la taille de l'aorte de souris est très petite. Il ya trois poi clénts pour le succès de la chirurgie: 1) s'assurer que les parois aortiques de l'hôte et du donneur sont anastomosées ensemble sans évidemment écart, juste au cas d'hémorragie sévère, 2) garder suffisamment d'espace de lumière au site de l'anastomose, juste au cas de thrombose; 3) l'utilisation héparine dans une bonne dose au cours de l'anastomose, juste au cas de thrombose et une hémorragie sévère. Suite à ce protocole, le taux de réussite pour l'auteur de plus de 95%. |
Tableau 1. Dépannage table.
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Discussion
Les protocoles décrits sont axés sur les modèles GA souris. Les procédures peuvent être appliquées à d'autres modèles de transplantation de greffons. Ces modèles comprennent xénogreffe humanisée (c. segments d'artère coronaire de l'homme interposés dans le aortes infra-rénale de souris immunodéficientes), et le rejet aigu souris modèle GA (soit une aorte de souris d'une souche génétique dans un autre destinataire de souche génétique). Nos modèles de souris décrites ne sont plus à fermer lésions GA humains. Le premier modèle comporte l'interposition d'un segment de vaisseau à partir d'une souris mâle dans une femelle receveuse de la même souche pure (C57BL/6J). Le rejet de greffe dans cette affaire est dirigée uniquement contre les antigènes mineurs d'histocompatibilité codées par le chromosome Y (présent chez l'homme, mais pas la femelle) et la réponse de rejet qui s'ensuit est assez indolent de préserver les cellules musculaires lisses dérivées du donneur pendant plusieurs semaines 2, 6 , 8-10, 12, 14. Le deuxième modèle consiste à interposer un segme de l'artèrent d'un type souris C57BL/6J donneur sauvage dans une souris hôte de la même souche et le sexe qui manque le récepteur de l'IFN-γ (IFN-yR-KO), suivie par l'administration d'IFN-γ de souris (envoyé par l'infection de la souris foie avec un vecteur adénoviral.) Il n'ya pas de rejet dans ce cas comme donneur et souris receveuses sont de la même souche et le sexe, mais les cellules musculaires lisses des donateurs prolifèrent en réponse à la cytokine tandis que les cellules dérivées de l'hôte, manquant de récepteur pour cette cytokine, sont insensibles 21. En outre, par rétrocroisant changements génétiques dans le donneur de navire, les deux modèles peuvent être utilisés pour évaluer l'effet de gènes spécifiques sur la prolifération des cellules musculaires lisses IFN-γ-driven et la progression GA.
Le rôle de l'IFN-γ dans les modèles GA souris n'a pas été bien établie. Nos deux modèles de souris ont vérifié le rôle de l'IFN-γ chez la souris GA. Dans le premier modèle, une aorte du donneur masculin est transplanté dans récipiendaire fémininede sorte que l'hôte induit des réponses allo-immunes à médiation cellulaire contre le T alloréactifs mineure HY antigène d'histocompatibilité mâle-spécifique exprimé sur des greffons 12. En effet, WT (C57BL/6J) mâle vers femelle C57BL/6J transplantation induite GA, caractérisée par une infiltration de leucocytes et la formation de néo-intima avec accumulation VSMC. En revanche, les hommes de transplantation de l'aorte masculin n'induit pas de GA. Nous avons déterminé le rôle de l'IFN-γ signalisation dans les cellules vasculaires en utilisant IFN-yR-KO comme greffon du donneur au receveur transplanté féminin WT. Suppression de l'IFN-yR dans les greffes de donneurs émoussé infiltration leucocytaire et l'accumulation VSMC dans la néo-intima. Par conséquent, le rôle de l'IFN-γ dans le modèle actuel de la souris est compatible avec le modèle de transplantation de xénogreffe de souris humanisée où IFN-γ signalisation greffe est essentiel pour la progression GA 4, 15, 17, 18. Nous avons déterminé si l'IFN-γ seule est suffisante pour induire la formation de néo-intima par la création d'un IFN-γ-medisouris syngénique modèle d'athérosclérose du greffon ATED. Dans ce modèle, une aorte masculin est transplanté dans un mâle animaux IFN-yR-KO récipient dans lequel souris IFN-γ est ensuite systématiquement exprimée par injection intraveineuse d'adénovirus à réplication déficiente codant pour l'IFN-γ souris transgénique (Ad-IFN-γ ). Nous avons observé que l'expression d'IFN-γ, mais pas le contrôle LacZ, la formation néo-intimale induite. Dans ce modèle, aucune infiltration évidente des leucocytes est détecté par rapport au modèle d'allogreffe, en accord avec les observations précédentes dans un modèle de transplantation de la souris artère-SCID humaine dans laquelle vasculaire IFN-γ signalisation seule est suffisante pour induire la formation de néo-intima en l'absence de leucocytes 15, 17.
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Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R01 HL109420 à WM et AHA 9320033N à LY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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