Summary
Biz fare greft arteriosclerois (GA) aynı doğuştan gerginlik bir alıcıya bir fare damar segmentinin interpozisyonu içeren modeller için protokolleri tarif. Damar donör içine ek genetik değişiklikler geri melezlenmesine tarafından, model GA belirli genlerin etkisini değerlendirebilir.
Abstract
Ayrıca allogreft vaskülopatisi denir greft arteriosclerois (GA), tüm greft vasküler ağacın yaygın, çevresel darlığı ile karakterize nakledilen organlarda yıl ay içinde gelişen bir patolojik lezyondur. GA patogenezinde en önemli bileşeni intima içinde düz kas benzeri hücrelerinin çoğalması olduğunu. Bir insan koroner arter kademeli bir bağışıklık yetersizliği olan farelerde, infra-böbrek aortlarından içine yerleştirilmiş olduğunda, intimas arter verici veya eksojen insan IFN-γ insan T-hücrelerinin yokluğunda. Allojen adoptif transfer insan T hücrelerine karşılık olarak genişletmek mümkündür Bu fare modelinde, akut hücre kaynaklı red tepkisi tamamen iki üç içinde greft tüm verici türetilmiş vasküler hücrelerin ortadan kaldırır, çünkü başka bir fare suşu alıcıya bir suşundan bir fare aort araya girmesi insanlardaki kronik rejeksiyon için bir model olarak sınırlıdır hafta. Yakın zamanda iki yeni m geliştirdikBu sorunları aşmak için model Ouse. Birinci model, erkek fare, aynı kendilenmiş suşu (C57BL/6J) bir dişi alıcı bir kap kademeli bir araya girmesi içerir. Bu durumda greft reddi Y kromozomu (erkek mevcut ama kadın değil) ve birkaç hafta için donör kaynaklı düz kas hücreleri korumak için yeterince sessiz olduğu görüldüğünde bu red yanıtı tarafından kodlanan küçük doku uygunluk antijenleri karşı yalnızca yönlendirilir. İkinci model için reseptör yoksun aynı zorlanma ve cinsiyet bir dizi fare içine vahşi bir C57BL/6J fare verici bir arter segmenti interposing içerir IFN-γ fare uygulaması takip IFN-γ (fare enfeksiyon ile teslim bir adenoviral vektör ile karaciğer. donör ve alıcı fareler her ikisi de aynı gerginlik ve cinsiyet ama ev sahibi kaynaklı hücreleri, için reseptör eksik ise donör düz kas hücreleri sitokin yanıt olarak çoğalırlar bu durumda herhangi bir ret yokBu sitokin, tepkisiz. Damar donör içine ek genetik değişiklikler geri melezlenmesine tarafından, her iki modelde GA ilerlemesi belirli genlerin etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, bizim fare GA modelleri için ayrıntılı protokolleri tarif.
Introduction
Ayrıca allogreft vaskülopatisi denir greft arteriosclerois (GA), tüm greft vasküler ağacın 7 yaygın, çevresel darlığı ile karakterize nakledilen organlarda yıl ay içinde gelişen bir patolojik lezyondur. Erken evrelerde böylece daha yakından geleneksel ateroskleroz görülen darlık benzeyen, arterlerde daha açıkça görülür eksantrik ve odak darlığı neden olabilir. Nedeniyle ana T hücreleri ve makrofajlar infiltrasyonu ve özellikle hücre-dışı matris birikimi ve düz kas hücreleri gibi için intimal genişleme greft damarlarının lümeni kaybı yetersiz telafi edilir greft, bir ana bilgisayar veya her ikisi de 5, 13, 19, kaynaklanmıştır dışa gemi yeniden tarafından. Kardiyak allogreftlerin, en lezyonlar klinik olarak anlamlı epikardiyal ve intrakardiyak koroner arterlerde olanlardır. Sonuçta, koroner arterlerin GA iskemik kalp yetmezliği neden olur. GA geç kalp gr en önemli nedenidirkıç kaybı. GA darlığı güçlü patogenezinde greft aloantijenlerine ev sahibi tepki karıştığı ve bize kronik rejeksiyon 3 biçimi olarak GA sınıflandırmak yol açan, dikiş hatları durdurmak. Ancak, arter yaralanması diğer formları yaralanma net yükünü artırarak ya da yoğunlaştırılması ve / veya immün yanıt modüle yoluyla, GA riskini artırabilir. Greft arterlerin endotel hücre (EC) astar insan GA korunmuş ve AT astar bitişik intima en yüzeysel bölgelerinde en yoğun IFN-γ üreten T hücreleri ve makrofajlar 11 ana-türetilmiş tarafından sızmış site olduğunu, içinde GA greft EC 16 ama damarları bağlamak donör özel alloantikorların gelişimi ile ilişkili bazı hastalarda Akut antikor aracılı ret 11 özelliğidir fibrinoid nekroz çok az kanıt gösteriyor.
GA patogenezinde en önemli bileşeni olanintima içinde düz kas benzeri hücrelerinin çoğalması, bu süreci tutuklandı eğer, GA ilerleme pek mümkün değildir. Bizim gruptan önceki çalışma, insan koroner arter bölümlerinin intimas farenin bağışıklık yetersizliği olan bu işlem, arter donör allojen adoptif transfer insan T hücrelerine karşılık olarak genişletmek ve en alt böbrek aortlarından içine yerleştirilmiş olduğunu göstermiştir insan nötralize tarafından önlenebildi IFN- γ 18. Ayrıca dışsal insan IFN-γ (ve orta) insan T hücrelerinin 15, 17 yokluğunda, bu damar grefti, vasküler düz kas hücresi (VSMC) yayılması intimal neden olabilir. (Bu not önemli olduğunu insan ve fare IFN-γ. Bu deneysel sistemde fare ana bilgisayarda dolaylı etkilerini iktidar, türler arası yok) Bu beşeri fare modelleri insan T hücre / vasküler hücre etkileşimleri yansıtan yararına ve intimal lezyonların büyük ölçüde insan (yani graft türevi) hücreler oluşurgibi klinik örneklerde gözlenmiştir, ancak klinik nakli lezyonlar dahil taşıyıcı makrofajlar ve muhtemelen diğer hücre tipleri rolü göz ardı çünkü tam klinik durum özetlemek yoktur. Bu işlem, geleneksel bir fare modeli teorik olarak tam bir konak bağışıklık sistemini içeren ve GA uygulanacak fare genetik yaklaşımlar güç sağlayan ek avantaj sağlayarak hümanize modeli sınırlamaları tamamlayan, bu sorunu çözmek olabilir. Iki en yaygın olarak kullanılan fare modelleri heterotopik kalp nakli ve ortotopik arter nakli 1 içerir. Insan kalbi greft arterlerin intimal hücreler greft kökenli 5, 13, 19 ağırlıklı iken heterotopik kalp greft arterlerde geliştirmek lezyonlar büyük ölçüde, kemik iliği kökenli olasılıkla ev sahibi hücreleri, oluşur. Bu bize alternatif fare modelleri geliştirmek yol açmıştır önemli bir ayrımdır. Araya girmesiBu fare modelinde, akut hücre kaynaklı red tepkisi tamamen iki üç içinde greft tüm verici türetilmiş vasküler hücrelerde ortadan kaldırır, çünkü başka bir fare suşu alıcıya bir suşundan bir fare aort insanlardaki kronik rejeksiyon için bir model olarak daha da kısıtlı hafta 19. Sonuç olarak, bir araya giren kap kademeli görülen sonraki değişiklikler klinikte meydana greft damar değişiklikleri için bir model olarak uygunluğu sınırlıdır hayli yapısından durum oluşturmak Decellularized geminin iskele yeniden doldurulur olan konakçı hücrelerin sadece bir yanıt vardır. Yakın zamanda bu sorunların 21 aşmak için iki yeni fare modeli geliştirdik. Birinci model, erkek fare, aynı kendilenmiş suşu (C57BL/6J) bir dişi alıcı bir kap kademeli bir araya girmesi içerir. İkinci model rec yoksun aynı zorlanma ve cinsiyet bir dizi fare içine vahşi bir C57BL/6J fare verici bir arter segmenti interposing içerireptor için IFN-γ (IFN-γR-KO), fare uygulaması takip IFN-γ (bir adenoviral vektörü ile fare karaciğer enfeksiyonu ile teslim edilmiştir. Burada ayrıntılı protokoller ve fare modelleri GA avantajlarını açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fare allogreft ve singeneik greft nakli modeli
Tüm hayvan çalışmaları Yale Üniversitesi kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri tarafından onaylanmıştır. Allogreft modeli için, erkek, 4-5 haftalık WT (C57BL/6J) veya IFN-γR-KO fareler aorta segmentleri bir uçtan kullanarak kadın alıcı, 8-12 haftalık WT abdominal aort içine yerleştirilen edildi uç mikrocerrahi anastomoz tekniği (ayrıntılar için sonraki bakınız). Singeneik greft modeli için, erkek, 4-5 haftalık WT farelerden alınan göğüs aortlarından kesimleri erkek karın aortlarından içine yerleştirilmiş olan, eski 8-12 hafta IFN-γR1-KO uçtan uca mikrocerrahi anastomoz tekniği kullanılarak. Ameliyat sonrası 1 hafta, hayvanlar 1 x 10 9 PFU de Ad5.CMV-fare IFN-γ veya Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) ile iv ekildi. Serum fare IFN-γ düzeyleri 1 ELISA (eBioscience) tarafından ölçüldü ve 5 hafta adenovirüs uygulamadan sonra. Bazı hayvanlar BrdU aldıKurban önce 2 hafta içinde (Sigma-Aldrich), 100 mg / kg SC.
Uçtan uca mikrocerrahi anastomoz tekniği (Video bu bölümü için alınacaktır):
1. Donör Prosedürü
- Ketamin (50mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile donör farelerden anestezisi.
- Yeterli anestezi olduktan sonra, bir yatar pozisyonda bir tepsi üzerinde X8-30 büyütmede işletim mikroskop altında donör fareler yerleştirin ve göğüs duvarı hazırlanması için İyot Hazırlık Pad ve Alkol Hazırlık Pad kullanın.
- Kaburga ve kalp ortaya çıkarmak için diyafram ile göğüs ön duvarı İnsizyon.
- Sağ atrium açın, bir 25-gauge iğne ile 10 ml şırınga kullanarak fareler temizlemek için sol ventrikül içine heparinli 10 ml (100 U / ml) serum fizyolojik enjekte.
- Torasik aort tüm uzunluğu ortaya çıkarmak için kalp ve akciğer rezeke.
- Doğrudan travma, whil en aza indirmek için dikkatli bir şekilde torasik aorta incelemeke, tanımlamak Arter ve aort yakın 11-0 sütür kullanarak kereste dalları bölün.
- Bir kez torakal aort çevreleyen doku, nakli için tüketim tüm torasik aort içermez.
- (100 U / ml) heparinli serum fizyolojik ile donör aort kesik ucuna yıkayın ve nakli kadar buz üzerinde aynı çözümü (en fazla 6 saat) saklayın.
2. Alıcı Prosedürü
- Analjezi için ip ketoprofen (5 mg / kg) ile alıcı farelere enjekte edilir, ve ip ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile fareler thenanesthetize. Alıcı farenin 60-90 dakika kadar bir süre için 10 dakika içinde derin anestezi uygulanır. Ameliyat sırasında, anestezi düzeyi forseps kullanarak karın ön duvarı ya da yürüyerek kısma her 15 dakikada değerlendirilir. Hayvan ameliyat sırasında her zaman zararlı uyaranlara tepki ise, ketamin ve ksilazin (1/4 veya 1/3 orijinal doz) ek bir doz sc veya im tarafından idare edilecektir
- Yeterli anestezi olduktan sonra, bir elektrikli tıraş makinesi kullanarak karın ön duvarında kürk traş,, İyot Hazırlık Pad ve Alkol Hazırlık Pad kullanarak cilt temizlemek oftalmik merhem kullanarak göz kapağı. Ameliyat sırasında, aşağıdaki aseptik teknikler,% 10 çamaşır suyu ile ameliyat masasına temizlik steril eldiven ve steril mikrocerrahi aletleri (operasyonun başlaması için buharla sterilize aletler, sonra sıcak cam boncuk-sterilize kullanarak da dahil olmak üzere işlemleri için kullanılacak çoklu işlemleri, vb) arasında aletleri.
- Bir yatar pozisyonda bir tepsi üzerinde X8-30 bir büyütmede işletim mikroskop altında alıcı fareler yerleştirin.
- Xiphoid gelen pubis için orta hatta karın duvarı kesilirken, ve karın boşluğuna ortaya çıkarmak için bir mikro-retraktör kullanarak dışında karın duvarı yayıldı.
- Superior bağırsak geri çekin ve gazlı bez ile sarın serum fizyolojik ile nemlendirilmiş. Alıcı fareler İşitme kaybı ile soğutulmuş olurdışsallaşmış bağırsak yoluyla t. Bu hayvan sıcaklık korumak için önemlidir. Mütevazı hipotermi aortik kan akımı tıkanıklığı gibi farenin gövdesinin alt yarısına yok kan akımı ile verimsiz ısı transferi yoktur sırasında omurilik hasarın önlenmesinde yararlı olduğu gibi Ancak, ısıtma kartı ameliyat sırasında kullanılmaz.
- , Altta üreme organları hareket tuzlu-çözüm-nemlendirilmiş gazlı bez ile alıcı farelerin karın alanları sarın ve karnın sağ tarafına rektum geri çekmek için kullanabilirsiniz. Maruz kalan dokular nakli sırasında serum fizyolojik ile düzenli olarak sulanmaktadır.
- Distale açık açık böbrek proksimal gemi ve aort çatallanma arasında infrarenal aorta bir segment incelemek ve dikkatle inferior vena kava (IVC) ayrı.
- Belirlenmesi ve 11-0 Polyamid Monofilament dikiş kullanılarak abdominal aorta bu segmentte kaynaklanan küçük dalları tüm Arter.
- A çapraz kelepçe izole segmentidışında yakın nedeni 5 mm, her sonunda bir iki damar kelepçeler kullanarak bdominal aort.
- Anastomoz siteleri oluşturmak için keskin mikro-makas kullanarak kelepçeler arasındaki abdominal aort transect.
- Donör aort greft karşılamak için kesilen alıcı aort bir kesik ucundan abdominal aorta (uzunluk en fazla 0.4 mm) küçük bir kesimi rezeke.
- Kan artıkları çıkarmak için heparinli serum fizyolojik ile kelepçeler arasındaki aort segmentleri yıkayın. Kelepçeler ve donör aort greft arasındaki aort segmentleri anastomoz sırasında heparinize (100 U / ml) serum fizyolojik (en fazla 40 ml / kg) ile periyodik olarak sulanmaktadır.
- Nakli için uzunluğu 2.5 mm bir segment greft oluşturmak için keskin mikro-makas ile donör aort her iki transect.
- Bir son-t, sırasıyla ortotopik konumu, abdominal aort alıcının proksimal ve distal kesik ucuna anastomoz donör greft en yakın ve uzak uç, en donör aort greft yerleştirin11-0 Polyamid Monofilament dikiş kullanarak o uç desen.
- Sürekli dikişler için, konaklama 3 de dikiş ve öncelikle 09:00 pozisyonları yerleştirin. Greft her iki tarafında iki konaklama sütür arasında anastomoz kesme çalışan dikiş kullanarak 3-4 dikiş kenarları, ve her ikisi de çift düğüm ile dikiş kalmak için çalışan sütür kravat. Kapağın her iki tabaka sürekli olduğu, ayrılma riski artar. Donör aort greft abdominal aortun alıcının proksimal ve distal kesik ucunu bağlamak için uygun uzunlukta olmalıdır.
- Kesintiye dikişler için, 3 dört anastomoz inşa ve öncelikle greft her iki tarafında 9 hizasında ve greft her iki tarafında iki konaklama sütür arasında 3-4 dikiş hem kesim kenarları anastomoze.
- Greft içine retrograd akışına izin vermek için distal kelepçe bırakın, kanama siteleri belirlemek ve 3 dakika içinde ek dikiş yapmak.
- Tatmin edici hemostaz olduktan sonra, proksimal kelepçe bırakın.
- Abdominal aorta ve inferior mezenterik arter distal komşu segmentinde özellikle, greft içinde güçlü nabız varlığı ve yerli abdominal aort proksimal komşu segment greft açıklığı onaylayın. Nabız kan akımının restorasyon sonra birkaç dakika içinde azalır eğer anastomoz sitelerinde tromboz düşünün.
- Karın boşluğuna bağırsak dönün.
- Sırasıyla, kas tabakası ve deri tabakasında 5-0 Naylon sütür kullanarak karın duvarı kapatmak dikin.
- Bir ısıtma yastığı üstüne temiz bir kafes içine alıcı fareler yerleştirin ve bilinç kazanmak ve anestezi kurtarmak için fareler için 1-2 saat bekleyin. Bu kurtarma sırasında hayvanın yeterli sıcaklık korumak için önemlidir. Anestezi hayvan ardından önce sıcak ve kuru kafeste fareler tutun.
- Fareler kurtarma sonra, tekrar ikinci gününde arka ekstremite motor fonksiyon değerlendirin. Başarılı bir transplantasyon cerrahi teyit edilecektir if arka bacaklarda hiçbir disfonksiyon ikinci gününde alıcı farelerde görülmektedir.
- Içme suyu Ketoprofenin ile alıcı farenin yönetme (5 mg / kg / gün = 27 ug / içme suyu ml) 48 saat boyunca gerçekleştirilebilir. Damat, anormal demetler halinde duruş, vb hareketlilik, başarısızlık kaybı ile kanıtlandığı gibi herhangi bir alıcı fareler postoperatif analjezik tarafından giderilemeyen ağrı muzdarip, bunlar ötenazi olacak. Hayvanlar 1-60 gün sonra önceden tanımlanmış son noktalarında ötenazi olacaktır.
Greft analizi
Allogreftte arter greft (5 hafta viral enfeksiyon sonrası) 6 hafta operasyon sonrası vardı singeneik greft modelinde 4 hafta ve greft de temin ve Elastica-van Gieson (EVG) boyama, hematoksilen ve eozin (HE) için standart histolojik teknikler ile analiz edildi boyama ve immünofloresan boyama. Resimler bir immunofloresan mikroskop sistemi (Zeiss) ile alınmıştır. Pozitif immün çevrili çekirdeklerin hücre sayımı gerçekleştirmek olduyüksek büyütme altında ed ve her bir greft için 5 kesitler gelen ortalama. Lümen (endotel içinde), intima (endotel ve internal elastik lamina arasında, IEL), medya (IEL ve dış elastik lamina arasında, EEL), duvar kalınlığı (endotel ve dış elastik lamina arasında) greft alan ölçümleri ve bütün damar (EEL içinde) bilgisayar destekli görüntü analizi ve NIH Image 1.60 (kullanarak, her bir greft için ayrı 5 seri kesitleri, 150 mikron hesaplanmıştır http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).
İstatistiksel analizler
Tüm veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. Iki kuyruklu, çift t testi ve bir iki-yönlü varyans analizi Prism yazılım programı (GraphPad Software) kullanılarak yapıldı. P <0.05 ile farklılık istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare allogreft arteryoskleroz (GA) modeli: Bu modelde, bir erkek donör aort ana üzerinde sentezlenen küçük bir-Y antijeni (erkek-spesifik küçük histokompatibilite antijeni HY) karşı alloreactive T hücre aracılı immün tepkilerini getirir, böylece dişi alıcıya nakledilir greft 12 ve sırayla T diğer organ transplantasyonu modellerinde 2'de görüldüğü gibi, IFN-γ diskler VSMC proliferasyonunu 20, 6, 8-10, 14 hücre üretti. Bir donör erkek gelen aorta bir bölümü cerrahi bir kadın alıcı bir abdominal aort içine interpoze edildi ve aorta 4 hafta transplantasyon sonrası (Şekil 1A) hasat edildi. Arter greft histolojik analiz Elastica-van Gieson (EVG), H & E tarafından yapılan ve VSMC işaretleyici SMA ve pan-lökosit işaretleyici CD45 ile immün edildi. Herhangi bir greft reddi aort nakli C57BL/6J erkek fareler arasında gözlenmiştir. Kadın transplant erkeklökosit ve VSMC birikimi (Şekil 1B) ile neointima oluşumu infiltrasyonu ile karakterize iyon bağlı GA,. WT veya IFN-γR-KO fareler GA, aorta IFN-γ sinyal rolünü belirlemek için WT kadın alıcıya transplante edildi. Donör greft IFN-γR bölgesinin silinmesi WT ile (gösterilmemiştir) ile karşılaştırıldığında SMA-pozitif hücreleri ile azalır, lökositler ve neointima oluşumunun daha düşük bir sızma sergiledi. Daha önce hümanize fare ksenograft transplantasyon modeli 4, 15, 17, 18'de görüldüğü gibi, bu sonuçlar, GA ilerlemesinde, IFN-γ sinyalizasyon için önemli bir rolü olduğunu desteklemektedir.
IFN-γ-kaynaklı aşı arteryoskleroz: Bu, IFN-γalone hümanize bir fare GA modeli 15, 17 neointima oluşumunu teşvik etmek için yeterli olduğu tespit edilmiştir. Burada bir IFN-γ-aracılı fare singeneik greft damar sertliği modeli kurdu. Bu modelde, WT erkek aorta transplante edildiFare kodlayan IFN-γ transgen (Ad-IFN-γ) veya kontrol lacZ geni (Ad-LacZ) (Şekil 2A). replikasyon eksikliği adenovirüs intravenöz enjeksiyonu takiben, IFN-γR-eksikliği olan alıcı farelere Ad-LacZ hepatik enfeksiyon ve karaciğer transgen ifade Ad-LacZ grubunda X-gal boyama tarafından doğrulanmadı ama değil Reklam-IFN-γ gruplar daha önce 17 tanımlanmıştır. Sistemik sentezlenmesinin, IFN-γ, serum 120-150 ng / gün 3 ml 'lik bir seviyede tespit edildi ve 5 hafta kadar muhafaza Ad-, IFN-γ, ancak LacZ grupta. Aorta 5 hafta histolojik analiz ve arter greft intima, medya, lümen ve damar alanı morfometrik değerlendirilmesi için adenovirüs enjeksiyon sonrası hasat edildi. İfade, IFN-γ, ama LacZ kontrol indükte neointimal oluşumu. Lökositlerin hiçbir belirgin infiltrasyonu allogreft modeli (Şekil 2B) göre tespit edildi. Bu veriler önceki ile tutarlıdırtek başına IFN-γ neointima oluşumunu 15, 17 oluşturmak için yeterli olduğu hümanize fare ksenograft modelinde gözlemler.
Şekil 1. İllüstrasyon ve fare allogreft arter nakli modeli şeması. Allogreft nakli prosedürünün A. bir örnek. Donör erkek Torasik aort bir bölümü cerrahi bir kadın alıcıda abdominal aort içine sokulmuş oldu. Aorta 4 hafta transplantasyon sonrası hasat edildi. Bir kontrol olarak, erkek donör torasik aorta bir segment cerrahi bir erkek alıcı bir karın aort içine yerleştirilmiş oldu. Oda. Elastica-van Gieson (EVG), H & E ve anti-bir-SMA ve anti-CD45 ile immün tarafından arter greft histolojik analizi. Temsilcisi fotomikrografı gösterilir. Ok uçları medyadan intima tanımlamak için internal elastik lamina işaretleyin. Ölçekbar: 50 mm. Greft arteryoskleroz erkek grubuna erkek gözlenmiştir.
Şekil 2. IFN-γ ile indüklenmiş fare singeneik arter nakli modeli. A. IFN-γ bağlı fare singeneik modeli bir düzeni. Erkek donör torasik arter erkek alıcı IFN-γR KO farelerde disseke ve abdominal aorta naklediliyor edildi. Bir hafta cerrahi sonrası, 1x10 pfu 9 Ad-mlNF-γ ya da Ad-LacZ jugular ven yolu ile alıcı farelere enjekte edildi. 3 gün sonra serum, 7 ve 35, IFN-γ ölçümü için virüslerin enjeksiyon sonrası toplanmıştır. Greft morfometrik değerlendirmesi için 6 hafta hasat edildi. B. Anti-a-SMA ve anti-CD45 ile immün tarafından arterin greft histolojik analizi. Temsilcisi fotomikrografı gösterilir. Ok uçları medyadan intima tanımlamak için internal elastik lamina işaretleyin. Ölçek bar: 50 mm. ' Greft arteryoskleroz LacZ grubunda gözlendi.
| Adım | Sorun | Olası neden | Çözüm |
| 2.17 | Şiddetli kanama | Boşluk (iki dikiş arasındaki mesafe) kesintiye sütür özellikle, çok büyük. | Her iki dikiş arasındaki mesafe anastomoz sırasında tek tip olmalıdır. Sitesi kanama az bir dikiş ekleyin. |
| Sadece adventisya dikilir. | Belirlenmesi ve tüm aort duvar dikiş | ||
| Unligated kereste dalları | Kereste dalları bağlanarak | ||
| Çok fazla heparin | 4 kadar kullanarak0 ml / kg heparinize (100 U / ml) anastomozu sırasında cerrahi alanında sulamak için salin solüsyonu. | ||
| 2.19 | Tromboz | Lümen sürekli sütür özellikle anastomoz yerinde çok dar. | Her dikişte çok fazla aort duvarı anastomoz kaçının. Fare aort boyutu çok küçüktür. Anastomoz sırasında dikiş çok fazla aort duvarı Ancak, dikiş çok az aort duvar şiddetli kanama neden olur, lümen dar ve tromboz neden olur. |
| Karşı taraftaki aort duvarının üzerinden dikiş geçmektedir. | Aort duvarı belirlenmesi ve daha sonra dikiş yapma. De oldu, operatör bu sitede dikiş düğümü ve yeniden dikiş kesilmiş olmalıdır. | ||
| Endotel hücreleri anastomoz sırasında yaralandı. | Anastomoz için konaklama dikişler kullanılarak. Için ile tüm arotic duvar sıkmak / tutmayınanastomoz için ceps. | ||
| Heparin anastomoz sırasında kullanılmaz. | Fare aort boyutu çok küçüktür. Bu anastomoz sonra greft tromboz oluşumu için çok kolaydır. Ameliyat alanı sulamak için heparin verilmesi trombozu azaltmak için çok önemlidir. Farelerde damar naklinin başarı oranı heparin kullanmadan yaklaşık% 50 ve heparin kullanarak 95-100% olduğunu. Tromboz birkaç dakika içinde bulunursa kan akımı, tromboz kaldırmak için alternatif bir yaklaşımın restorasyon sonra IVC ile 30-50 ul heparinied tuzlu su (100 U / ml) enjekte etmektir. Sadece ciddi kanama durumunda çok fazla heparin enjekte etmeyin. | ||
| 2.23 | Transplantasyon başarısız oldu | Gecikmeli kanama ve tromboz veya başkalarının | Fare aort boyutu çok küçük olduğu için, farelerde damar nakli çok zor ameliyattır. Üç önemli poi vardırBaşarılı cerrahi NTS: 1) ev sahibi ve donör aort duvarları sadece şiddetli kanama durumunda, belli ki boşluğu olmadan birlikte anastomoz emin olun, sadece tromboz durumunda, anastomoz yerinde yeterli lümen alanı tutmak 2), 3) kullanın anastomoz sırasında sağ dozda heparin, tromboz ve şiddetli kanama sadece durumda. Bu protokol ardından, yazar için başarı oranı% 95'ten fazla olduğunu. |
Tablo 1. Tablo Sorun Giderme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan protokoller fare GA modelleri odaklandık. Prosedürleri diğer grefti modeller uygulanabilir. Bu modeller insanlaşmış ksenogreft (yani insan koroner arter segmentleri bağışık yetmezliği olan farelerin alt-böbrek aortlarından içine interpoze) ve akut rejeksiyon fare GA modeli (yani başka bir genetik gerginlik alıcı içine bir genetik gerginlik bir fare aort) içerir. Bizim tarif fare modelleri insan GA lezyonlar kapatmak için daha fazladır. Birinci model, erkek fare, aynı kendilenmiş suşu (C57BL/6J) bir dişi alıcı bir kap kademeli bir araya girmesi içerir. Bu durumda greft reddi Y kromozomu (erkek mevcut ama kadın değil) ve birkaç hafta 2, 6 donör kaynaklı düz kas hücreleri korumak için yeterince sessiz olduğu görüldüğünde bu red yanıtı tarafından kodlanan küçük doku uygunluk antijenleri karşı sadece yönlendirilir , 8-10, 12, 14. İkinci model bir arter segme interposing içerirIFN-γ (IFN-γR-KO) için reseptör yoksun aynı suşu ve bir cinsiyet, bir ana fare içine bir vahşi tür C57BL/6J fare donörden nt fare uygulaması takip IFN-γ (fare enfeksiyon ile teslim bir adenoviral vektör ile karaciğer.) Orada donör ve alıcı fareler her ikisi de aynı gerginlik ve cinsiyet ama ev sahibi kaynaklı hücreler, bu sitokin için reseptör eksik ise donör düz kas hücreleri sitokin yanıt olarak çoğalırlar bu durumda hiçbir reddidir, 21 tepkisiz. Bundan başka, kap verici içine ek genetik değişiklikler melezlenmesine göre, her iki model IFN-γ-güdümlü düz kas hücresi çoğalması ve GA progresyonu üzerindeki spesifik genlerin etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.
Fare GA modellerinde IFN-γ rolü de kanıtlanmamıştır. Bizim iki fare modelleri fare GA IFN-γ rolünü doğruladıktan. İlk modelde, bir erkek donör aort kadın alıcı naklediliyorEv sahibi greft 12 üzerinde ifade bay-spesifik küçük histokompatibilite antijeni HY alloreactive karşı T hücresi aracılı immün tepkilerini getirir, böylece. Gerçekten de, C57BL/6J kadın nakli kaynaklı GA için WT (C57BL/6J) erkek, lökosit ve VSMC birikimi ile neointima oluşumu infiltrasyonu ile karakterize. Bunun aksine, erkek aort nakli erkek GA indüklemez. Biz rolünü tespit IFN-γ WT kadın alıcıya nakledilen donör greft olarak IFN-γR-KO ile damar hücrelerinde sinyal. Donör greft IFN-γR silinmesi neointima lökosit infiltrasyonu ve VSMC birikimi körelmiş. Bu yüzden, mevcut fare modelinde, IFN-γ rolü hümanize fare ksenograft transplantasyon modeli ile tutarlı olduğu, IFN-γ greft sinyalizasyon GA ilerleme 4, 15, 17, 18 için çok önemlidir. IFN-γ tek başına IFN-γ-orta oluşturarak neointima oluşumunu teşvik etmek için yeterli olup olmadığını tespit ettikated fare singeneik greft damar sertliği modeli. Bu modelde, bir erkek aort erkek bir IFN-γR-KO, alıcı hayvanın içine transplante edildiği fare IFN-γ sonra sistemik olarak, IFN-γ transgen (Ad-, IFN-γ, fare kodlayan replikasyon eksikliği adenovirüs intravenöz enjeksiyonu ile ifade edilir .) IFN-γ, ama LacZ kontrol bağlı neointimal formasyonu bu ifade görülmüştür. Bu modelde, lökositlerin belirgin bir infiltrasyonu, allogreft modeli ile karşılaştırıldığında tek başına vasküler IFN-γ sinyal lökositlerin yokluğunda neointima oluşumunu teşvik etmek için yeterli olan, bir insan-SCID fare arter nakli modelinde önceki gözlemlerimiz ile tutarlıdır algılandığında 15, 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma WM ve LY için AHA 9320033N için NIH hibe R01 HL109420 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transplant. 24, 2003-2014 (2005).
- Koulack, J., McAlister, V. C., MacAulay, M. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 273-277 (1996).
- Libby, P., Pober, J. S.
- Lorber, M. I., Wilson, J. H., Robert, M. E., Schechner, J. S., Kirkiles, N., Qian, H. Y., Askenase, P. W., Tellides, G., Pober, J. S. Human allogeneic vascular rejection after arterial transplantation and peripheral lymphoid reconstitution in severe combined immunodeficient mice. Transplantation. 67, 897-903 (1999).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Mitchell, R. N.
- Mitchell, R. N. Graft vascular disease: immune response meets the vessel wall. Annu Rev Pathol. 4, 19-47 (2009).
- Nagano, H., Libby, P., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Stinn, J. L., Becker, G., Tilney, N. L., Mitchell, R. N. Coronary arteriosclerosis after T-cell-mediated injury in transplanted mouse hearts: role of interferon-gamma. Am. J. Pathol. 152, 1187-1197 (1998).
- Nagano, H., Mitchell, R. N., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Tilney, N. L., Libby, P. Interferon-gamma deficiency prevents coronary arteriosclerosis but not myocardial rejection in transplanted mouse hearts. J. Clin. Invest. 100, 550-557 (1997).
- Raisanen-Sokolowski, A., Glysing-Jensen, T., Koglin, J., Russell, M. E. Reduced transplant arteriosclerosis in murine cardiac allografts placed in interferon-gamma knockout recipients. Am. J. Pathol. 152, 359-365 (1998).
- Salomon, R. N., Hughes, C. C. W., Schoen, F. J., Payne, D. D., Pober, J. S., Libby, P. Human Coronary Transplantation-Associated Arteriosclerosis - Evidence for a Chronic Immune Reaction to Activated Graft Endothelial Cells. Am. J. Pathol. 138, 791-798 (1991).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., Ellis, P. S., Chandler, P. R., Simpson, E. Why do some females reject males? The molecular basis for male-specific graft rejection. J. Mol. Med. 75, 103-114 (1997).
- Shimizu, K., Sugiyama, S., Aikawa, M., Fukumoto, Y., Rabkin, E., Libby, P., Mitchell, R. N. Host bone-marrow cells are a source of donor intimal smooth- muscle-like cells in murine aortic transplant arteriopathy. Nat. Med. 7, 738-741 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S.
- Tellides, G., Tereb, D. A., Kirkiles-Smith, N. C., Kim, R. W., Wilson, J. H., Schechner, J. S., Lorber, M. I., Pober, J. S. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Vassalli, G., Gallino, A., Weis, M., von Scheidt, W., Kappenberger, L., von Segesser, L. K., Goy, J. J. Alloimmunity and nonimmunologic risk factors in cardiac allograft vasculopathy. Eur. Heart J. 24, 1180-1188 (2003).
- Wang, Y., Bai, Y., Qin, L., Zhang, P., Yi, T., Teesdale, S. A., Zhao, L., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ. Res. 101, 560-569 (2007).
- Wang, Y., Burns, W. R., Tang, P. C., Yi, T., Schechner, J. S., Zerwes, H. G., Sessa, W. C., Lorber, M. I., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma plays a nonredundant role in mediating T cell-dependent outward vascular remodeling of allogeneic human coronary arteries. Faseb J. 18, 606-608 (2004).
- Yacoub-Youssef, H., Marcheix, B., Calise, D., Thiers, J. C., Benoist, H., Blaes, N., Segui, B., Dambrin, C., Thomsen, M. Chronic vascular rejection: histologic comparison between two murine experimental models. Transplant. Proc. 37, 2886-2887 (2005).
- Yokota, T., Shimokado, K., Kosaka, C., Sasaguri, T., Masuda, J., Ogata, J. Mitogenic activity of interferon gamma on growth-arrested human vascular smooth muscle cells. Arterioscler. Thromb. 12, 1393-1401 (1992).
- Yu, L., Qin, L., Zhang, H., He, Y., Chen, H., Pober, J., Tellides, G., Min, W. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting IFN-γ-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Cir. Res. 109, 418-427 (2011).
