Summary
Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un test di migrazione cellulare semi-high throughput su una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti. Questo protocollo è un metodo rapido, semplice ed economico per creare ferite scratch coerenti su un monostrato di cellule.
Abstract
La migrazione delle cellule / ferendo test è un metodo comunemente utilizzato per studiare la migrazione delle cellule e altri processi biologici, come l'angiogenesi e metastasi tumorali. In questo saggio, le cellule sono coltivate per formare un monostrato confluente e una ferita meccanica viene creato graffiando con un dispositivo. Allora il tasso di migrazione delle cellule verso la zona denudato può essere monitorato mediante imaging. Il nostro wounder meccanica 8 canali è progettato per affrontare la maggior parte dei problemi associati con il test migrazione cellulare. In primo luogo, la nostra wounder può essere facilmente sterilizzato in autoclave o con comuni disinfettanti. In secondo luogo, i singoli pin regolabili permettono anche contatto con la piastra di coltura cellulare in modo che possono essere creati ferite taglienti e riproducibili. In terzo luogo, le barre di guida su entrambi i lati del wounder assicurano posizione ferimento consistente in ciascun pozzetto. L'uso di puntali di plastica per il ferimento può fornire ulteriori migliore gestione del feritore e minimizzare le contaminationico. In conclusione, il nostro wounder cella può fornire ai ricercatori un dispositivo facile e riproducibile utente per l'esecuzione del test migrazione cellulare utilizzando la piastra standard coltura a 96 pozzetti.
Introduction
La migrazione cellulare gioca un ruolo importante nei processi cellulari, come ad esempio l'embriogenesi, la neurogenesi, l'angiogenesi, la guarigione delle ferite, delle mucose riparazione, epiteliali-mesenchimali-transizioni in fase di sviluppo normale e la situazione della malattia 1. Si tratta di un processo complicato, che richiede un coordinamento delle numerose manifestazioni inter- e intra-cellulari, compresi segnalazione interazioni molecola, la polarizzazione delle cellule, la riorganizzazione del citoscheletro, rimodellamento della matrice, protrusione della membrana e dinamica cellula-cellula adesione modulazione 2. Studiando la migrazione delle cellule, la scoperta e la convalida delle sostanze chimiche o biomolecole che conducono al movimento delle cellule e le relative vie biochimiche possono essere determinati. Questo processo fondamentale può essere utilizzato vantaggiosamente come proxy per varie applicazioni, come il trattamento di malattia e drug targeting.
Il saggio ferendo è uno dei saggi di migrazione cellulare 3. Qui, unsingolo campione di cellule viene parzialmente rimosso dai mezzi meccanici per produrre una zona denudata cui le cellule migreranno per coprire l'area. La percentuale di recupero in un particolare momento sarà monitorato. Quando si maneggiano gran numero di campioni, questioni come il costo sperimentale e la contaminazione incrociata all'interno di campioni possono essere problematico. Anche se molti strumenti commerciali e saggi sono disponibili per lo studio migrazione delle cellule 4, 5, 6, molti di loro richiesto attrezzature costose e sofisticate e miglioramenti sono ancora necessari. Per queste ragioni, un wounder cellule meccanico 8 canali (Figura 1) è sviluppato.
Il nostro wounder cellule meccanica 8 canali ha incorporato diverse caratteristiche uniche nel risolvere i suddetti problemi. Esso fornisce la flessibilità necessaria per eseguire la migrazione delle cellule / ferendo saggi nel formato piastra di coltura a 96 pozzetti. La regolazione guprogettazione bar Iding assicura che la zona zero è in posizione centrale di ogni bene. Inoltre, l'altezza delle barre di guida può essere regolato in modo che il feritore è applicabile per varie marche di piastre di coltura. Infine, il design pin ferimento regolabile consente un ancora di contatto delle punte delle pipette con la superficie della piastra di coltura per ottenere simultaneamente e riproducibile ferimento 7, 8.
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Protocol
1. Introduzione alle parti del feritore (Figura 1)
- Preparare il supporto del perno fissando i perni ferimento a distanze uguali. Tenere i puntali e regolare l'altezza della punta spostando i perni ferimento regolabili su e giù.
- Montare la guida barra regolabile su diverse marche di piastre di coltura a 96 pozzetti e assicurarsi che l'area ferimento è in una posizione fissa.
- Fissare il perno ferimento regolabile stringendo la vite esagonale. Fissare la guida bar in posizione stringendo i tappi a testa esagonale incassata su entrambe le estremità.
2. Impostare la larghezza del supporto del perno (Figura 2)
- Allentare i tappi a testa esagonale incassata con la chiave esagonale M5.
- Inserire un numero adeguato di regolazione anelli ad entrambi i lati del supporto del perno in modo che le barre di guida si adattano perfettamente con la larghezza della piastra di coltura a 96 pozzetti.
NOTA: Corning e piastre Iwaki richiede 1 paio di grandi anelli e 1 paio di piccoli anelli. Falcon e Nunc plAtes bisogno 1 paio di grandi anelli. - Serrare la brugola esagonale tappi per fissare la barra di guida.
3. Regolare le barre di guida (Figura 3)
- Montare i perni ferendo con sterili punte di pipette di plastica da 10 microlitri.
- Allentare i tappi a testa esagonale incassata con la chiave esagonale M5.
- Tenere il feritore e immergere i perni ferimento in una colonna di una piastra di coltura a 96 pozzetti.
- Regolare l'altezza delle barre di guida fino a quando tutti i suggerimenti toccare appena il fondo dei pozzetti.
- Serrare i tappi a brugola esagonale. Assicurarsi che il feritore ora si adatta perfettamente al piastra di coltura e che i perni sono ben posizionate nel mezzo dei pozzi.
4. La calibrazione dei perni
- Tenere il feritore perpendicolare ad una superficie sterile piatta (cioè Petri) e allentare tutte le viti a testa esagonale con la chiave esagonale M3.
- Toccare il feritore fino a quando tutti i suggerimenti in modo uniforme toccare la superficie sterile piatta. </ Li>
- Serrare di nuovo le viti esagonali per bloccare i perni in posizione.
- Controllare la regolarità di ogni punta toccando il feritore delicatamente sulla superficie sterile piatta.
5. Scratching cellulare monostrato (figura 4)
- Seme umano ombelicale cellule endoteliali vascolari su un 96-pozzetti di coltura cellulare di gelatina rivestite 0,1%. cellule di coltura in media 199 integrate con il 20% di siero di calore-inattivato fetale bovino, 1% di penicillina / streptomicina e 0,09 g / L di eparina. Mantenere le cellule in un incubatore umidificato con 5% di anidride carbonica a 37 ° C durante la notte prima di essere utilizzato. Le cellule devono raggiungere il 100% di confluenza prima ferimento.
- Collocare le punte ferimento alla sinistra (o destra) lato di ciascun pozzetto nella stessa colonna della piastra di coltura. Far scorrere il feritore verso l'altro lato del pozzo; assicurarsi che le punte ferimento tocchino il fondo del pozzo.
- Ripetere la graffiare (Passo 5.2) per tutte le colonne.
- Dopo il ferimento, scarti tegli media in ciascun pozzetto e sostituirlo con terreno contenente composti di test freschi.
6. Acquisizione dati e Image Analysis
- Immagine tutto bene con la ferita meccanica sul monostrato cellulare utilizzando un microscopio a bassa potenza con fotocamera digitale (es obiettivo 10X) immediatamente dopo ferimento (t = 0 h).
- Aggiungere composti di prova se desiderato e incubare per il tempo desiderato. Immagine tutto bene con l'area della ferita dopo il tempo di incubazione desiderato (t = Dh).
- L'utilizzo di immagini software di analisi come ad esempio ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/ ), misurare l'area ferito l'immagine utilizzando lo strumento a mano libera.
- Calcolare la percentuale di chiusura della ferita:
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Representative Results
Questo wounder meccanico 8 canali è costruito graffiare un monostrato di cellule al fine di eseguire il saggio migrazione cellulare. Si tratta di un dispositivo di facile utilizzo in grado di svolgere cellulari graffiare test in piastre da 96 pozzetti in meno di un minuto senza formazione specifica. Questo wounder può introdurre aree avvolte su monostrati di cellule con una larghezza uniforme di circa 600 micron e con spigoli vivi (figure 5 e 6). La larghezza delle ferite dipende dalla marca di puntali e prestazioni dell'utente. Questa gamma di larghezza ferita è adatta per un'immagine comune catturare sotto ingrandimento bassa potenza (Figura 7). Dopo aver catturato l'immagine, la percentuale di chiusura della ferita può essere calcolato. Questo feritore cella ha incorporato diverse strategie per risolvere i problemi riscontrati con il test migrazione delle cellule. Inoltre, esso fornisce flessibilità nella saggi di migrazione cellulare in vari 96 pozzetti cultura plate formati.
Figura 1: otto canali feritore cellule meccanica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Regolare la larghezza del supporto del perno. Inserire gli anelli di regolazione in modo da adattarsi alla piastra a 96 pozzetti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Regolare le barre di guida per adattarsi diversi formati lastra. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Graffio direzione della punta. Graffiare le celle trascinando il wounder da un lato del fondo del pozzetto verso l'altro lato del fondo del pozzetto.
Figura 5: Panoramica della piastra a 96 pozzetti dopo il ferimento. Il monostrato cellulare è ferito dal feritore producendo bordi taglienti con larghezza uniforme di circa 600 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. < / P>
Figura 6: Immagini rappresentative di una riga ed una colonna di pozzi subito dopo graffi. L'analisi quantitativa della larghezza della ciascuna ferita. Le immagini vengono catturate con un obiettivo 10X. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: catturato le immagini della ferita (obiettivo 10X) a T = 0 e T = h Dh. La linea tratteggiata indica l'area della ferita e la linea continua indica la zona migrazione cellulare. A) vena ombelicale cellule endoteliali umane. B) fibroblasti del derma umano.ottenere = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il nostro feritore cella ha diverse caratteristiche uniche nel risolvere i problemi dei test di migrazione delle cellule tradizionali. Il feritore cellule meccanico a 8 canali è realizzato in acciaio inox di alta qualità (acciaio 304) con una lunga durata di vita che può essere sterilizzato in autoclave. Quasi tutti marchi commerciali di piastre di coltura a 96 pozzetti disponibili sul mercato possono essere utilizzati con questo wounder cellule meccanica causa della barra guida regolabile. Il disegno della barra guida regolabile garantisce anche che la zona graffi è al centro di ogni pozzetto. La ferita in una posizione centrale del pozzo può facilitare la cattura delle immagini utilizzando un microscopio. Le immagini possiedono alcune variazioni mentre taken a tempi diversi, ma non influenzano l'analisi dei dati perché quasi il 90% della superficie e può essere visualizzato da microscopio con un obiettivo a basso ingrandimento (cioè 10X). Così, un'analisi semi-alto rendimento può essere eseguita su piastre a 96 pozzetti di coltura 7, <sup class = "xref"> 8. Tuttavia, questo metodo richiede ancora un gran numero di immagini, che richiedono l'analisi dei dati lungo. Questo può essere risolto se un sistema automatico di acquisizione delle immagini è disponibile.
Il design dei singoli pin regolabili del feritore permette anche contatto con la superficie piastra a 96 pozzetti per ottenere ferite identiche, lisci e taglienti sul monostrato cellulare. I perni graffi sono puntali di plastica commerciali, che possono essere sterilizzati e smaltiti dopo ogni singolo graffio, e in grado di fornire grande elasticità a contatto con la superficie bene senza danni meccanici. Questi vantaggi possono ridurre ulteriormente la contaminazione incrociata dei campioni durante l'esperimento e l'influenza sul movimento cellulare attraverso l'area dissodata. In futuro, svilupperemo un perno a molla controllato che può eliminare la fase di regolazione in altezza del perno. La fase più critica di utilizzare questo dispositivo è la forza applicata sul monostrato cellulare durante il graffio. Il feritore devesi terrà perpendicolarmente contro la piastra di coltura, in modo che otto punte per pipette tocchino il fondo del pozzo. Infatti, il feritore fornisce un metodo per eseguire il test migrazione cellulare senza l'uso di apparecchiature costose e complicate. Il protocollo per questo feritore è semplice e lineare.
In conclusione, il nostro feritore meccanico a 8 canali è un dispositivo facile da usare per i test di migrazione delle cellule che non richiede particolari competenze. Gli utenti possono eseguire il test migrazione delle cellule in piastre da 96 pozzetti con un numero relativamente elevato di campioni in maniera veloce e semplice 9, 10, 11.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Sig Tam Po Leung, Mr. Wong Chi Kin e lo staff tecnico della Facoltà di Scienze Workshop, Hong Kong Baptist University, per le loro competenze tecniche e consigli per rendere il prototipo di questo feritore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Other brands of 96-well cell culture plate can also be used |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
References
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