Abstract
Dit manuscript beschrijft een protocol voor het detecteren transcriptieterminatie defect in vivo. De streng-specifieke TRO protocol gebruikt BrUTP beschreven is een krachtige experimentele benadering voor het analyseren van de transcriptie beëindiging defect onder fysiologische omstandigheden. Als de traditionele TRO assay is gebaseerd op de aanwezigheid van een transcriptioneel actieve polymerase voorbij het 3 'uiteinde van het gen als een indicator van een transcriptie terminatie defect 1. Het overwint twee grote problemen met de traditionele TRO test. Ten eerste kan het detecteren of het polymerase lezen door het terminatiesignaal is die transcriptie geïnitieerd van de promoter-proximale regio, of simpelweg vertegenwoordigt een pervasively transcriberen polymerase die aspecifiek geïnitieerd ergens in het lichaam of het 3' uiteinde van het gen. Ten tweede kan onderscheiden of het transcriptioneel actieve polymerase-signaal buiten hetterminatorgebied werkelijk de readthrough sense mRNA transcriberen polymerase of een terminator geïnitieerde niet-coderende antisense RNA signaal. Kort samengevat, het protocol omvat permeabilisatie de exponentieel groeiende gistcellen, waardoor de transcripten die in vivo gestart te rekken in aanwezigheid van de BrUTP nucleotide zuiveren BrUTP gelabelde RNA met de affiniteit benadering reverse transcriberen het gezuiverde ontluikende RNA en amplificatie van het cDNA met behulp strengs specifieke primers aan weerszijden van de promoter en terminator gebieden van het gen 2.
Introduction
De eukaryotische transcriptie cyclus bestaat uit drie belangrijke stappen; initiatie, verlenging en beëindiging. De beëindiging van de transcriptie door RNA-polymerase II bestaat uit twee afzonderlijke, onderling afhankelijke stappen 3. De eerste stap is splitsing en afgifte polyadenylatie van mRNA uit de matrijs en wordt onmiddellijk gevolgd door de tweede stap, gekenmerkt door losmaken van polymerase van de sjabloon. Juiste afsluiting is cruciaal voor de recycling van de polymerase bij aanvang / her-initiatie van transcriptie, het voorkomen interferentie met de transcriptie van downstream genen, en het bijhouden van afwijkende transcriptie controle door het beperken transcriptie van doordringende niet-coderende RNA 4, 5. Ondanks recente vooruitgang beëindiging veruit de minst begrepen stap van het RNA polymerase II de transcriptie cyclus. Een betrouwbare beëindiging test is essentieel voor het bestuderen van het mechanisme underlying beëindiging van transcriptie door RNA polymerase II in vivo.
Een aantal experimentele benaderingen worden gebruikt om de beëindiging defect in een actief transcriberen gen onder fysiologische ziektebeelden. Deze omvatten Northern blot, beëindiging factor chip (Chromatine Immunoprecipitatie) en de traditionele TRO test. Elk van deze technieken heeft voordelen als nadelen. De traditionele TRO assay gebruikt om de meest betrouwbare en gevoelige benadering voor de detectie van een transcriptie terminatie defect in vivo 1 zijn. Deze test lokaliseert het transcriptioneel actieve polymerase moleculen op verschillende gebieden van een gen in de cel. Onder normale omstandigheden het assay toont gekoppelde transcriptie polymerase moleculen strikt verdeeld tussen de promoter en terminator van het gen (Figuur 1A). Na beëindiging defecte echter het polymerase in staat is de beëindiging uitgelezen signaalen wordt gedetecteerd in het gebied stroomafwaarts van het 3'-uiteinde van het gen (Figuur 1B).
Een transcriptieterminatiesequentie defect manifesteert in aanwezigheid van een sense-transcriptie polymerase dat geïnitieerd van de promoter-proximale gebied, en niet in staat om de beëindiging uitgelezen signaal blijft transcriptie van het gebied stroomafwaarts van het 3'-uiteinde van een gen zoals getoond in figuur 2A. Met het besef dat de eukaryote genoom vertoont overweldigend alomtegenwoordig transcriptie in zin evenals anti-sense richtingen in en rond een gen 6, 7, 8, 9, 10, werd al snel duidelijk dat de traditionele TRO test niet kan detecteren of de polymerase signaal stroomafwaarts van een gen betekent een promotor geïnitieerd transcript (Figuur 2A) of een afwijkende RNA dat som ingeleidewhere in het midden van het gen of stroomafwaarts van de terminator element (figuur 2B) of de polymerase transcriptie van de antisense richting vanaf het 3 'uiteinde van het gen (Figuur 2C). De streng-specifieke TRO assay gebruikt BrUTP beschreven kunnen onderscheiden of de waargenomen readthrough polymerase-promoter representeert geïnitieerde verlengde sense mRNA of een antisense transcript dat stroomafwaarts van het gen onderzochte ingeleid. We hebben met succes deze benadering gebruikt om de rol van Kin28 kinase beëindiging van transcriptie aangetoond in gist 2. Gebruikmakend van de aanpak hier laten we zien dat Rna14 nodig is voor de beëindiging van de transcriptie van ASC1 in gist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Deze werkwijze werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in artikel Medler, S en Ansari, A. 2.
1. Het kweken en oogsten van de cellen
- Start een 5 ml kweek van cellen in YPD-medium (10 g / l gistextract, 20 g / l pepton, 2% dextrose) uit een vers uitgestreken plaat Saccharomyces cerevisiae.
- Groeien de cellen overnacht in een orbitale schudder bij 30 ° C en 250 rpm.
- Verdun de nacht gegroeide kweek 100 keer tot een eindvolume van 100 ml in YPD medium in een 250-ml kolf war.
LET OP: Een totaal van 100 ml van de cultuur is nodig per TRO reactie; Als meerdere reacties nodig zijn, moet een groter volume kweek worden gebruikt. - Groeien de cellen tot een optische dichtheid van 0,8-1,0 bij 600 nm (600 A ~ 0,8-1,0).
- Oogst de cellen door centrifugatie bij 820 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C in een steriele 50 ml conische buis.
- Resuspendeer de cellen in 10 ml ijskoude TMN buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl) en incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
- Centrifugeer bij 820 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om de cellen te pelleteren. Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie.
2. permeabilisatie en Voorbereiden Cellen voor Run-on Assay
- Resuspendeer de cellen in 1 ml 0,6% sarkosyl oplossing op en neer pipetteren zachtjes met een afgeknot P 1000 tip. Breng de celsuspensie aan een gekoelde 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Schud de cellen voorzichtig bij 4 ° C gedurende 25 min op een platform shaker.
OPMERKING: Reactievaatjes moet worden verpakt in een 50 ml conische buis met ijs om een lage temperatuur te handhaven op het vermijden van elke nieuwe initiatie gebeurtenissen in de promoter in dit stadium. - Centrifugeer de cellen bij 1200 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C met een tafelblad gekoelde centrifuge.
- Zuig het supernatant om de overtollige vloeistof uit de per verwijderenmeabilized cel pellet.
3. transcriptie Run-on Reaction
- Voeg 150 ul van transcriptie oploopvlak buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCI, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT (dithiothreitol), 0,75 mM elk van ATP, CTP, GTP en BrUTP, 200 U RNase inhibitor) aan de gepermeabiliseerde cel pellet.
- Meng voorzichtig door en neer te pipetteren met behulp van een afgeknotte P 200 tip.
LET OP: Als de verwerking van meerdere monsters, houden alles op ijs tot alle monsters zijn klaar en ga dan verder naar de volgende stap. - Incubeer gedurende 5 minuten bij 30 ° C in een waterbad.
LET OP: Stel de incubatietijd tussen 1 en 5 minuten om een optimale integratie van BrUTP te garanderen in de ontluikende RNA. - Stop de reactie door toevoeging van 500 pi koude kant-en-klare RNA-isolatie reagens. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
4. RNA-extractie
- Voeg 200 pl zuur gewassen glasparels aan de cel ophanging,on (stap 3.4) en schud krachtig gedurende 20 minuten bij 4 ° C in een vortex mixer.
- Doorboren de bodem van de microcentrifugebuis met een hete 22 G naald en plaats het op de top van een 15 ml steriele conische buis.
- Centrifugeer bij 300 xg gedurende 1 min bij 4 ° C om het cellysaat te verzamelen. Breng de cellysaat een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg 500 ul koud RNA-isolatie reagens en 200 pl chloroform aan het cellysaat. Meng de inhoud van een vortex mixer en centrifugeer bij 16.168 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe microcentrifugebuis.
- Voeg een gelijk volume van koude fenol / chloroform / isoamylalcohol (125: 24: 1) pH 4-5. Schud op een vortex mixer en centrifugeer bij 16.168 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Breng de bovenste waterige fase die RNA naar een nieuwe microcentrifugebuis. Herhaal stap 4.6 nog twee keer.
- Om de finale RNA-bevattende waterfase, voeg 5 M NaCl stock om een eindconcentratie van 0,3 M. Voeg 3 maal het volume koude ethanol om het RNA te precipiteren.
- Incubeer gedurende 1 uur of overnacht bij -20 ° C.
OPMERKING: Voer de stappen 4,9-4,11 terwijl de anti-BrdU korrels worden gedurende het blokkeren (zie stap 5.3).
- Incubeer gedurende 1 uur of overnacht bij -20 ° C.
- Centrifugeer bij 16.168 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de RNA pellet in 100 ul van DEPC (diethylpyrocarbonaat) water.
- Gebruik een RNA-isolatie mini kit om het RNA te scheiden van de niet opgenomen nucleotiden BrUTP. Elueer het RNA uit de kolom met 100 gl RNase-vrij water.
- Incubeer de RNA in een 65 ° C waterbad gedurende 5 minuten en vervolgens over ijs gedurende ten minste 2 min.
5. affiniteitszuivering van BrUTP-gelabelde RNA
- Tot 25 pl anti-BrdU vaste parels, voeg 500 ul van 0,25x SSPE (Natrium Saline fosfaat EDTA) bindingsbuffer (20x SSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH 2 PO 4
- Herhaal stap 5,1 driemaal.
- Voeg 500 pl blokkerende buffer (1x bindingsbuffer, 0,1% polyvinylpyrrolidon, 1 mg ultrazuivere runderserumalbumine (BSA)) aan de korrels en schud voorzichtig gedurende 1-2 uur bij 4 ° C op een platform shaker.
- Was de korrels nog tweemaal met 500 ul bindingsbuffer, zoals beschreven in stap 5.1.
- Voeg 400 ul bindingsbuffer aan de korrels.
- Breng 100 pi van RNA (van stap 4,11) rechtstreeks aan de korrels. Incubeer onder voorzichtig schudden gedurende 1 - 2 uur bij 4 ° C op een platform shaker.
- Was de kralen achtereenvolgens met 500 ul bindingsbuffer, 500 pl buffer met laag zoutgehalte (0,2X SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween), 500 ul buffer met hoog zoutgehalte (0,25x SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 100 mM NaCl), en tweemaal met 500 ul van TET buffer (1x tE, 0,05% Tween), spinnen bij200 g gedurende 30 seconden bij 4 ° C tussen elke wassing.
- Elueer het BrUTP-gemerkte RNA parels achtereenvolgens tweemaal met 150 ul en eenmaal met 200 ui elutiebuffer (20 mM DTT, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS), door incubatie gedurende 4 min bij 42 ° C in een waterbad, gevolgd door kort centrifugeren tot korrels te scheiden van het supernatant.
6. Neerslag van BrUTP gelabelde RNA
- Voeg 500 ul koud fenol / chloroform / isoamylalcohol (125: 24: 1) pH 4-5 om de affiniteit gezuiverde BrUTP gelabeld RNA. Mengen op een vortex mixer en centrifugeer bij 16.168 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe microcentrifugebuis.
- Voeg 5 M NaCl voorraad tot een eindconcentratie van 0,3 M en 3 maal het volume koude ethanol naar het RNA te precipiteren.
- Incuberen bij -20 ° C overnacht.
- Verzamel het neergeslagen RNA door centrifugatie bij 16.168 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. </ Li>
- Verwijder de bovenstaande vloeistof en de pellet aan de lucht drogen gedurende 10 min.
- Resuspendeer de RNA pellet in 26 ul DEPC water.
- Bepaal de uiteindelijke RNA-concentratie door meting van de absorptie bij 260 nm met een spectrofotometer. Ook bepaalt de verhouding 260/280. Een verhouding ~ 2 duidt op een pure RNA monster.
- Bewaar de RNA monsters in aliquots bij -80 ° C totdat ze nodig voor cDNA-synthese.
7. Reverse transcriptie van BrUTP-gelabelde RNA
- Pas de RNA-concentratie tot 100 ng / ul met behulp van DEPC water. Gebruik 0,5 ug RNA voor elk cDNA-synthesereactie.
Opmerking: De concentratie van RNA-matrijs kan variëren 0,5-1,0 ug tot optimale cDNA-synthese te bereiken. - Reverse transcriberen het RNA met meerdere omgekeerde primers stroomafwaarts van het poly (A) website (stopplaats) zoals getoond in figuur 3A.
- Aan elke reverse transcriptie reactie, voeg 5 ul RNA template (0,5 ug), 1 uL dNTP mix (10 mM elk), 2 pl reverse primer C, D, E, F of G (50 uM elk) (zie figuur 3A) en nuclease vrij water. Het uiteindelijke reactievolume in elke buis 13 pi.
Opmerking: Het aantal reverse transcriptie reacties zullen afhangen van het aantal omgekeerde primers voor cDNA-synthese. Bijvoorbeeld, voor ASC1 vijf reverse primers werden gebruikt en dus werden vijf reverse transcriptie reacties opgezet. Label de buizen als C, D, E, F en G aan de hand van de reverse primer voor cDNA-synthese. - Incubeer de buizen met RNA-matrijs, dNTP mix en primers in een thermocycler bij 65 ° C gedurende 5 minuten aan een secundaire structurele conformatie te verwijderen, en daarna afkoelen tot 4 ° C gedurende ten minste 2 min.
- Voeg 1 pl reverse transcriptase (200 U / pl), 4 ui buffer en 2 ui 0,1 M DTT aan elke buis met het RNA-matrijs en primer (stap 7,4). Meng door pipetteren voorzichtig op en neer.
- Uitvoeren reverse transcriptie door het incuberen van het reactiemengsel in een thermocycler bij 42 ° C gedurende 60 minuten.
- Inactiveren reverse transcriptase bij 65 ° C gedurende 20 min.
- Bewaar de cDNA bij -20 ° C of naar de volgende stap.
8. Amplificatie van cDNA
- Voer de PCR-reactie voor amplificatie van elke cDNA-preparaat (aangeduid C, D, E, F en G ASC1) vanaf stap 7,8 als volgt: 3,0 pi cDNA sjabloon in stap 7,8, 1,0 pl voorwaartse primer B (10 uM), 1,0 ul reverse primer C of D of E of F of G (10 uM), 2,5 ui 10x polymerase PCR-buffer, 0,5 uL dNTP mix (10 mM elk), 1,0 pl MgCl2 (2,5 mM), 15,5 ui PCR kwaliteit water en 0,5 pl thermostabiele polymerase enzym.
OPMERKING: Verschillende verdunningen van cDNA template variërend van 1: 5 tot 1: 100 te worden getest om de productopbrengst PCR optimaliseren. Een enkele promoter-proximale forward primer gebruikt om cDNA te amplificerenverkregen met verschillende reverse primers. Bijvoorbeeld, één voorwaartse primer B vlakbij het promoter werd gebruikt in combinatie met vijf reverse primers van C naar G ASC1. BC, BD, BE, BG BF en werden in buizen respectievelijk aangeduid als C, D, E, F en G zoals getoond in figuur 3A. - Voer het PCR met de volgende thermische cyclus parameters: 1 cyclus 95 ° C gedurende 2 min (warme start voor het activeren van polymerase), 30 - 40 cycli 95 ° C gedurende 30 s (denaturatie), 54 ° C gedurende 15 s (hybridisatie) , 68 ° C gedurende 1 min (extensie), en 1 cyclus 68 ° C gedurende 5 min (laatste verlenging).
OPMERKING: De annealing temperatuur zal variëren afhankelijk van de specifieke primers wordt gebruikt en de verlenging zal variëren afhankelijk van de verwachte productgrootte. - Scheid het PCR product door elektroforese op 0,8%, 1,5% of 2% agarosegels afhankelijk van de verwachte grootte van het product.
- Kwantificeren PCR product zoals beschreven in El Kaderi et al. , 2012 11.
LET OP: U kunt ook gebruik maken van real-time RT-qPCR strategie om het bedrag van de ontluikende transcripten te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de toepasbaarheid van de BrUTP-streng-specifieke TRO procedure aan te tonen in het detecteren van een transcriptie terminatie defect, gebruikten we een beëindiging-defect is, temperatuurgevoelige mutant van RNA14 genoemd rna14-1. De rol van Rna14 in de beëindiging van de transcriptie door RNA-polymerase II werd aangetoond met behulp van de traditionele TRO test die RNA in de terminator-proximale gebied van geselecteerde genen 1 gedetecteerd. De detectie van RNA signaal buiten het terminator gebied rna14-1 de mutant bij de niet-permissieve temperatuur werd uitgelegd als de beëindiging defect. De waargenomen signaal, maar kan worden toegeschreven aan het doordringend transcriptie polymerase die transcriptie geïnitieerd ergens nabij het 3 'uiteinde van het gen zoals weergegeven in figuur 2B. Om overtuigend aan te tonen de rol van Rna14 in de beëindiging, voerden wij BrUTP-streng-specifieke TRO in het rna14-1mutant en de isogene wild type stam bij 37 ° C. We verwachtten dat de wild type stam, zal het TRO signaal beperkt tussen de promoter en terminator gebieden zoals weergegeven in figuur 1A. In de rna14-1 mutant echter de polymerase leest door het stopsignaal en het TRO signaal wordt gedetecteerd buiten het 3 'uiteinde van het gen zoals getoond in Figuur 1B en 2A.
Kort groeide ons de rna14-1 mutant en de isogene wild type cellen bij 25 ° C tot mid-log fase en vervolgens verschoven cellen aan 37 ° C gedurende drie uur. Transcriptie naloop assay werd uitgevoerd om BrUTP nemen in ontluikende RNA gesynthetiseerd door een actief transcriberen van RNA-polymerase zoals hierboven is beschreven. De BrUTP gelabelde RNA werd gezuiverd en reverse getranscribeerd met behulp van primers C, D, E, F en G in figuur 3A. Het overeenkomstige cDNA werd PCR geamplificeerd using primer paren BC, BD, BE, BF, en BG en gefractioneerd op agarosegels (Figuur 3B). Kwantificering van gels wordt getoond in figuur 3C. De aanwezigheid van PCR-geamplificeerde producten van de primer paren BE, BF en BG in het rna14-1 mutant weerspiegelt beëindiging lezen fenotype (Figuur 3B, laan 11-13, en figuur 3C, gebieden E, F en G). In de wild-type cellen, maar de TRO signaal beperkt tot de terminator element (Figuur 3B, lanen 2 en 3, en figuur 3C, regio C en D). Er was geen detecteerbaar signaal TRO buiten de terminator regio (Figuur 3B, laan 4 - 6, en figuur 3C, gebieden E, F en G). Zo kunnen we detecteren-promoter geïnitieerde ontluikende transcripten die lezen beëindiging signaal in de mutant, maar niet in het wild-type cellen, hetgeen bevestigt dat Rna14 een beëindiging factor.
Figuur 1: transcriptie Run-on (TRO) Assay detecteert de aanwezigheid van transcriptioneel actieve RNA-polymerase in verschillende regio's van een gen. (A) Bij beëindiging normaal is, er geen polymerase signaal buiten het terminatorgebied. (B) Na beëindiging defect, het polymerase in staat is de beëindiging uitgelezen signaal en kan worden gedetecteerd buiten het 3 'uiteinde van het gen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: strengs specifieke TRO Assay. De strengs specifieke TRO test kan detecteren of de aanwezigheid van een transcriptioneel actieve polymerase voorbij het 3 'uiteinde van tHij gen is een echte beëindiging defect te wijten aan een promotor geïnitieerde polymerase lezen door de beëindiging signaal (A), of is het gewoon een pervasively transcriberen polymerase transcriptie in sense richting (B), of is het de anti-sense ncRNA transcriberen polymerase initiëren van het 3 'uiteinde (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Rna14 is een Beëindiging Factor als Polymerase Leest via de Beëindiging Signaal in de rna14-1 Mutant. (A) Schematische weergave van ASC1 gen die de positie van de voorwaartse primer B en vijf reverse primers, C, D, E, F en G gebruikt voor cDNA-synthese gezuiverd BrUTP gelabelde RNA. (B) cDNA gemaakt van reverse primers C, D, E, F en G werd met PCR geamplificeerd met primers respectievelijk paren BC, BD, BE, BF en BG. (C) De kwantitatieve analyse van TRO gegevens getoond in (B) hierboven wildtype rna14-1 cellen bij 37 ° C. 5S RNA werd gebruikt als controle normalisatie. De foutbalken een volledige eenheid standaarddeviatie gebaseerd op een minimum van drie proeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De streng-specifieke TRO protocol hier gebruikt werd aangepast van het protocol dat wordt gebruikt voor het GRO-Seq (Global Run On-Sequencing) analyse in zoogdiercellen 12. We hebben met succes het protocol aangepast om ontluikende transcriptie studeren in gist. Om specifiek wat de transcriptie beëindiging defect, aangepast we het protocol verder door zich te ontdoen van de RNA-hydrolyse stap. Dit liet ons toe om specifiek detecteren volledige lengte ontluikende transcripten die geïnitieerd vanaf de transcriptie- startplaats nabij het promotorgebied.
Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol dat moet worden uitgevoerd met de grootst mogelijke voorzichtigheid aan een zinvol resultaat te krijgen. Ten eerste moet het protocol worden uitgevoerd met exponentieel groeiende gistcellen. De cellen in de log-fase (A 600 ~ 0,8-1,0) geven de beste resultaten als de meerderheid van de cellen in dit stadium zijn actief aan de groei en vertonen robuuste transcriptie. Ten tweede, de RNA-isolatie step moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd bij een temperatuur tussen 2-4 ° C. Ten derde, vóór affiniteitszuivering van Br-UMP gelabeld RNA, zonder rechtspersoonlijkheid BrUTP moet worden uit de RNA-bereiding verwijderd. We gebruikten een RNA kit kwijt BrUTP van het gezuiverde RNA-preparaat. Ten vierde, het gebruik van een robuuste reverse transcriptase is essentieel voor een succesvolle uitvoering van het protocol.
De strengs specifieke TRO protocol hier gebruikt heeft voordelen via Northern blot techniek detecteren de beëindiging gebrek is het gevoeliger, sneller en vertoont hogere resolutie. Dit protocol is ook beter dan de traditionele TRO protocol zoals de zin transcripten van de anti-sense transcripten kunnen onderscheiden en als het waargenomen resultaat door promotor geïnitieerde transcriptie of afwijkende transcriptie vanaf een promoter stroomafwaartse gebied. De streng-specifieke TRO protocol heeft een aantal beperkingen. Het is arbeidsintensief en tijdrovend dan gestage stat mRNA detectietechnieken. Het vereist veel cellen. Daarom kan de analyse van transcriptie van genen transcriberen vanaf een probleem.
We hebben met succes deze techniek gebruikt om de beëindiging defect in de RNA-polymerase II de transcriptie cyclus te bestuderen in gist 2. De benadering kan worden uitgebreid tot beëindiging van transcriptie bestuderen door RNA polymerase I en RNA polymerase III in gist ook. Met geschikte modificatie kunnen de benadering ook worden toegepast op de transcriptie terminatie defect bestuderen hogere eukaryoten. Algemeen is de techniek relatief goedkoop, zeer reproduceerbaar en vereist standaarduitrusting gebruikt in een laboratorium voor moleculaire biologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
References
- Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
- Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription. Sci Rep. 5, 12586 (2015).
- Richard, P., Manley, J. L. Transcription termination by nuclear RNA polymerases. Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).
- Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).
- Porrua, O., Libri, D. Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).
- Jacquier, A. The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs. Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).
- Xu, Z., et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).
- Neil, H., et al. Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).
- Clark, M. B., et al.
- Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast. Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).
- El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C). Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
