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Medicine

भ्रष्टाचार धमनीकाठिन्य के लिए माउस मॉडल

Published: May 14, 2013 doi: 10.3791/50290
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Surgery, Yale University School of Medicine, 2Department of Pathology, Yale University School of Medicine

Summary

हम अपने माउस भ्रष्टाचार arteriosclerois (जीए) एक ही जन्मजात तनाव का एक प्राप्तकर्ता में एक माउस पोत खंड के बीच - बचाव शामिल है जो मॉडल के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है. पोत दाता में अतिरिक्त आनुवंशिक परिवर्तन backcrossing करके, मॉडल जीए पर विशेष जीन के प्रभाव का आकलन कर सकते हैं.

Introduction

भी allograft vasculopathy बुलाया भ्रष्टाचार arteriosclerois (जीए), पूरे भ्रष्टाचार संवहनी पेड़ 7 का फैलाना, परिधीय प्रकार का रोग की विशेषता प्रत्यारोपित अंगों में साल के लिए महीनों में विकसित करता है कि एक वैकृत घाव है. प्रारंभिक दौर के इस प्रकार के और अधिक बारीकी से पारंपरिक atherosclerosis में देखा stenoses जैसी धमनियों में अधिक स्पष्ट कर रहे हैं कि सनकी और फोकल stenoses कारण हो सकता है. कारण मेजबान टी कोशिकाओं और मैक्रोफेज की घुसपैठ के लिए और विशेष रूप से बाह्य मैट्रिक्स के संचय और चिकनी कोशिकाओं मांसपेशी की तरह करने intimal विस्तार से भ्रष्टाचार जहाजों परिणामों के लुमेन नुकसान अपर्याप्त मुआवजा दिया है कि भ्रष्टाचार, मेजबान या दोनों 5, 13, 19, से उत्पन्न जावक पोत remodeling के द्वारा. हृदय allografts में, सबसे चिकित्सकीय महत्वपूर्ण घावों एपिकार्डियल और intramyocardial कोरोनरी धमनियों में होते हैं. अंत में, कोरोनरी धमनियों की जीए इस्कीमिक हृदय की विफलता का कारण होगा. जीए देर हृदय जीआर का प्रमुख कारण हैपिछाड़ी नुकसान. जीए के stenoses दृढ़ता से अपनी रोगजनन में भ्रष्टाचार alloantigens को मेजबान प्रतिक्रिया implicating और हमें पुराने अस्वीकृति 3 के एक फार्म के रूप में जीए वर्गीकृत करने के लिए अग्रणी, सीवन लाइनों पर रोक. हालांकि, धमनी चोट के अन्य रूपों की चोट का शुद्ध बोझ बढ़ाने के माध्यम से या तेज और / या alloimmune प्रतिक्रिया नियमन करने से या तो, जीए का खतरा बढ़ सकता है. भ्रष्टाचार धमनियों के endothelial सेल (ईसी) अस्तर मानव जीए में संरक्षित और चुनाव आयोग के अंदरूनी हिस्से से सटे intima के सबसे ऊपरी क्षेत्रों के सबसे भारी IFN-γ उत्पादक टी कोशिकाओं और मैक्रोफेज 11 मेजबान व्युत्पन्न द्वारा घुसपैठ की साइट है, में जीए भ्रष्टाचार चुनाव आयोग 16 लेकिन जहाजों के लिए बाध्य है कि दाता विशिष्ट alloantibodies के विकास के साथ जुड़ा हुआ है कुछ रोगियों को गंभीर एंटीबॉडी की मध्यस्थता अस्वीकृति 11 की विशेषता है कि फाइब्रिनवत् नेक्रोसिस के कुछ सबूत दिखा.

जीए रोगजनन के सबसे महत्वपूर्ण घटक हैintima भीतर चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की तरह के प्रसार, इस प्रक्रिया को गिरफ्तार किया जा सकता है, जीए प्रगति की संभावना नहीं है. हमारे समूह से पिछले काम मानव कोरोनरी धमनी क्षेत्रों के intimas immunodeficient चूहों इस प्रक्रिया धमनी दाता को अल्लोजीनिक adoptively हस्तांतरित मानव टी कोशिकाओं के जवाब में और है कि विस्तार के बुनियादी गुर्दे aortae में interposed दिखाया गया था कि मानव को निष्क्रिय करने से हिचकते जा सकता IFN- γ 18. इसके अलावा एक्सोजेनस मानव IFN-γ (और औसत दर्जे का) मानव टी कोशिकाओं 15, 17 के अभाव में इन धमनियों ग्राफ्ट में संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिका (VSMC) प्रसार intimal कारण बन सकता है. (यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि मानव और माउस IFN-γ. इस प्रायोगिक प्रणाली में माउस मेजबान पर अप्रत्यक्ष प्रभाव से इनकार, प्रजातियों को पार नहीं करते) ये humanized माउस मॉडल मानव टी सेल / संवहनी सेल बातचीत recapitulating का लाभ उठा रहे हैं और intimal घावों मोटे तौर पर, मानव (यानी भ्रष्टाचार व्युत्पन्न) कोशिकाओं से बना रहे हैंके रूप में चिकित्सीय नमूनों में देखा गया है, लेकिन वे नैदानिक ​​प्रत्यारोपण घावों में शामिल मेजबान मैक्रोफेज और संभवतः अन्य प्रकार की कोशिकाओं की भूमिका की अनदेखी क्योंकि वे पूरी तरह से नैदानिक ​​स्थिति पुनरावृत्ति नहीं है. इस प्रक्रिया का एक पारंपरिक माउस मॉडल सैद्धांतिक रूप से एक पूरी मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली को शामिल करने और गा के लिए लागू किया जा करने के लिए माउस आनुवंशिक दृष्टिकोण की शक्ति की अनुमति के अतिरिक्त लाभ प्रदान करके humanized मॉडल की सीमाओं के पूरक है, इस समस्या का समाधान कर सकता है. दो सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल माउस मॉडल heterotopic हृदय प्रत्यारोपण और orthotopic धमनी प्रत्यारोपण 1 शामिल है. मानव हृदय ग्राफ्ट में धमनियों की intimal कोशिकाओं भ्रष्टाचार के मूल 5, 13, 19 में से मुख्य रूप से कर रहे हैं जबकि heterotopic दिल ग्राफ्ट की धमनियों में विकसित घावों कि मोटे तौर पर, अस्थि मज्जा मूल के होने की संभावना मेजबान कोशिकाओं से बना रहे हैं. यह हमें वैकल्पिक माउस मॉडल विकसित करने के लिए प्रेरित किया है कि एक महत्वपूर्ण अंतर है. के बीच - बचावइस माउस मॉडल में तीव्र सेल की मध्यस्थता अस्वीकृति प्रतिक्रिया पूरी तरह से दो तीन के भीतर भ्रष्टाचार से सभी दाता व्युत्पन्न नाड़ी कोशिकाओं को समाप्त क्योंकि एक और माउस तनाव प्राप्तकर्ता में एक तनाव से एक माउस महाधमनी मानव में पुरानी अस्वीकृति के लिए एक मॉडल के रूप में भी और अधिक सीमित है सप्ताह 19. नतीजतन, interposed पोत खंड में देखा बाद में परिवर्तन क्लिनिक में होने वाले भ्रष्टाचार वाहिकाओं में परिवर्तन के लिए एक मॉडल के रूप में सीमित प्रासंगिकता के एक उच्च artifactual स्थिति पैदा decellularized पोत पाड़ repopulated है कि मेजबान कोशिकाओं के पूरी तरह से एक प्रतिक्रिया, कर रहे हैं. हमने हाल ही में इन समस्याओं का 21 को नाकाम करने के लिए दो नए माउस मॉडल विकसित किया है. पहला मॉडल एक पुरुष माउस से ही सहज तनाव (C57BL/6J) की एक महिला प्राप्तकर्ता में एक पोत खंड के बीच - बचाव करना शामिल है. दूसरे मॉडल आरईसी का अभाव है कि एक ही तनाव और लिंग के एक मेजबान माउस में एक जंगली प्रकार C57BL/6J माउस दाता से एक धमनी खंड interposing शामिलके लिए eptor IFN-γ (IFN-γR-को) माउस के प्रशासन द्वारा पीछा IFN-γ (एक adenoviral वेक्टर के साथ माउस जिगर के संक्रमण के माध्यम से दिया. यहाँ, हम विस्तृत प्रोटोकॉल और हमारे माउस जीए मॉडल के लाभों का वर्णन.

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Protocol

माउस allograft और syngeneic भ्रष्टाचार प्रत्यारोपण मॉडल

सभी जानवरों के अध्ययन येल विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया. Allograft मॉडल के लिए, पुरुष, 4-5 सप्ताह पुराने डब्ल्यूटी (C57BL/6J) या IFN-γR-को चूहों से वक्ष महाधमनी के क्षेत्रों एक को समाप्त करने का उपयोग कर महिला प्राप्तकर्ता, 8-12 सप्ताह पुराने गुम्मट के उदर महाधमनी में interposed गया अंत microsurgical anastomotic तकनीक (विवरण के लिए अगले देखें). Syngeneic भ्रष्टाचार के मॉडल के लिए, पुरुष, 4-5 सप्ताह पुराने WT चूहों से वक्ष aortae के क्षेत्रों पुरुष के पेट aortae में interposed थे, पुराने 8-12 सप्ताह IFN-γR1-KO एक को समाप्त करने के लिए अंत microsurgical anastomotic तकनीक का उपयोग कर. Postoperatively के 1 सप्ताह में, जानवरों को 1 एक्स 9 10 pfu पर Ad5.CMV माउस IFN-γ या Ad5.CMV-lacZ (Qbiogene) के साथ चार inoculated थे. सीरम माउस IFN-γ स्तरों 1 में एलिसा (eBioscience) द्वारा मापा गया और 5 हफ्तों adenovirus प्रशासन के बाद. कुछ जानवरों BrdU प्राप्तबलिदान से पहले 2 हफ्तों के लिए (सिग्मा Aldrich) 100 मिलीग्राम / किलो सुप्रीम कोर्ट.

अंत करने के लिए अंत microsurgical anastomotic तकनीक (वीडियो इस भाग के लिए ले जाया जाएगा):

1. दाता प्रक्रिया

  1. Ketamine (50 मिग्रा / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ दाता चूहों anesthetize.
  2. पर्याप्त संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के बाद, एक लापरवाह स्थिति में एक ट्रे पर X8-30 बढ़ाई ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत दाता चूहों जगह है, और छाती दीवार तैयार करने के लिए आयोडीन प्रस्तुत करने का पैड और शराब प्रस्तुत करने का पैड का उपयोग करें.
  3. पसलियों और दिल को बेनकाब करने के लिए डायाफ्राम के माध्यम से पूर्वकाल छाती दीवार काटकर अलग कर देना.
  4. सही आलिंद खोलें, एक 25 गेज सुई के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग चूहों फ्लश करने के लिए बाएं वेंट्रिकल में heparinized की 10 मिलीलीटर (100 यू / एमएल) खारा समाधान इंजेक्षन.
  5. वक्ष महाधमनी की पूरी लंबाई का पर्दाफाश करने के लिए दिल और फेफड़ों को बांटना.
  6. प्रत्यक्ष आघात, whil कम करने के लिए ध्यान से वक्ष महाधमनी काटनाई, पहचान ligate और महाधमनी के पास 11-0 सीवन का उपयोग लकड़ी शाखाओं विभाजित करते हैं.
  7. एक बार वक्ष महाधमनी आसपास के ऊतकों, प्रत्यारोपण के लिए उत्पाद शुल्क पूरी वक्ष महाधमनी से मुक्त है.
  8. (100 यू / एमएल) heparinized खारा समाधान के साथ दाता महाधमनी की कटौती अंत फ्लश, और प्रत्यारोपण तक बर्फ पर ही समाधान (6 घंटे) में स्टोर.

2. प्राप्तकर्ता प्रक्रिया

  1. Analgesia के लिए आईपी ketoprofen (5 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ प्राप्तकर्ता चूहों इंजेक्षन, और आईपी ketamine (50 मिग्रा / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों thenanesthetize. प्राप्तकर्ता चूहों 60-90 मिनट की अवधि के लिए 10 मिनट के भीतर गहरा anesthetized हैं. सर्जरी के दौरान संज्ञाहरण के स्तर संदंश का उपयोग पूर्वकाल पेट की दीवार या पैर pinching द्वारा हर 15 मिनट का आकलन किया जाता है. पशु शल्य चिकित्सा के दौरान किसी भी समय पर हानिकारक उत्तेजनाओं के प्रति प्रतिक्रिया करता है, ketamine और xylazine (1/4 या 1/3 मूल खुराक) की अतिरिक्त खुराक सुप्रीम कोर्ट या IM के द्वारा प्रशासित किया जाएगा
  2. पर्याप्त संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के बाद, एक इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग कर पूर्वकाल पेट की दीवार में फर दाढ़ी, आयोडीन प्रस्तुत करने का पैड और शराब प्रस्तुत करने का पैड का उपयोग कर त्वचा को साफ नेत्र मरहम का उपयोग कर आंखों को कवर किया. सर्जरी के दौरान, निम्नलिखित सड़न रोकनेवाला तकनीक, 10% ब्लीच के साथ ऑपरेटिंग मेज सफाई बाँझ दस्ताने पहने और निष्फल microsurgery उपकरणों (ऑपरेशन की शुरुआत के लिए भाप निष्फल उपकरणों, फिर गर्म गिलास मनका निष्फल प्रयोग सहित आपरेशन, के लिए उपयोग किया जाएगा कई आपरेशनों, आदि) के बीच उपकरणों.
  3. एक लापरवाह स्थिति में एक ट्रे पर X8-30 के एक बढ़ाई ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत प्राप्तकर्ता चूहों रखें.
  4. Xyphoid से शिश्नरोम को midline पर पेट की दीवार काटकर अलग कर देना, और उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए एक माइक्रो प्रतिकर्षक का उपयोग करने के अलावा पेट की दीवार में फैल गया.
  5. ऊंचा आंतों वापस लेना और धुंध के साथ लपेट खारा समाधान के साथ सिक्त. प्राप्तकर्ता चूहों hea की हानि से ठंडा हो गयाबहिर्मुखी आंतों के माध्यम से टी. यह जानवर गर्मी बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. मामूली हाइपोथर्मिया महाधमनी रक्त प्रवाह का रोड़ा साथ ही चूहों के शरीर के निचले हिस्से को अनुपस्थित रक्त प्रवाह के साथ अक्षम गर्मी हस्तांतरण के दौरान रीढ़ की हड्डी में चोट को रोकने में लाभ की है के रूप में हालांकि, हीटिंग बोर्ड सर्जरी के दौरान प्रयोग नहीं किया जाता.
  6. , घटिया तौर से प्रजनन अंगों हटो खारा समाधान सिक्त धुंध के साथ प्राप्तकर्ता चूहों के पेट क्षेत्रों लपेटो, और पेट के दाहिने हिस्से को मलाशय वापस लेना करने के लिए इसे उपयोग. उजागर ऊतकों प्रत्यारोपण के दौरान नमकीन घोल के साथ समय समय पर सिंचित कर रहे हैं.
  7. Distally दो टूक गुर्दे proximally पोत और महाधमनी विभाजन के बीच अधोमूत्र पिंडीय महाधमनी के एक खंड काटना और ध्यान से अवर रग Cava (IVC) से अलग करें.
  8. पहचानें और 11-0 पॉलियामाइड monofilament सीवन का उपयोग उदर महाधमनी के इस क्षेत्र से होने वाले छोटे शाखाओं के सभी ligate.
  9. एक के पार दबाना पृथक खंडअलग निकटतम रूप से 5 मिमी, प्रत्येक के अंत में एक दो संवहनी clamps का उपयोग कर bdominal महाधमनी.
  10. Anastomotic साइट बनाने के लिए तेज माइक्रो कैंची का उपयोग clamps के बीच उदर महाधमनी आड़ा काट.
  11. दाता महाधमनी भ्रष्टाचार को समायोजित करने transected प्राप्तकर्ता महाधमनी की गयी कटौती अंत से उदर महाधमनी (लंबाई में 0.4 मिमी) के एक छोटे से क्षेत्र बांटना.
  12. अवशिष्ट रक्त को निकालने के लिए heparinized खारा समाधान का उपयोग clamps के बीच महाधमनी खंडों फ्लश. clamps और दाता महाधमनी भ्रष्टाचार के बीच महाधमनी खंडों सम्मिलन दौरान heparinized (100 यू / एमएल) खारा समाधान (40 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ समय समय पर सिंचित कर रहे हैं.
  13. प्रत्यारोपण के लिए लंबाई में 2.5 मिमी की एक खंड भ्रष्टाचार बनाने के लिए तेज माइक्रो कैंची से दाता महाधमनी के दोनों ओर आड़ा काट.
  14. एक अंत, टी के साथ क्रमशः orthotopic स्थिति, उदर महाधमनी के प्राप्तकर्ता के प्रॉक्सिमल और बाहर कटौती समाप्त करने के लिए दो भागों का आपस में मिलाना दाता भ्रष्टाचार के समीपस्थ और बाहर का अंत, में दाता महाधमनी भ्रष्टाचार रखें11-0 पॉलियामाइड monofilament सीवन का उपयोग ओ के अंत पैटर्न.
  15. लगातार टांके के लिए, रहने 3 पर टांके और सबसे पहले 9:00 पदों जगह है. भ्रष्टाचार के प्रत्येक पक्ष पर दो रहने टांके के बीच, दो भागों का आपस में मिलाना कटौती चल टांके का उपयोग कर 3-4 टांके में किनारों, और दोनों एक डबल गाँठ साथ टांके रहने के लिए चल टांके टाई. बंद के दोनों परतों निरंतर कर रहे हैं, स्फुटन का खतरा बढ़ जाता है. दाता महाधमनी भ्रष्टाचार उदर महाधमनी के प्राप्तकर्ता के प्रॉक्सिमल और बाहर कटौती अंत कनेक्ट करने के लिए उचित लंबाई में होना चाहिए.
  16. बाधित टांके के लिए, 3 से कम चार सम्मिलन का निर्माण और सबसे पहले भ्रष्टाचार के दोनों पक्षों में 9 बजे की स्थिति, और भ्रष्टाचार के प्रत्येक पक्ष पर दो रहने टांके के बीच 3-4 टांके में दोनों कटौती किनारों के दो भागों का आपस में मिलाना.
  17. भ्रष्टाचार में पतित प्रवाह की अनुमति देने के लिए बाहर का दबाना छोड़ दें, खून बह रहा है साइटों की पहचान और 3 मिनट के भीतर अतिरिक्त टांके बनाने.
  18. संतोषजनक रक्तस्तम्भन पता लगाने के बाद, समीपस्थ दबाना जारी.
  19. उदर महाधमनी और अवर mesenteric धमनी के बाहर सटे क्षेत्र में विशेष रूप से, भ्रष्टाचार में जोरदार धड़कन की उपस्थिति और देशी उदर महाधमनी के समीपस्थ आसन्न खंड द्वारा भ्रष्टाचार प्रत्यक्षता की पुष्टि करें. धड़कन रक्त प्रवाह की बहाली के बाद कुछ ही मिनटों के भीतर कम अगर anastomotic साइटों में घनास्त्रता पर विचार करें.
  20. उदर गुहा में आंतों लौटें.
  21. क्रमशः, मांसपेशियों की परत और त्वचा की परत में 5-0 नायलॉन सीवन का उपयोग पेट की दीवार करीब सीवन.
  22. एक हीटिंग पैड के शीर्ष पर एक साफ पिंजरे में प्राप्तकर्ता चूहों, जगह और होश में आने और संज्ञाहरण से उबरने के लिए चूहों के लिए 1-2 घंटे इंतजार. यह वसूली के दौरान पशु पर्याप्त गर्मी बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. संज्ञाहरण से पशु मद्देनजर पहले गर्म और शुष्क पिंजरे में चूहों रखें.
  23. चूहों वसूली के बाद, और फिर दूसरे दिन हिंद अंग की मोटर समारोह का आकलन करें. एक सफल प्रत्यारोपण सर्जरी की पुष्टि की जाएगी मैंच हिंद अंग का कोई शिथिलता दूसरे दिन प्राप्तकर्ता चूहों में मनाया जाता है.
  24. पीने के पानी में ketoprofen साथ प्राप्तकर्ता चूहों प्रशासन (5 मिलीग्राम / किग्रा / घ = 27 स्नातकीय / पीने के पानी में मिलीलीटर) 48 घंटे के लिए. दूल्हा, असामान्य bunched मुद्रा, आदि के लिए गतिशीलता, विफलता के नुकसान के सबूत के रूप में किसी भी प्राप्तकर्ता चूहों पश्चात दर्दनाशक दवाओं से लगातार दर्द से पीड़ित हैं, वे euthanized किया जाएगा. जानवरों 1-60 दिनों के बाद पूर्वनिर्धारित अंत बिंदुओं पर euthanized किया जाएगा.

भ्रष्टाचार विश्लेषण

Allograft में धमनी ग्राफ्ट (5 सप्ताह वायरल संक्रमण के बाद) 6 सप्ताह के बाद operatively थे syngeneic भ्रष्टाचार के मॉडल में 4 सप्ताह और ग्राफ्ट में खरीदे और Elastica वैन Gieson (EVG) धुंधला, hematoxylin और eosin (एचई) के लिए मानक ऊतकीय तकनीक से विश्लेषण किया गया धुंधला और immunofluorescence धुंधला. चित्र एक immunofluorescence माइक्रोस्कोप प्रणाली (जीस) का उपयोग कर लिया गया. सकारात्मक immunostaining से घिरा नाभिक सेल गिनती प्रदर्शन थाउच्च वृद्धि के तहत एड और हर भ्रष्टाचार के लिए 5 वर्गों से औसत. लुमेन (अन्तःचूचुक के भीतर), intima (endothelium और आंतरिक लोचदार लामिना बीच, IEL), मीडिया (IEL और बाहरी लोचदार लामिना बीच, मछली), दीवार मोटाई (endothelium और बाहरी लोचदार लामिना के बीच) की भ्रष्टाचार क्षेत्र मापन और पूरे पोत (मछली के भीतर) कंप्यूटर की मदद से छवि विश्लेषण और एनआईएच छवि 1.60 (का उपयोग करते हुए, हर भ्रष्टाचार के लिए अलग 5 धारावाहिक पार वर्गों, 150 माइक्रोन से गणना की गई http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).

सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी डेटा मतलब ± SEM के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. दो पूंछ, बनती टी परीक्षण और एक दो तरह से एनोवा विश्लेषण चश्मे सॉफ्टवेयर प्रोग्राम (GraphPad सॉफ्टवेयर) का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया. पी <0.05 के साथ मतभेद सांख्यिकीय महत्व का संकेत माना जाता था.

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Representative Results

माउस allograft धमनीकाठिन्य (जीए) मॉडल: इस मॉडल में, एक पुरुष दाता महाधमनी मेजबान पर व्यक्त की एक नाबालिग वाई प्रतिजन (पुरुष विशेष के मामूली उतक अनुरूपता प्रतिजन हरियाणा) के खिलाफ alloreactive टी सेल की मध्यस्थता alloimmune प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करता है ताकि महिला प्राप्तकर्ता में प्रत्यारोपित किया जाता है भ्रष्टाचार के 12, और बदले में टी अन्य allograft प्रत्यारोपण मॉडल 2 में मनाया के रूप में IFN-γ ड्राइव VSMC प्रसार 20, 6, 8-10, 14 सेल का उत्पादन किया. एक दाता पुरुष से वक्ष महाधमनी का एक खंड शल्य चिकित्सा द्वारा एक महिला प्राप्तकर्ता की एक उदर महाधमनी में interposed था, और aortas 4 हफ्तों के बाद प्रत्यारोपण (चित्रा 1 ए) पर काटा गया. धमनी grafts के histological विश्लेषण Elastica वैन Gieson (EVG), एच एंड ई के द्वारा प्रदर्शन किया और VSMC मार्कर SMA और अखिल ल्युकोसैट मार्कर CD45 के साथ immunostaining था. कोई भ्रष्टाचार अस्वीकृति महाधमनी प्रत्यारोपण में C57BL/6J नर चूहों के बीच मनाया गया. महिला transplantat को नरleukocytes और VSMC का संचय (चित्रा 1 बी) के साथ neointima गठन की घुसपैठ की विशेषता आयन प्रेरित जीए,. गुम्मट या IFN-γR-को चूहों से जीए, aortas में IFN-γ सिगनल की भूमिका निर्धारित करने के गुम्मट महिला प्राप्तकर्ता को प्रत्यारोपित किया गया. दाता grafts में IFN-γR का विलोपन डब्ल्यूटी (नहीं दिखाया गया है) की तुलना में एसएमए पॉजिटिव कोशिकाओं के घटने के साथ leukocytes और neointima गठन का एक कम घुसपैठ का प्रदर्शन किया. पहले से humanized माउस xenograft प्रत्यारोपण मॉडल 4, 15, 17, 18 में मनाया के रूप में इन परिणामों जीए प्रगति में IFN-γ संकेत के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करते हैं.

IFN-γ प्रेरित भ्रष्टाचार धमनीकाठिन्य: यह IFN-γalone एक humanized माउस जीए मॉडल 15, 17 में neointima गठन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है कि स्थापित किया गया है. यहाँ हम एक IFN-γ की मध्यस्थता माउस syngeneic भ्रष्टाचार धमनीकाठिन्य मॉडल की स्थापना की. इस मॉडल में, गुम्मट पुरुष aortas प्रत्यारोपित किया गयामाउस एन्कोडिंग IFN-γ transgene (विज्ञापन IFN-γ) या नियंत्रण lacZ जीन (विज्ञापन lacZ) (2A चित्रा). प्रतिकृति की कमी adenovirus के नसों में इंजेक्शन द्वारा पीछा IFN-γR की कमी प्राप्तकर्ता चूहों में विज्ञापन lacZ के यकृत संक्रमण और जिगर transgene अभिव्यक्ति विज्ञापन lacZ समूह में एक्स लड़की धुंधला द्वारा सत्यापित लेकिन नहीं के रूप में विज्ञापन IFN-γ समूहों में पहले 17 में वर्णित किया गया. के प्रणालीगत अभिव्यक्ति IFN-γ सीरम में 120-150 एनजी / 3 दिन मिलीग्राम की एक स्तर पर खोजा गया था और में 5 सप्ताह तक बरकरार रखा विज्ञापन IFN-γ लेकिन नहीं lacZ समूह में. Aortas 5 हफ्तों ऊतकीय विश्लेषण और धमनी भ्रष्टाचार intima, मीडिया, लुमेन और पोत क्षेत्र के morphometric मूल्यांकन के लिए adenovirus के बाद इंजेक्शन पर काटा गया. की अभिव्यक्ति IFN-γ, लेकिन नहीं lacZ नियंत्रण, प्रेरित neointimal गठन. Leukocytes की कोई स्पष्ट घुसपैठ allograft मॉडल (चित्रा 2B) की तुलना में खोजा गया था. ये आंकड़े पिछले के साथ संगत कर रहे हैंअकेले IFN-γ neointima गठन को 15, 17 को उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है कि humanized माउस xenograft मॉडल में टिप्पणियों.

चित्रा 1
चित्रा 1. चित्रण और माउस allograft धमनी प्रत्यारोपण मॉडल की योजना. Allograft प्रत्यारोपण प्रक्रिया के ए एक उदाहरण. दाता पुरुष वक्ष महाधमनी का एक खंड शल्य चिकित्सा द्वारा एक महिला प्राप्तकर्ता में उदर महाधमनी में interposed था. Aortas 4 हफ्तों के बाद प्रत्यारोपण पर काटा गया. एक नियंत्रण के रूप में, पुरुष दाता वक्ष महाधमनी के एक खंड शल्य चिकित्सा एक पुरुष प्राप्तकर्ता में एक उदर महाधमनी में interposed था. बी. Elastica वैन Gieson (EVG), एच ई और विरोधी एक-SMA और विरोधी CD45 के साथ immunostaining द्वारा धमनी grafts के histological विश्लेषण. प्रतिनिधि photomicrographs दिखाए जाते हैं. तीर मीडिया से intima चित्रित करने के लिए आंतरिक लोचदार लामिना निशान. पैमानाबार: 50 मिमी. कोई भ्रष्टाचार धमनीकाठिन्य पुरुष समूह में पुरुष में मनाया गया.

चित्रा 2
चित्रा 2. IFN-γ प्रेरित माउस syngeneic धमनी प्रत्यारोपण मॉडल. ए IFN-γ प्रेरित माउस syngeneic मॉडल की एक योजना. पुरूष दाता वक्ष धमनी पुरुष प्राप्तकर्ता IFN-γR को चूहों में विच्छेदित और उदर महाधमनी में प्रत्यारोपित किया गया था. एक सप्ताह के बाद सर्जरी, 1x10 9 pfu विज्ञापन mIFN-γ या विज्ञापन lacZ गले नस के माध्यम से प्राप्तकर्ता चूहों में इंजेक्ट किया गया था. सीरम दिन 3, 7 और 35 IFN-γ माप के लिए वायरस के बाद इंजेक्शन पर एकत्र किया गया था. Grafts morphometric मूल्यांकन के लिए 6 सप्ताह काटा गया. बी. विरोधी एक-SMA और विरोधी CD45 के साथ immunostaining द्वारा धमनी grafts के histological विश्लेषण. प्रतिनिधि photomicrographs दिखाए जाते हैं. तीर मीडिया से intima चित्रित करने के लिए आंतरिक लोचदार लामिना निशान. स्केल खगिरफ्तारी: 50 मिमी. कोई भ्रष्टाचार धमनीकाठिन्य lacZ समूह में मनाया गया.

कदम समस्या संभावित कारण समाधान
2.17 गंभीर रक्तस्राव अंतर (दो टांके के बीच की दूरी) बाधित टांके का विशेष रूप से, बहुत बड़ा है. हर दो टांके के बीच की दूरी सम्मिलन के दौरान एक समान होना चाहिए.
साइट खून बह रहा है पर एक सिलाई जोड़ें.
केवल बाह्यकंचुक सिले है. पहचान करना और पूरे महाधमनी दीवार सिलाई
Unligated लकड़ी शाखाओं लकड़ी शाखाओं ligating
बहुत ज्यादा हेपरिन का प्रयोग 4 से ऊपर का उपयोग0 मिलीग्राम / किग्रा heparinized (100 यू / एमएल) के सम्मिलन के दौरान शल्य चिकित्सा के क्षेत्र की सिंचाई करने के लिए खारा समाधान.
2.19 घनास्त्रता लुमेन सतत टांके का विशेष रूप से, anastomotic साइट पर भी संकीर्ण है. प्रत्येक सिलाई में भी कई महाधमनी दीवार anastomosing बचें.
माउस का महाधमनी आकार बहुत छोटा है. सम्मिलन के दौरान सिलाई के लिए भी कई महाधमनी दीवार बहरहाल, सिलाई करने के लिए बहुत कम महाधमनी दीवार गंभीर खून बह रहा में परिणाम होगा, लुमेन संकीर्ण और घनास्त्रता कारण होगा.
विपरीत दिशा में महाधमनी दीवार के माध्यम से सिवनी पास. महाधमनी दीवार की पहचान करना और फिर टांके बनाने. ऐसा हुआ, तो ऑपरेटर को इस साइट पर सीवन गाँठ और फिर सिलाई में कटौती करनी चाहिए.
Endothelial कोशिकाओं सम्मिलन के दौरान घायल हो गए हैं. सम्मिलन के लिए प्रवास के टांके का उपयोग करना. के द्वारा पूरे arotic दीवार निचोड़ / पकड़ नहीं हैसम्मिलन के लिए CEPS.
हेपरिन सम्मिलन के दौरान इस्तेमाल नहीं किया जाता है. माउस का महाधमनी आकार बहुत छोटा है. यह सम्मिलन के बाद ग्राफ्ट में घनास्त्रता गठन के लिए बहुत आसान है. शल्य चिकित्सा के क्षेत्र की सिंचाई की हेपरिन देते घनास्त्रता को कम करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. चूहों में पोत प्रत्यारोपण की सफलता की दर हेपरिन का उपयोग किए बिना 50% के आसपास और हेपरिन उपयोग करने के साथ 95-100% है.
घनास्त्रता कुछ ही मिनटों के भीतर पाया जाता है तो रक्त प्रवाह, घनास्त्रता दूर करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण की बहाली के बाद IVC के माध्यम से 30-50 उल heparinied नमकीन घोल (100 यू / एमएल) इंजेक्षन है. सिर्फ गंभीर रक्तस्राव के मामले में बहुत ज्यादा हेपरिन इंजेक्षन मत करो.
2.23 ट्रांसप्लांटेशन में विफल रहा है विलंबित खून बह रहा है और घनास्त्रता, या दूसरों माउस का महाधमनी आकार बहुत छोटा है के लिए चूहों में पोत प्रत्यारोपण बहुत कठिन सर्जरी है. तीन प्रमुख poi कर रहे हैंसफल सर्जरी के लिए एनटीएस: 1) मेजबान और दाता की महाधमनी दीवारों सिर्फ गंभीर रक्तस्राव के मामले में, जाहिर अंतराल के बिना एक साथ anastomosed रहे हैं सुनिश्चित करें, बस घनास्त्रता के मामले में, anastomotic स्थल पर पर्याप्त लुमेन अंतरिक्ष रखने 2), 3) का उपयोग करें सम्मिलन के दौरान एक सही खुराक में हेपरिन, घनास्त्रता और गंभीर रक्तस्राव की बस के मामले में. इस प्रोटोकॉल के बाद, लेखक के लिए सफलता की दर 95% से अधिक है.

तालिका 1. तालिका समस्या निवारण.

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Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल माउस जीए मॉडल पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. प्रक्रियाओं अन्य भ्रष्टाचार प्रत्यारोपण के मॉडलों के लिए लागू किया जा सकता है. इन मॉडलों humanized xenograft (यानी मानव कोरोनरी धमनी क्षेत्रों immunodeficient चूहों की बुनियादी गुर्दे aortae में interposed), और तीव्र अस्वीकृति माउस जीए मॉडल (यानी एक और आनुवंशिक तनाव प्राप्तकर्ता में एक आनुवंशिक तनाव से एक माउस महाधमनी) शामिल हैं. हमारे वर्णित माउस मॉडल मानव जीए घावों को बंद करने के लिए और अधिक कर रहे हैं. पहला मॉडल एक पुरुष माउस से ही सहज तनाव (C57BL/6J) की एक महिला प्राप्तकर्ता में एक पोत खंड के बीच - बचाव करना शामिल है. इस मामले में भ्रष्टाचार अस्वीकृति वाई गुणसूत्र (पुरुष में मौजूद है लेकिन महिला नहीं) और कई सप्ताह 2, 6 के लिए दाता व्युत्पन्न चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की रक्षा करने के लिए पर्याप्त रूप से अकर्मण्य है कि ensues अस्वीकृति प्रतिक्रिया द्वारा इनकोडिंग मामूली उतक अनुरूपता प्रतिजनों के खिलाफ ही निर्देश दिया है , 8-10, 12, 14. दूसरे मॉडल एक धमनी segme interposing शामिलIFN-γ (IFN-γR-को) के लिए रिसेप्टर का अभाव है कि एक ही तनाव और लिंग के एक मेजबान माउस में एक जंगली प्रकार C57BL/6J माउस दाता से NT के माउस के प्रशासन द्वारा पीछा IFN-γ (माउस के संक्रमण के माध्यम से वितरित एक adenoviral वेक्टर साथ जिगर.) कर दाता और प्राप्तकर्ता चूहों दोनों ही तनाव और लिंग के होते हैं, लेकिन मेजबान व्युत्पन्न कोशिकाओं, इस साइटोकाइन के लिए रिसेप्टर की कमी है, जबकि दाता चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं साइटोकाइन के जवाब में पैदा करना ही इस मामले में कोई अस्वीकृति है, 21 अनुत्तरदायी हैं. इसके अलावा, पोत दाता में अतिरिक्त आनुवंशिक परिवर्तन backcrossing द्वारा, दोनों मॉडलों IFN-γ संचालित चिकनी पेशी सेल प्रसार और जीए प्रगति पर विशेष जीन के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

माउस जीए मॉडल में IFN-γ की भूमिका अच्छी तरह से स्थापित नहीं किया गया है. हमारे दो माउस मॉडल माउस जीए में IFN-γ की भूमिका सत्यापित किया है. पहला मॉडल में, एक पुरुष दाता महाधमनी महिला प्राप्तकर्ता में प्रत्यारोपित किया जाता हैमेजबान ग्राफ्ट 12 पर व्यक्त पुरुष विशेष के मामूली उतक अनुरूपता प्रतिजन हरियाणा के खिलाफ alloreactive टी सेल की मध्यस्थता alloimmune प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करता है ताकि. दरअसल, C57BL/6J महिला प्रत्यारोपण प्रेरित जीए को डब्ल्यूटी (C57BL/6J) पुरुष, leukocytes और VSMC संचय के साथ neointima गठन की घुसपैठ की विशेषता. इसके विपरीत, पुरुष महाधमनी प्रत्यारोपण के लिए पुरुष जीए प्रेरित नहीं करता. हम की भूमिका निर्धारित IFN-γ गुम्मट महिला प्राप्तकर्ता को प्रत्यारोपित दाता भ्रष्टाचार के रूप में IFN-γR-KO का उपयोग करके संवहनी कोशिकाओं में संकेत. दाता grafts में IFN-γR का विलोपन neointima में ल्युकोसैट घुसपैठ और VSMC संचय पा लिया. इसलिए, मौजूदा माउस मॉडल में IFN-γ की भूमिका humanized माउस xenograft प्रत्यारोपण के मॉडल के साथ संगत है, जहां IFN-γ भ्रष्टाचार में संकेत जीए प्रगति 4, 15, 17, 18 के लिए महत्वपूर्ण है. IFN-γ अकेले एक IFN-γ-दवा बनाकर neointima गठन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है अगर हम निर्धारितपैदा माउस syngeneic भ्रष्टाचार धमनीकाठिन्य मॉडल. इस मॉडल में, एक पुरुष महाधमनी एक पुरुष IFN-γR-KO प्राप्तकर्ता पशु में प्रत्यारोपित किया जाता है, जिसमें माउस IFN-γ तो प्रणालीबद्ध IFN-γ transgene (विज्ञापन IFN-γ माउस एन्कोडिंग प्रतिकृति की कमी adenovirus के नसों में इंजेक्शन द्वारा व्यक्त की है ). हम IFN-γ, लेकिन नहीं lacZ नियंत्रण, प्रेरित neointimal गठन की कि अभिव्यक्ति मनाया. इस मॉडल में, leukocytes की कोई स्पष्ट घुसपैठ, allograft मॉडल की तुलना में अकेले संवहनी IFN-γ संकेत leukocytes के अभाव में neointima गठन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है, जिसमें एक मानव धमनी-SCID माउस प्रत्यारोपण मॉडल में पिछले टिप्पणियों के साथ संगत का पता चला है 15, 17.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम WM और भंडारण के लिए अहा 9320033N लिए एनआईएच अनुदान R01 HL109420 द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 000664 Donor (5 weeks)
Recipient (8-12weeks)
Ketamine Hydrochloride Injection Hospira Inc. NDC 0409-2053 Storage Solution(50 mg/ml)
Working Solution(5 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution Lloyd Inc. NADA# 139-236 Storage Solution(100 mg/ml)
Working Solution(1 mg/ml)
Ketoprofen Fort Dodge Animal Health NDC 0856-4396-01 Storage Solution(100 mg/ml)
Working Solution-oral
(0.027 mg/ml)
Heparin Sodium Sagent Pharmaceticals NDC 25021-400 Storage Solution(1000 U/ml)
Working Solution(100 U/ml)
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) CareFusion AL4109
0.9% Sodium Chloride Injection Hospira Inc. NDC 0409-4888-10 To prepare the anesthetic
Petrolatum Ophthalmic Ointment Dechra Veterinary Products NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads Triad Disposables, Inc. NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads McKesson Corp. NDC 68599-5805-1
Microscope Leica MZ95
Micro Scissors Roboz Surgical Instrument Co. RS-5693
Spring Scissors F.S.T 15009-08 To transect the aorta of donor or recipient
Extra Narrow Scissors F.S.T 14088-10
Needle Holder/Forceps MICRINS MI1542 To hold the needle
Fine Forceps F.S.T 11254-20
Forceps F.S.T 11251-35
Standard Pattern Forceps F.S.T 11000-12
Forceps F.S.T 13011-12
LANCASTER Eye Speculum Zepf Medical Instruments 42-1209-07
Micro Vascular Clip Roboz Surgical Instrument Co. RS-6472
Micro Clip Applying Forceps With Lock Roboz Surgical Instrument Co. RS-5440
Black Polyamide Monofilament Suture AROSurgical Instruments Corporation Cat #T4A10Q07 10-0 suture, Needle=70 microns
Black Monofilament Nylon Suture Syneture
(Covidien)		 SN-1956 6-0 suture
Non-Woven Songes McKesson Corp. Reorder No. 94442000
1 ml Syringe BD REF 309659
3 ml Syringe BD REF 309657
10 ml Syringe BD REF 309604
18G 1 1/2, Hypodermic Needle BD REF 305196
25G 7/8, Hypodermic Needle BD REF 305124
27G 1/2, Hypodermic Needle BD REF 305109
30G 1/2, Hypodermic Needle BD REF 305106
Hearting Pad Sunbeam Z-1228-001
Trimmer Wahl 9854-500
Table 2. Specific reagents and equipment.

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References

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Qin, L., Yu, L., Min, W. Mouse Models for Graft Arteriosclerosis. J. Vis. Exp. (75), e50290, doi:10.3791/50290 (2013).

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