Summary
A continuación, se presenta un protocolo para realizar un ensayo de migración celular semi-alto rendimiento en una placa de cultivo celular de 96 pocillos. Este protocolo es un método rápido, simple y económico para crear heridas arañazos consistentes en una monocapa de células.
Abstract
La migración de células / hiriendo ensayo es un método comúnmente utilizado para estudiar la migración celular y otros procesos biológicos, tales como la angiogénesis y la metástasis tumoral. En este ensayo, las células se cultivan para formar una monocapa confluente y una herida mecánica se crea por el rascado con un dispositivo. Entonces la tasa de migración de las células hacia el área denudada se puede supervisar mediante formación de imágenes. Nuestra wounder mecánica 8-canal está diseñado para hacer frente a la mayoría de los problemas asociados con el ensayo de migración celular. En primer lugar, nuestra wounder puede ser fácilmente esterilizado por autoclave o con desinfectantes comunes. En segundo lugar, las patillas ajustables individuales permiten incluso el contacto con la placa de cultivo celular de manera que las heridas agudas y reproducibles pueden ser creados. En tercer lugar, las barras de guía en ambos lados de la wounder asegurar la posición herida consistente en cada pocillo. El uso de puntas de pipeta de plástico desechables por herir pueda ampliar un mejor manejo de la wounder, así como para reducir al mínimo cruzada contamination. En conclusión, nuestro wounder célula puede proporcionar a los investigadores un dispositivo fácil y reproducible de usuario para realizar el ensayo de migración celular usando la placa de cultivo de 96 pocillos estándar.
Introduction
La migración celular juega un papel importante en los procesos celulares, tales como la embriogénesis, la neurogénesis, la angiogénesis, la curación de heridas, la reparación de la mucosa, epitelio-mesenquimal transiciones en fase de desarrollo normal y situación de la enfermedad 1. Es un proceso complicado que implica la coordinación de numerosos eventos inter e intra-celulares, incluyendo interacciones de moléculas de señalización, la polarización celular, la reorganización del citoesqueleto, remodelación de la matriz, la protrusión de la membrana y la célula-célula dinámica de adhesión de modulación 2. Mediante el estudio de la migración celular, el descubrimiento y validación de los productos químicos o biomoléculas que conducen a movimiento de la célula y sus vías bioquímicas relacionadas pueden determinarse. Este proceso fundamental se puede utilizar beneficiosamente como un proxy para diversas aplicaciones, como el tratamiento de la enfermedad y la orientación de drogas.
El ensayo hiriendo es uno de los ensayos de migración celular 3. Aquí, unamuestra individual de las células se elimina parcialmente por medios mecánicos para producir un área denudada donde las células migrarán a cubrir el área. El porcentaje de recuperación en un momento concreto, se hará. Al manejar gran número de muestras, cuestiones tales como el costo experimental y la contaminación cruzada dentro de las muestras pueden ser problemáticos. Aunque muchas herramientas comerciales y ensayos están disponibles para el estudio de la migración celular 4, 5, 6, muchos de ellos requiere un equipo costoso y sofisticado y todavía se necesitan mejoras. Por estas razones, se desarrolla un wounder celular mecánica de 8 canales (Figura 1).
Nuestra wounder celular mecánica de 8 canales ha incorporado varias características únicas en la solución de los problemas mencionados anteriormente. Proporciona la flexibilidad para llevar a cabo la migración celular / hiriendo ensayos en el formato de placa de cultivo de 96 pocillos. La gu ajustablediseño de la barra Iding asegura que el área de borrador está en la posición central de cada pocillo. Además, la altura de las barras de guía se puede ajustar de manera que el wounder es aplicable para diversas marcas de placas de cultivo. Finalmente, el diseño ajustable pin herida permite un contacto uniforme de las puntas de pipeta con la superficie de placa de cultivo para lograr herida simultánea y reproducible 7, 8.
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Protocol
1. Introducción a las partes de la wounder (Figura 1)
- Preparar el soporte de pasador mediante la fijación de los pasadores de herir a distancias iguales. Mantenga las puntas y ajustar la altura de la punta moviendo las clavijas ajustables hirientes hacia arriba y abajo.
- Montar el guiado barra ajustable en diferentes marcas de placas de cultivo de 96 pocillos y asegurar que el área de la herida está en una posición fija.
- Fijar el pasador heridas ajustable apretando el tornillo hexagonal. Fijar la barra guía en posición apretando las tapas de cabeza hexagonal en ambos extremos.
2. Ajuste de la anchura del soporte de pasador (Figura 2)
- Aflojar los tapones de cabeza hexagonal con la llave hexagonal M5.
- Insertar un número adecuado de anillos de ajuste a ambos lados del soporte de pasador de modo que las barras de guía encajan perfectamente con la anchura de la placa de cultivo de 96 pocillos.
NOTA: Corning y placas de Iwaki requiere 1 par de anillos grandes y 1 par de anillos pequeños. Falcón y Nunc plAtes necesitan 1 par de anillos grandes. - Apriete la cabeza hueca hexagonal tapas para fijar la barra de guía.
3. Ajuste las barras de dirección (Figura 3)
- Montar los pasadores hiriendo con puntas de pipeta de plástico de 10 mu l estériles.
- Aflojar los tapones de cabeza hexagonal con la llave hexagonal M5.
- Mantenga el heridor y sumergir los pasadores hirientes en una columna de una placa de cultivo de 96 pocillos.
- Ajustar la altura de las barras de guía hasta que todas las puntas apenas tocar el fondo de los pocillos.
- Apriete las tapas de cabeza hexagonal. Asegúrese de que el wounder ahora se integra perfectamente en la placa de cultivo y que los pasadores están bien posicionados en el medio de los pozos.
4. La calibración de los pernos
- Mantenga la wounder perpendicular a una superficie plana estéril (es decir, cápsula de Petri) y afloje todos los tornillos de cabeza hexagonal con la llave hexagonal M3.
- Toque en el wounder hasta que todos los consejos uniformemente toque la superficie plana estéril. </ Li>
- Apriete los tornillos de cabeza hexagonal de nuevo para bloquear los pasadores en su posición.
- Comprobar la uniformidad de cada punta tocando el wounder suavemente sobre la superficie plana estéril.
5. El rascado en monocapa de células (Figura 4)
- Sembrar las células humanas umbilicales vasculares endoteliales en una placa de cultivo celular de 96 pocillos recubierta con gelatina 0,1%. células cultivo en medio 199 suplementado con suero 20% inactivado por calor fetal bovino, 1% de penicilina / estreptomicina y 0,09 g / L de heparina. Mantener las células en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5% a 37 ºC durante la noche antes de ser utilizados. Las células deben alcanzar el 100% de confluencia antes de la herida.
- Coloque la punta herir en el extremo izquierdo (o la más a la derecha) de cada lado dentro de la misma columna de la placa de cultivo. Deslizar el wounder hacia el otro lado del pozo; asegurarse de que las puntas hirientes están tocando el fondo del pozo.
- Repita el rascado (Paso 5.2) para todas las columnas.
- Después de la herida, descarte tél medio de cada pocillo y reemplazar con compuestos de ensayo que contiene medio fresco.
6. Adquisición de Datos y Análisis de Imágenes
- Imagen de todo el bien con la herida mecánica sobre la monocapa de células usando un microscopio de baja potencia con cámara digital (por ejemplo, objetivo de 10X) inmediatamente después de la herida (t = 0 h).
- Añadir los compuestos de ensayo, si se desea y se incuba durante la longitud deseada de tiempo. Image todo el bien con el área de la herida de nuevo después de que el tiempo de incubación deseado (t =? H).
- El uso de software de análisis de imágenes tales como ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/ ), medir el área herida en la imagen utilizando la herramienta de mano alzada.
- Calcular el porcentaje de cierre de la herida:
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Representative Results
Este wounder mecánica 8-canal está construido para rayar una monocapa de células con el fin de realizar el ensayo de migración celular. Es un dispositivo fácil de usar que se pueden llevar a cabo ensayos de células rascarse en placas de 96 pocillos en menos de un minuto sin entrenamiento especial. Este wounder puede introducir áreas de heridas sobre monocapas de células con una anchura uniforme de aproximadamente 600 micras y con bordes afilados (Figuras 5 y 6). La anchura de las heridas depende de la marca de puntas de pipeta y el rendimiento del usuario. Esta gama de anchura de la herida es adecuado para la captura de imagen común bajo magnificación de baja potencia (Figura 7). Después de la captura de la imagen, el porcentaje de cierre de la herida se puede calcular. Este wounder celular ha incorporado diferentes estrategias en la resolución de los problemas encontrados con el ensayo de migración celular. Además, se proporciona flexibilidad en la realización de ensayos de migración celular en diversos pl cultivo de 96 pocilloscomió formatos.
Figura 1: ocho canales wounder celular mecánica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ajuste de la anchura del soporte de pasador. Inserte los anillos de ajuste con el fin de adaptarse a la placa de 96 pozos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Ajuste las barras de guía para adaptarse a diferentes formatos de placas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El rascarse dirección de la punta. Rayar las células deslizando el wounder desde un lado de la parte inferior bien al otro lado de la parte inferior también.
Figura 5: Vista general de la placa de 96 pocillos después de la herida. La monocapa celular está herido por el wounder producir bordes afilados con un ancho uniforme de aproximadamente 600 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. < / P>
Figura 6: Imágenes representativas de una fila y una columna de pocillos inmediatamente después del rascado. El análisis cuantitativo de la anchura de la cada herida. Las imágenes se capturan bajo un objetivo de 10X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Las imágenes capturadas de la herida (objetivo 10X) en t = 0 y t = h? H. La línea punteada indica el área de la herida y la línea continua indica el área de la migración celular. A) las células endoteliales de la vena umbilical humana. B) de fibroblastos dérmicos humanos.obtener = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nuestra wounder célula tiene varias características únicas en la solución de los problemas de los ensayos de migración celular tradicionales. El wounder celular mecánica 8-canal está hecha de acero inoxidable de alta calidad (Steel 304) con una larga vida útil que se puede esterilizar en autoclave. Casi todas las marcas comerciales de placas de cultivo de 96 pocillos disponibles en el mercado se pueden utilizar con este wounder celular mecánica debido a la barra de guía ajustable. El diseño de la barra de guía ajustable también asegura que el área de rascado está en el centro de cada pocillo. La herida en una posición central del pozo puede facilitar la captura de imágenes utilizando un microscopio. Las imágenes poseen algunas variaciones mientras tomadas en diferentes puntos de tiempo, pero que no afectan el análisis de datos debido a que casi 90% de la superficie bien puede ser visto por el microscopio con un objetivo de bajo aumento (es decir, 10 veces). Por lo tanto, un análisis semi-alto rendimiento se puede realizar en placas de cultivo de 96 pocillos 7, <sup class = "xref"> 8. Sin embargo, este método todavía requiere un gran número de imágenes, que requieren el análisis de datos largo. Esto puede ser resuelto si un sistema de adquisición automática de la imagen está disponible.
El diseño de las patillas ajustables individuales del wounder permite un contacto uniforme con la superficie de la placa de 96 pocillos para lograr heridas idénticas, suaves y agudos en la monocapa celular. Los pasadores son rascándose puntas de pipeta de plástico comerciales, que pueden ser esterilizados y desechar después de cada rasguño, y pueden proporcionar una gran elasticidad en contacto con la superficie bien sin daños mecánicos. Estas ventajas pueden minimizar aún más la contaminación cruzada de las muestras durante el experimento y la influencia sobre el movimiento de las células a través del área denudada. En el futuro, vamos a desarrollar un pasador de resorte controlado que puede eliminar la etapa de ajuste de altura pasador. El paso más crítico de utilizar este dispositivo es la fuerza aplicada sobre la monocapa de células durante el rascado. El wounder debese llevará a cabo en posición vertical respecto de la placa de cultivo, por lo que ocho puntas de pipeta están tocando el fondo del pozo. De hecho, la wounder proporciona un método para llevar a cabo el ensayo de migración de células sin el uso de equipo costoso y complicado. El protocolo de este wounder es sencilla y directa.
En conclusión, nuestro wounder mecánica de 8 canales es un dispositivo fácil de usar para los ensayos de migración celular que no requiere habilidades especiales. Los usuarios pueden realizar el ensayo de migración de células en placas de 96 pocillos con un número relativamente grande de muestras de una manera rápida y simple 9, 10, 11.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Sr. Tam Po Leung, el Sr. Wong Chi Kin y el personal técnico de la Facultad de Ciencias de taller, Hong Kong Baptist University, por sus conocimientos técnicos y asesoramiento en la fabricación del prototipo de este wounder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Other brands of 96-well cell culture plate can also be used |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
References
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