Summary
Se describen protocolos para nuestros arteriosclerois de injerto de ratón (GA) modelos que implican la interposición de un segmento de vaso del ratón en un receptor de la misma cepa endogámica. Por retrocruzamiento de cambios genéticos adicionales en el recipiente de donante, el modelo se puede evaluar el efecto de los genes específicos en GA.
Abstract
Arteriosclerois injertados (GA), también llamados vasculopatía del injerto, es una lesión patológica que se desarrolla durante meses a años en los órganos trasplantados se caracterizan por la estenosis difusa, circunferencial de todo el árbol vascular del injerto. El componente más crítico de GA patogénesis es la proliferación de células de músculo liso como dentro de la íntima. Cuando un segmento de la arteria coronaria humana se interpone en la aorta infra-renal de ratones inmunodeficientes, las intimas podrían expandirse en respuesta a las células T humanas transferidas adoptivamente alogénico para el donante arteria o exógeno humano IFN-γ en ausencia de células T humanas. La interposición de una aorta de ratón a partir de una cepa a otra cepa de ratón receptor se limita como un modelo para el rechazo crónico en los seres humanos debido a la respuesta de rechazo celular agudo mediado en este modelo de ratón elimina por completo todas las células vasculares derivadas del donante del injerto dentro de dos-tres semana. Recientemente hemos desarrollado dos nuevos mOuse modelos para evitar estos problemas. El primer modelo consiste en la interposición de un segmento de vaso de un ratón macho en una hembra receptora de la misma cepa endogámica (C57BL/6J). El rechazo del injerto en este caso sólo se dirige contra antígenos menores de histocompatibilidad codificado por el cromosoma Y (presente en el macho, pero no la hembra) y la respuesta de rechazo que se produce es suficientemente indolente para conservar las células musculares lisas derivadas del donante durante varias semanas. El segundo modelo consiste en la interposición de un segmento de la arteria de un tipo salvaje C57BL/6J donante ratón en un ratón de acogida de la misma cepa y género que carece del receptor de IFN-γ seguido de la administración de ratón IFN-γ (entregado a través de la infección de ratón hígado con un vector adenoviral. No hay rechazo en este caso como donante y ratones receptores son de la misma cepa y género pero las células del músculo liso donantes proliferan en respuesta a la citoquina mientras que las células derivadas del huésped, que carecen del receptor deesta citocina, no responden. Por retrocruzamiento de cambios genéticos adicionales en el recipiente de donante, ambos modelos pueden ser utilizados para evaluar el efecto de los genes específicos en la progresión de GA. A continuación, se describen los protocolos detallados para nuestros modelos GA ratón.
Introduction
Arteriosclerois injertados (GA), también llamados vasculopatía del injerto, es una lesión patológica que se desarrolla durante meses a años en los órganos trasplantados se caracterizan por la estenosis difusa, circunferencial de todo el árbol vascular del injerto 7. Las etapas iniciales pueden causar estenosis excéntricas y focal que son más evidentes en las arterias, por lo tanto se asemeja más estrechamente estenosis visto en la aterosclerosis convencional. La pérdida de lumen de los vasos de injerto resultados de la expansión la íntima debido a la infiltración de células T del huésped y de los macrófagos y, especialmente, a la acumulación de matriz extracelular y de músculo liso como las células se originó a partir del injerto, principal o con ambos 5, 13, 19, que se compensa adecuadamente por el remodelado vascular hacia el exterior. En aloinjertos cardíacos, las lesiones clínicamente más significativos son los de las arterias coronarias epicárdicas y intramiocárdica. En última instancia, GA de las arterias coronarias se causar insuficiencia cardíaca isquémica. GA es la causa principal de la tarde gr cardiacapérdida de popa. Las estenosis de GA se detienen en las líneas de sutura, lo que implica fuertemente la respuesta del huésped a aloantígenos injerto en su patogenia y que nos lleva a clasificar GA como una forma de rechazo crónico 3. Sin embargo, otras formas de lesión arterial pueden aumentar el riesgo de GA, ya sea mediante el aumento de la carga neta de la lesión o mediante la intensificación y / o modulación de la respuesta aloinmune. La célula (CE) revestimiento endotelial de las arterias del injerto se conserva en GA humana y las regiones más superficiales de la íntima adyacente al forro de CE es el sitio más fuertemente infiltrado por el anfitrión derivado de IFN-γ-la producción de células T y macrófagos 11; en algunos pacientes GA se asocia con el desarrollo de aloanticuerpos donante-específicos que se unen a injerto CE 16 pero los vasos muestran poca evidencia de la necrosis fibrinoide que es característica de rechazo agudo mediado por anticuerpos 11.
El componente más crítico de GA patogénesis es laproliferación de células de músculo liso, como en la íntima, y si este proceso puede ser detenido, GA es poco probable que el progreso. Trabajos previos de nuestro grupo ha demostrado que intimas de segmentos de la arteria coronaria humana interpuestos en las aortas infra-renal de ratones inmunodeficientes se expanden en respuesta a transferidas adoptivamente células T humanas alogénicas para el donante arteria y que este proceso podría ser inhibida mediante la neutralización de IFN- γ 18. Además exógena de IFN-γ humano podría causar la íntima (y medial) la proliferación de células del músculo liso (VSMC) vascular en estos injertos arteriales en la ausencia de células T humanas 15, 17. (Es importante tener en cuenta que el ser humano y el ratón IFN-γ no se cruzan las especies, descartando los efectos indirectos en el host del ratón en este sistema experimental.) Estos modelos de ratón humanizado tienen el beneficio de recapitular humana de células T / interacciones de las células vasculares y la íntima Las lesiones se componen en gran parte de las células humanas (es decir injerto derivado),como se ha observado en muestras clínicas, pero no completamente recapitular la situación clínica porque ignoran el papel de los macrófagos de acogida y posiblemente otros tipos de células que intervienen en las lesiones de trasplantes clínicos. Un modelo de ratón convencional de este proceso podría teóricamente frente a este problema, como complemento de las limitaciones del modelo humanizado mediante la participación de un sistema inmune del huésped completa y proporcionar la ventaja adicional de permitir que el poder de enfoques genéticos de ratón para ser aplicado a GA. Los dos modelos de ratón más utilizados incluyen el trasplante heterotópico de corazón y la arteria trasplante ortotópico 1. Las lesiones que se desarrollan en las arterias de los injertos de corazón heterotópico están mayoritariamente compuestas de células huésped, probablemente de origen de médula ósea, mientras que las células de la íntima de las arterias en los injertos de corazón humano son en su mayoría de origen injerto de 5, 13, 19. Esta es una distinción importante que ha llevado a desarrollar modelos alternativos de ratón. Interposición deuna aorta de ratón a partir de una cepa a otra cepa de ratón receptor es aún más limitado como un modelo para el rechazo crónico en los seres humanos debido a la respuesta de rechazo mediado por células aguda en este modelo de ratón elimina por completo todas las células vasculares derivadas del donante del injerto dentro de dos-tres semana 19. En consecuencia, los cambios subsiguientes visto en el segmento de vaso interpuesta son únicamente una respuesta de las células huésped que han repobladas la descelularizado recipiente de andamio, la creación de una situación altamente artefactual de importancia limitada como un modelo para los cambios en los vasos de injerto que se producen en la clínica. Hemos desarrollado recientemente dos nuevos modelos de ratón para eludir estos problemas 21. El primer modelo consiste en la interposición de un segmento de vaso de un ratón macho en una hembra receptora de la misma cepa endogámica (C57BL/6J). El segundo modelo consiste en la interposición de un segmento de la arteria de un tipo salvaje C57BL/6J donante ratón en un ratón de acogida de la misma cepa y género que carece de la receptor de IFN-γ (IFN-γR-KO), seguido por la administración de IFN-γ de ratón (se entrega a través de la infección del hígado de ratón con un vector adenoviral. A continuación, describimos protocolos detallados y las ventajas de nuestros modelos GA ratón.
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Protocol
Ratón del injerto y modelo de trasplante de injerto singénico
Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y comités de uso de la Universidad de Yale. Para el modelo de aloinjerto, segmentos de aorta torácica de macho, 4-5 semanas de edad WT (C57BL/6J) o ratones IFN-γR-KO se interponen en la aorta abdominal de la hembra receptora, 8-12 semanas de edad WT utilizando un extremo a -end anastomosis microquirúrgica técnica (véase el siguiente para más detalles). Para el modelo de injerto singénico, los segmentos de la aorta torácica, 4-5 semanas de edad, los ratones WT macho se interponen en la aorta abdominal del macho, 8-12 semanas de edad IFN-γR1-KO con un extremo-a-extremo microquirúrgico técnica anastomótica. En 1 semana después de la cirugía, los animales fueron inoculados intravenosamente con Ad5.CMV-ratón IFN-γ o Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) a 1 x 10 9 PFU. Suero de ratón IFN-γ niveles se midieron por ELISA (eBioscience) a 1 y 5 semanas después de la administración de adenovirus. Algunos animales recibieron BrdU(Sigma-Aldrich) a 100 mg / kg sc durante 2 semanas antes del sacrificio.
End-to-end anastomosis microquirúrgica técnica (Video se tomará para esta parte):
1. Procedimiento de Donantes
- Anestesiar a los ratones donantes con inyecciones intraperitoneales de ketamina (50 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg).
- Después de asegurarse de anestesia adecuada, colocar los ratones donantes bajo el microscopio de operación en X8-30 magnificación en una bandeja en una posición supina, y el uso de yodo cojín de la preparación y alcohol cojín de la preparación para la preparación de la pared torácica.
- Una incisión en la pared anterior del tórax a través de las costillas y el diafragma para exponer el corazón.
- Abra la aurícula derecha, inyectar 10 ml de heparina (100 U / ml) de solución salina en el ventrículo izquierdo para eliminar los ratones usando una jeringa de 10 ml con una aguja de calibre 25.
- Resecar el corazón y los pulmones para exponer toda la longitud de la aorta torácica.
- Disección de la aorta torácica con cuidado para minimizar el trauma directo, while identificar, ligar y dividir las ramas de madera con 11-0 sutura cerca de la aorta.
- Una vez que la aorta torácica está libre de tejido circundante, especiales toda la aorta torácica para el trasplante.
- Enjuague el extremo cortado de la aorta de donantes con heparinizada (100 U / ml) solución salina, y almacenarla en la misma solución en hielo (hasta 6 horas) hasta el trasplante.
2. Procedimiento destinatario
- Inyectar los ratones receptores con ketoprofeno IP (5 mg / kg) para la analgesia, y thenanesthetize los ratones con ketamina IP (50 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Los ratones receptores se anestesiaron profundamente dentro de los 10 minutos por una duración de 60 a 90 min. Durante la cirugía, el nivel de anestesia se evalúa cada 15 min por pellizcar la pared abdominal anterior o el pie usando fórceps. Si el animal reacciona a los estímulos nocivos en cualquier momento durante la cirugía, una dosis adicional de ketamina y xilazina (1/4 o 1/3 de la dosis inicial) será administrado por sc o im
- Después de asegurarse de anestesia adecuada, rapó el pelo en la pared abdominal anterior con una máquina de afeitar eléctrica, limpie la piel con yodo Prep Pad y Alcohol Prep Pad, cubra los ojos con ungüento oftálmico. Durante la cirugía, las siguientes técnicas asépticas se utilizarán para las operaciones, incluyendo la limpieza de la mesa de operaciones con 10% de lejía, el uso de guantes estériles y el uso de instrumentos de microcirugía esterilizados (instrumentos de vapor-esterilizados para el inicio de la operación, a continuación, de vidrio caliente del grano-esterilizada instrumentos entre múltiples operaciones, etc.)
- Coloque los ratones receptores bajo el microscopio de operación con un aumento de X8-30 en una bandeja en una posición supina.
- Una incisión en la pared abdominal en la línea media de xifoides hasta el pubis, y la propagación de la pared abdominal, aparte utilizando un micro-retractor para exponer la cavidad abdominal.
- Retirar el intestino superior y envolver con una gasa humedecida con solución salina. Los ratones receptores se congelan por la pérdida de la Ley de Educación Superiort externalizados a través de los intestinos. Es importante mantener el calor animal. Sin embargo, la placa de calefacción no se utiliza durante la cirugía como modesta hipotermia es de beneficio en la prevención de lesión de la médula durante la oclusión del flujo sanguíneo aórtico, así como no hay transferencia de calor ineficiente con el flujo sanguíneo ausente a la mitad inferior del cuerpo de los ratones.
- Mueva los órganos reproductivos inferiormente, envuelva las áreas del abdomen de ratones receptores con una gasa con solución salina solución humedecido, y lo utilizan para retraer el recto hacia el lado derecho del abdomen. Los tejidos expuestos se riegan periódicamente con una solución salina durante el trasplante.
- Diseccionar sin rodeos un segmento de la aorta infrarrenal entre el vaso renal proximal y distalmente bifurcación aórtica y separarse de la vena cava inferior (IVC) cuidadosamente.
- Identificar y ligar todas las ramas pequeñas provenientes de este segmento de la aorta abdominal con sutura monofilamento de poliamida 11-0.
- Pinzamiento del segmento aislado de unaaorta bdominal utilizando dos pinzas vasculares aproximadamente 5 mm aparte, uno en cada extremo.
- Corte transversal de la aorta abdominal entre las pinzas afiladas utilizando micro-tijeras para crear los sitios de anastomosis.
- Resecar un pequeño segmento de la aorta abdominal (hasta 0,4 mm de longitud) de un extremo de corte seccionado la aorta receptor para alojar el injerto aórtico donante.
- Lave los segmentos de aorta entre las abrazaderas con solución salina heparinizada para eliminar la sangre residual. Los segmentos aórticos entre las abrazaderas y el donante de injerto aórtico se riegan periódicamente con heparinizada (100 U / ml) solución salina (hasta 40 ml / kg) durante la anastomosis.
- Corte transversal de ambos lados de la aorta de donantes con micro-tijeras afiladas para crear un injerto de segmento de 2,5 mm de longitud para el trasplante.
- Coloque el injerto aórtico donante en la posición ortotópica, anastomosis extremo proximal y distal del injerto del donante a la proximal y distal extremo cortado del destinatario de la aorta abdominal, respectivamente, con un extremo-tpatrón o de fondo utilizando 11-0 poliamida monofilamento de sutura.
- Para las suturas continuas, coloque las suturas a los 3 y nueve posiciones en primer lugar. Entre dos suturas de sujeción a cada lado del injerto, se anastomosan ambos bordes de corte en 3-4 puntos de sutura usando las suturas continuas, y atan las suturas continuas para pasar suturas con un nudo doble. Dado que ambas capas de cierre son continuas, el riesgo de dehiscencia se incrementa. El injerto aórtico de donantes debe ser de longitud adecuada para conectar proximal y distal extremo cortado del destinatario de la aorta abdominal.
- Para las suturas interrumpidas, la construcción de cuatro anastomosis en 3 y nueve posiciones en ambos lados del injerto en primer lugar, y anastomosis de ambos bordes de corte en 3-4 puntos de sutura entre dos suturas de sujeción a cada lado del injerto.
- Suelte la pinza distal para permitir que el flujo retrógrado en injerto, identificar los sitios de sangrado y hacer puntos adicionales a los 3 minutos.
- Después de comprobar la hemostasia satisfactoria, suelte la pinza proximal.
- Confirmar la permeabilidad del injerto por la presencia de la pulsación vigorosa en el injerto y el segmento adyacente proximal de la aorta abdominal nativa, en particular en el segmento adyacente distal de la aorta abdominal y la arteria mesentérica inferior. Considere la posibilidad de trombosis en sitios anastomóticas si la pulsación disminuye en unos pocos minutos después de la restauración del flujo sanguíneo.
- Volver los intestinos en la cavidad abdominal.
- Sutura cerrar la pared abdominal con sutura de nylon 5-0 en la capa muscular y la capa de la piel, respectivamente.
- Coloque los ratones receptores en una jaula limpia en la parte superior de una almohadilla de calefacción, y esperar 1-2 horas para los ratones para recuperar la conciencia y recuperarse de la anestesia. Es importante mantener el calor animal adecuada durante la recuperación. Mantener los ratones en la jaula cálido y seco antes de estela animales de la anestesia.
- Evaluación de la función motora de las extremidades posteriores después de la recuperación ratones, y de nuevo en el segundo día. Será confirmado una cirugía de trasplante con éxito if sin disfunción de las extremidades posteriores se observó en ratones receptores en el segundo día.
- Administrar los ratones receptores con ketoprofeno en el agua potable (5 mg / kg / d = 27 ug / ml en el agua potable) durante 48 horas. Si cualquier ratones receptores sufren de dolor no se alivia con los analgésicos postoperatorios como se evidencia por la pérdida de la movilidad, la ausencia de limpieza, agrupado postura anormal, etc, se practicó la eutanasia. Los animales se sacrificaron a los predefinidos puntos finales después de 1-60 días.
Análisis del injerto
Injertos de arteria de aloinjerto se adquirieron a las 4 semanas y de los injertos en el modelo de injerto singénico eran 6 semanas después de la operación (5 semanas después de la infección viral) y se analizaron mediante técnicas histológicas estándar para Gieson (EVG) tinción Elastica-furgoneta, hematoxilina y eosina (HE) tinción y la tinción de inmunofluorescencia. Las fotografías fueron tomadas con un sistema de microscopio de inmunofluorescencia (Zeiss). Recuento de células de núcleos rodeados por inmunotinción positiva era realizared con gran aumento y un promedio de 5 secciones para cada injerto. Las mediciones de área de injerto de la luz (en el endotelio), íntima (entre el endotelio y la lámina elástica interna, IEL), los medios de comunicación (entre el IEL y la lámina elástica externa, EEL), espesor de la pared (entre el endotelio y la lámina elástica externa) y el recipiente entero (dentro de la EEL) se calcula a partir de 5 secciones transversales de serie, 150 micras de distancia para cada injerto, utilizando el análisis de imagen asistido por ordenador y NIH Image 1.60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).
El análisis estadístico
Todos los datos se expresan como media ± SEM. Dos colas, pares de pruebas t y un análisis de dos vías ANOVA se realizaron con el programa de software Prism (GraphPad Software). Las diferencias con p <0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.
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Representative Results
Ratón modelo de aloinjerto de la arteriosclerosis (GA): En este modelo, una aorta macho donante se trasplanta en hembra receptora para que el host induce respuestas T alorreactivas aloinmunes mediadas por células contra un antígeno Y menor (el menor de histocompatibilidad HY antígeno específica de los machos) expresado en el injerto 12, y a su vez de las células T produce IFN-γ-unidades de la proliferación de VSMC 20 como se observa en otros modelos de trasplante de aloinjerto 2, 6, 8-10, 14. Un segmento de aorta torácica de un hombre donante se interpone quirúrgicamente en una aorta abdominal de un receptor hembra, y las aortas se cosecharon a las 4 semanas después del trasplante (Figura 1A). El análisis histológico de los injertos arteriales se realizó por Elastica-van Gieson (EVG), H & E y la inmunotinción con CMLV SMA marcador y marcador pan-leucocitario CD45. No se observó rechazo del injerto entre ratones machos C57BL/6J en el trasplante de la aorta. Macho a hembra Transplantatde iones inducida por GA, que se caracteriza por la infiltración de leucocitos y la formación de neoíntima con la acumulación de las CMLV (Figura 1B). Para determinar el papel del IFN-γ señalización en GA, aortas de WT o IFN-γR-KO ratones fueron trasplantados a la hembra receptora WT. Supresión de IFN-γR en injertos de donante mostró una infiltración reducida de leucocitos y la formación de neoíntima con la disminución de las células-SMA positivos en comparación con el WT (no se muestra). Estos resultados apoyan un papel crítico para IFN-γ de señalización en la progresión de GA como ya se observó en el trasplante de xenoinjerto de ratón humanizado modelo 4, 15, 17, 18.
La arteriosclerosis del injerto de IFN-γ inducida: Se ha establecido que el IFN-γalone es suficiente para inducir la formación de neoíntima en un modelo de ratón humanizado GA 15, 17. Aquí hemos establecido un modelo singénico arteriosclerosis injerto ratón IFN-γ mediada. En este modelo, se trasplantaron WT aortas masculinosen ratones receptores de IFN-γR-deficientes seguido de inyección intravenosa de adenovirus de replicación deficiente que codifica el ratón IFN-γ transgén (Ad-IFN-γ) o el gen LacZ de control (Ad-LacZ) (Figura 2A). Infección hepática y la expresión transgénica de hígado de Ad-LacZ se verificó por tinción con X-gal en el grupo Ad-LacZ, pero no las Ad-IFN-γ grupos a lo descrito previamente 17. Expresión sistémica de IFN-γ en el suero se detectó a un nivel de 120-150 ng / ml en el día 3 y se retiene hasta 5 semanas en el Ad-IFN-γ, pero no en el grupo de LacZ. Aortas fueron cosechadas a las 5 semanas después de la inyección de adenovirus para el análisis histológico y la evaluación morfométrica de la arteria del injerto íntima, la media, el lumen y el área del vaso. Expresión de IFN-γ, pero no el control LacZ, la formación de neoíntima inducida. No se detectó ninguna infiltración obvia de leucocitos en comparación con el modelo de aloinjerto (Figura 2B). Estos datos son consistentes con la anteriorobservaciones en el modelo de xenoinjerto de ratón humanizado que solo IFN-γ es suficiente para inducir la formación de la neoíntima 15, 17.
Figura 1. Ilustración y esquema de ratón aloinjerto arterial modelo de trasplante. A. Un ejemplo del procedimiento de trasplante de aloinjerto. Un segmento de aorta torácica de donantes masculinos fue interpuesta quirúrgicamente en la aorta abdominal en una hembra receptora. Aortas se cosecharon a las 4 semanas post-trasplante. Como control, un segmento de macho donante aorta torácica se interpone quirúrgicamente en una aorta abdominal en un receptor masculino. B. El análisis histológico de los injertos arteriales por Elastica-van Gieson (EVG), H & E y la inmunotinción con anti-a-SMA y anti-CD45. Se muestran fotomicrografías representativas. Puntas de flecha marcan la lámina elástica interna para delinear la íntima de la media. Escalabar: 50 mm. No se observó arteriosclerosis injerto de macho a macho del grupo.
Figura 2. Ratón singénico modelo de trasplante de la arteria IFN-γ inducida. A. Un esquema del modelo de ratón singénico IFN-γ inducida. Donante masculino arteria torácica se diseccionó y se trasplanta en la aorta abdominal en machos receptores de IFN-γR ratones KO. Una semana después de la cirugía, 1X10 9 ufp Ad-mIFN-γ o Ad-LacZ se inyectó en ratones receptores a través de la vena yugular. El suero se recogió en el día 3, 7 y 35 después de la inyección de virus para IFN-γ medición. Los injertos fueron cosechadas 6 semanas para la evaluación morfométrica. B. El análisis histológico de los injertos de arteria por inmunotinción con anti-a-SMA y anti-CD45. Se muestran fotomicrografías representativas. Puntas de flecha marcan la lámina elástica interna para delinear la íntima de la media. Escala bar: 50 mm. No se observó la arteriosclerosis del injerto en el grupo LacZ.
| Paso | Problema | Razón posible | Solución |
| 2.17 | Las hemorragias graves | El espacio de separación (distancia entre dos puntos de sutura) es demasiado grande, en particular de suturas interrumpidas. | La distancia entre cada dos puntos de sutura debe ser uniforme durante la anastomosis. Añadir una puntada a sangrar sitio. |
| Sólo se cose la adventicia. | Identificar y costura toda la pared de la aorta | ||
| Ramas de madera no ligados | La ligadura de las ramas de madera | ||
| El uso excesivo de heparina | Con hasta 40 ml / kg de heparina (100 U / ml) solución salina para irrigar el campo de la cirugía durante la anastomosis. | ||
| 2.19 | Trombosis | El lumen es demasiado estrecha en el sitio de la anastomosis, en particular, de las suturas continuas. | Evite anastomosis demasiados pared aórtica en cada puntada. El tamaño de la aorta de ratón es muy pequeña. Para puntada pared aórtica demasiados durante la anastomosis causará lumen estrecho y trombosis, sin embargo, a la puntada de la pared aórtica también menos dará lugar a hemorragia grave. |
| El pase de sutura a través de la pared aórtica en el lado opuesto. | La identificación de la pared de la aorta y luego hacer puntos. Si esto ocurriera, el operador debe cortar el nudo de sutura y re-puntada en este sitio. | ||
| Las células endoteliales son heridos durante la anastomosis. | Uso de las suturas de sujeción para la anastomosis. No sostenga / exprimir toda la pared por arotic paraceps de anastomosis. | ||
| La heparina no se utiliza durante la anastomosis. | El tamaño de la aorta de ratón es muy pequeña. Es muy fácil para la formación de trombosis en los injertos después de la anastomosis. Dando heparina para irrigar el campo de la cirugía es muy importante para la reducción de la trombosis. La tasa de éxito del trasplante en ratones recipiente es de alrededor de 50% sin el uso de heparina y 95-100% con el uso de heparina. Si se encuentra la trombosis dentro de unos minutos después de la restauración del flujo sanguíneo, un enfoque alternativo para eliminar la trombosis es inyectar 30-50 ul solución salina heparinied (100 U / ml) a través de la VCI. No se inyecte demasiada heparina en caso de hemorragia grave. | ||
| 2.23 | El trasplante no | Hemorragia y trombosis retardada, u otros | El recipiente de trasplante en ratones es muy difícil la cirugía para el tamaño de la aorta de ratón es muy pequeña. Hay tres poi clavetes para el éxito de la cirugía: 1) asegurarse de que las paredes de la aorta de acogida y de los donantes se anastomosan entre sí sin obviamente vacío, sólo en caso de hemorragia grave, 2) mantener suficiente espacio lumínico a anastomótica sitio, en caso de trombosis, y 3) el uso heparina en una dosis adecuada durante la anastomosis, en caso de trombosis y sangrado severo. Siguiendo este protocolo, la tasa de éxito para el autor es más del 95%. |
Tabla 1. Solución de problemas de mesa.
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Discussion
Los protocolos descritos se centran en modelos de ratón GA. Los procedimientos se pueden aplicar a otros modelos de trasplante de injerto. Estos modelos incluyen xenoinjertos humanizado (es decir, los segmentos de las arterias coronarias humanas interponen a la aorta infra-renal de ratones inmunodeficientes), y el modelo GA mouse rechazo agudo (es decir, una aorta del ratón de una cepa genética en otro destinatario línea genética). Nuestros modelos de ratón descritos son más para cerrar lesiones GA humanos. El primer modelo consiste en la interposición de un segmento de vaso de un ratón macho en una hembra receptora de la misma cepa endogámica (C57BL/6J). El rechazo del injerto en este caso sólo se dirige contra antígenos menores de histocompatibilidad codificado por el cromosoma Y (presente en el macho, pero no la hembra) y la respuesta de rechazo que se produce es suficientemente indolente para conservar las células musculares lisas derivadas del donante durante varias semanas 2, 6 , 8-10, 12, 14. El segundo modelo consiste en la interposición de una arteria segment de un tipo salvaje C57BL/6J donante ratón en un ratón de acogida de la misma cepa y género que carece del receptor de IFN-γ (IFN-γR-KO) seguido de la administración de ratón IFN-γ (entregado a través de la infección de ratón hígado con un vector adenoviral.) No hay rechazo en este caso como donante y ratones receptores son de la misma cepa y género pero las células del músculo liso donantes proliferan en respuesta a la citoquina mientras que las células derivadas del huésped, que carecen del receptor para esta citocina, no responden 21. Por otra parte, por retrocruzamiento de cambios genéticos adicionales en el recipiente de donante, ambos modelos pueden ser utilizados para evaluar el efecto de los genes específicos sobre la proliferación de células de músculo liso de IFN-γ-impulsada y la progresión GA.
El papel del IFN-γ en modelos de ratón GA no ha sido bien establecida. Nuestros dos modelos de ratones han comprobado el papel del IFN-γ en ratones GA. En el primer modelo, una aorta macho donante se trasplanta en hembra receptorapor lo que el host induce respuestas T aloinmunes mediadas por células alorreactivas contra el menor HY macho antígeno específico de histocompatibilidad expresado en los injertos 12. En efecto, WT (C57BL/6J) macho a hembra C57BL/6J inducida por el trasplante de GA, caracterizado por la infiltración de leucocitos y la formación de neoíntima con la acumulación de CMLV. Por el contrario, el trasplante de aorta macho a macho no induce GA. Se determinó el papel del IFN-γ señalización en las células vasculares mediante el uso de IFN-γR-KO como injerto donante trasplantado al receptor hembra WT. Supresión de IFN-γR en injertos de donante embota la infiltración de leucocitos y la acumulación de las CMLV en la neoíntima. Por lo tanto, el papel del IFN-γ en el modelo actual del ratón es consistente con el modelo de trasplante de xenoinjerto de ratón humanizado donde el IFN-γ de señalización en el injerto es crítica para la progresión de GA 4, 15, 17, 18. Se determinó si el IFN-γ por sí solo es suficiente para inducir la formación de la neoíntima mediante la creación de un IFN-γ-Medisyngeneic modelo de arteriosclerosis injerto ratón ATED. En este modelo, una aorta macho se trasplanta en un animal de IFN-γR-KO receptor masculina en la que el ratón IFN-γ a continuación, se expresa sistémicamente mediante inyección por vía intravenosa de los adenovirus de replicación deficiente que codifica el ratón IFN-γ transgén (Ad-IFN-γ ). Hemos observado que la expresión de IFN-γ, pero no el control LacZ, la formación de neoíntima inducida. En este modelo, no se detecta ninguna infiltración obvia de leucocitos en comparación con el modelo de aloinjerto, consistente con las observaciones anteriores en un modelo de trasplante de ratón SCID-arteria humana en la que vascular IFN-γ señalización por sí solo es suficiente para inducir la formación de neoíntima en ausencia de leucocitos 15, 17.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones R01 HL109420 de WM y AHA 9320033N a LY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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