Abstract
Questo manoscritto descrive un protocollo per rilevare difetti trascrizione terminazione in vivo. Il protocollo TRO specifico filamento utilizzando BrUTP qui descritto è un potente approccio sperimentale per analizzare il difetto di terminazione della trascrizione in condizioni fisiologiche. Come il dosaggio TRO tradizionale, si basa sulla presenza di una polimerasi trascrizionalmente attivo oltre all'estremità 3 'del gene come indicatore di trascrizione terminazione difetti 1. Supera due principali problemi incontrati con il test TRO tradizionale. In primo luogo, esso può rilevare se la polimerasi lettura attraverso il segnale di terminazione è quello che ha avviato la trascrizione dal promotore-prossimale, o se è semplicemente rappresentando una polimerasi diffusamente trascrizione che ha avviato non specificamente da qualche nel corpo o 3 ' fine del gene. In secondo luogo, può distinguere se il segnale polimerasi trascrizionalmente attivo oltre laregione terminatore è veramente il translettura polimerasi senso mRNA di trascrizione o un segnale di RNA anti-senso non codificante terminator-iniziati. Brevemente, il protocollo prevede permeabilizzante le cellule di lievito in crescita esponenziale, permettendo ai trascritti che avviati in vivo di allungare in presenza del nucleotide BrUTP, purificare RNA BrUTP marcato dall'approccio affinità, trascrizione inversa del RNA nascente purificato e amplificando il cDNA usando primer specifici filamento che fiancheggiano il promotore e le regioni di terminazione del gene 2.
Introduction
Il ciclo di trascrizione eucariotica si compone di tre fasi principali; iniziazione, l'allungamento e la terminazione. La terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II è costituito da due distinte fasi, interdipendenti 3. Il primo passo prevede la scissione, poliadenilazione e il rilascio di mRNA dal modello, ed è immediatamente seguita dalla seconda fase, segnata dal disimpegno della polimerasi dal modello. La corretta terminazione è di fondamentale importanza per il riciclaggio della polimerasi durante l'iniziazione / ripresa della trascrizione, per evitare l'interferenza con la trascrizione dei geni a valle, e per mantenere la trascrizione aberranti sotto controllo limitando trascrizione di pervasiva non codificante RNA 4, 5. Nonostante i recenti progressi, la risoluzione è di gran lunga il meno passo capito del ciclo di trascrizione RNA polimerasi II. Un test terminazione affidabile è essenziale per studiare il meccanismo underlying terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II in vivo.
Un certo numero di approcci sperimentali sono utilizzati per rilevare il difetto di terminazione in un gene trascrizione attivamente in condizioni fisiologiche. Questi includono Northern blot, fattore di terminazione Chip (immunoprecipitazione della cromatina) e il saggio TRO tradizionale. Ognuna di queste tecniche hanno alcuni vantaggi e svantaggi. Il saggio TRO tradizionali utilizzati per essere l'approccio più affidabile e sensibile per la rilevazione di un difetto di terminazione della trascrizione in vivo 1. Questo test localizza le molecole polimerasi trascrizionalmente attivi su diverse regioni di un gene all'interno della cella. In condizioni normali, il saggio dimostra molecole polimerasi trascrizionalmente impegnati rigorosamente distribuiti tra la regione promotore e terminatore del gene (Figura 1A). Alla cessazione difettoso, tuttavia, la polimerasi è in grado di leggere il segnale di terminazionee viene rilevato nella regione a valle del 'fine del gene (Figura 1B) 3.
Un difetto terminazione della trascrizione si manifesta in presenza di una polimerasi di senso trascrizione che ha avviato dalla regione promotore-prossimale, ed essere in grado di leggere il segnale di terminazione, continua trascrivere la regione a valle della estremità 3 'di un gene, come mostrato in figura 2A. Con la realizzazione che il genoma eucariotico presenta schiacciante trascrizione diffusa in senso così come le direzioni anti-senso e intorno a un gene 6, 7, 8, 9, 10, divenne presto chiaro che il saggio TRO tradizionale non può rilevare se il segnale polimerasi a valle di un gene rappresenta una trascrizione promotore-avviata (Figura 2A) o un RNA aberrante che ha avviato somewhere nel mezzo del gene oa valle dell'elemento terminatore (Figura 2B), o la trascrizione polimerasi in direzione anti-senso dall'estremità 3 'del gene (Figura 2C). Il dosaggio specifico TRO-strand utilizzando BrUTP qui descritto può distinguere se il segnale polimerasi translettura osservato rappresenta promotore-avviato mRNA senso esteso o un trascritto antisenso che ha avviato valle del gene in esame. Abbiamo utilizzato con successo questo approccio per dimostrare il ruolo delle chinasi Kin28 a cessazione della trascrizione in erba di lievito 2. Utilizzando l'approccio qui dimostriamo che Rna14 è necessario per la terminazione della trascrizione di ASC1 in erba lievito.
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Protocol
NOTA: Questo metodo è stato utilizzato nell'articolo ricerca riportata nel Medler, S e Ansari, A. 2.
1. la coltura e la raccolta delle cellule
- Avviare una cultura 5 mL di cellule in terreno YPD (estratto di 10 g / L di lievito, 20 g / L peptone, 2% di destrosio) da una piastra di Saccharomyces cerevisiae appena striato.
- Far crescere le cellule durante la notte in un agitatore orbitale a 30 ° C e 250 rpm.
- Diluire la coltura cresciuta overnight 100 orari ad un volume finale di 100 ml in mezzo YPD in un pallone da 250 mL confuso.
NOTA: E 'necessario un totale di 100 ml di coltura per reazione TRO; se sono necessari più reazioni, deve essere utilizzato un volume maggiore di cultura. - Far crescere le cellule ad una densità ottica pari a 0,8 - 1,0 in 600 nm (A 600 ~ 0,8 - 1.0).
- Raccogliere le cellule per centrifugazione a 820 xg per 5 minuti a 4 ° C in un contenitore sterile tubo da 50 ml.
- Risospendere le cellule in 10 ml di ghiaccio freddo bu TMNffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl) e incubare in ghiaccio per 5 min.
- Centrifugare a 820 xg per 5 minuti a 4 ° C per sedimentare le cellule. Rimuovere delicatamente il surnatante tramite aspirazione.
2. permeabilizzante e preparare cellule per Run-on Assay
- Risospendere le cellule in 1 ml di soluzione Sarkosyl 0,6% pipettando su e giù delicatamente con un tronco di P 1000 punta. Trasferire la sospensione cellulare ad una refrigerata 1,5 ml provetta.
- Agitare gentilmente le cellule a 4 ° C per 25 minuti su un agitatore piattaforma.
NOTA: i tubi microcentrifuga devono essere imballati in una provetta da 50 ml con ghiaccio per mantenere una temperatura fredda, evitando possibilità di eventuali nuovi eventi di iniziazione che si verificano al promotore in questa fase. - Centrifugare le cellule a 1200 xg per 6 minuti a 4 ° C usando un tavolo refrigerata centrifuga.
- Aspirare delicatamente il surnatante per rimuovere il liquido in eccesso dal alpellet cellulare meabilized.
3. Trascrizione Run-on Reaction
- Aggiungere 150 ml di trascrizione di run-in di buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 2 mM DTT (ditiotreitolo), 0,75 mm ciascuno di ATP, CTP, GTP, e BrUTP, 200 U RNAsi inibitore) al pellet di cellule permeabilizzate.
- Mescolare delicatamente pipettando su e giù con un tronco di P 200 punta.
NOTA: Se l'elaborazione di più campioni, tenere tutto in ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono pronti e quindi procedere alla fase successiva. - Incubare per 5 minuti a 30 ° C in un bagno d'acqua.
NOTA: Regolare il tempo di incubazione tra 1 e 5 min per assicurare integrazione ottimale del BrUTP nel RNA nascente. - Arrestare la reazione aggiungendo 500 ml di freddo reagente isolamento RNA pronto per l'uso. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. RNA Estrazione
- Aggiungere 200 ml di perline di vetro lavata con acido al suspensi cellularesu (passo 3,4), e agitare vigorosamente per 20 minuti a 4 ° C in un vortex.
- Forare il fondo della provetta utilizzando un 22 G ago caldo e posizionarlo sulla parte superiore di un tubo conico sterile da 15 ml.
- Centrifugare a 300 xg per 1 min a 4 ° C per raccogliere il lisato cellulare. Trasferire il lisato cellulare di una provetta da microcentrifuga da 1,5.
- Aggiungere 500 ml di RNA freddo reagente isolamento e 200 ml di cloroformio al lisato cellulare. Mescolare il contenuto su un vortex e centrifugare a 16.168 xg per 20 minuti a 4 ° C.
- Trasferire la fase acquosa superiore ad una nuova provetta.
- Aggiungere un volume uguale di fenolo freddo / cloroformio / alcool isoamilico (125: 24: 1) pH 4-5. Agitare vigorosamente su un vortex e centrifugare a 16.168 xg per 15 min a 4 ° C.
- Trasferire la fase acquosa contenente RNA superiore ad una nuova provetta. Ripetere il punto 4.6 altre due volte.
- Per la fase acquosa finale di RNA contenenti, aggiungere 5 M NaCl stock per ottenere una concentrazione finale di 0,3 M. Aggiungere 3 volte la quantità in volume di etanolo freddo per precipitare l'RNA.
- Incubare per 1 ora o durante la notte a -20 ° C.
NOTA: Eseguire le operazioni da 4.9 - 4.11, mentre le perle anti-BrdU vengono incubate per bloccare (vedi punto 5.3).
- Incubare per 1 ora o durante la notte a -20 ° C.
- Centrifugare a 16.168 xg per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di RNA in 100 ml di acqua DEPC (dietilpirocarbonato).
- Utilizzare un isolamento mini kit di RNA per separare l'RNA dai nucleotidi BrUTP prive di personalità giuridica. Eluire l'RNA dalla colonna con 100 ml di acqua RNasi-free.
- Incubare l'RNA in un bagno d'acqua a 65 ° C per 5 minuti e poi trasferire in ghiaccio per almeno 2 min.
5. Affinità Purificazione di RNA BrUTP marcato
- Per 25 ml di anti-BrdU stabilì perline, aggiungere 500 ml di 0,25x SSPE (sodio fosfato salino EDTA) tampone di legame (20x PESS: 3 M di NaCl, 0,2 M NaH 2 PO 4
- Ripetere il passaggio 5.1 tre volte.
- Aggiungere 500 ml di tampone di bloccaggio (1x Binding Buffer, 0.1% polivinilpirrolidone, 1 mg di ultra-puri albumina sierica bovina (BSA)) per le perline e agitare delicatamente per 1 - 2 ore a 4 ° C su un agitatore piattaforma.
- Lavare le perline altre due volte con 500 ml di tampone di legame, come descritto al punto 5.1.
- Aggiungere 400 ml di Binding Buffer ai talloni.
- Trasferire 100 ml di RNA (dal punto 4.11) direttamente ai talloni. Incubare con delicata agitazione per 1 - 2 ore a 4 ° C su un agitatore piattaforma.
- Lavare le perline in sequenza con 500 ml di tampone di legame, 500 ml di tampone basso contenuto di sale (0.2x PESS, 1 mM EDTA, 0.05% Tween), 500 ml di tampone di sale (0,25x PESS, 1 mM EDTA, 0,05% di Tween, 100 mM NaCl), e due volte con 500 ml di buffer di TET (1x TE, 0,05% di Tween), filatura a200 xg per 30 s a 4 ° C tra ogni lavaggio.
- Eluire l'RNA BrUTP marcato da perline in sequenza, due volte con 150 microlitri e una volta con 200 ml di tampone di eluizione (20 mM DTT, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS), incubando per 4 min a 42 ° C in un bagno di acqua seguita da una breve centrifuga per separare perline dal surnatante.
6. Precipitazione di RNA BrUTP Labeled
- Aggiungere 500 ml di freddo fenolo / cloroformio / alcool isoamilico (125: 24: 1) pH 4-5 per l'affinità purificato BrUTP etichettati RNA. Miscelare su vortex e centrifugare a 16.168 xg per 15 min a 4 ° C.
- Trasferire la fase acquosa superiore ad una nuova provetta.
- Aggiungere 5 M NaCl magazzino per ottenere una concentrazione finale di 0,3 M e 3 volte il volume di etanolo freddo per precipitare l'RNA.
- Incubare a -20 ° C per una notte.
- Raccogliere il RNA precipitato per centrifugazione a 16.168 xg per 30 min a 4 ° C. </ Li>
- Rimuovere il surnatante e consentire il pellet asciugare all'aria per 10 min.
- Risospendere il pellet di RNA in 26 ml di acqua DEPC.
- Determinare la concentrazione di RNA finale misurando l'assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro. Inoltre, determinare il rapporto di 260/280. Un rapporto ~ 2 è indicativa di un campione di RNA puro.
- Conservare i campioni di RNA in aliquote a -80 ° C fino al momento della sintesi del DNA.
7. trascrizione inversa di RNA BrUTP marcato
- Regolare la concentrazione di RNA a 100 ng / ml con acqua DEPC. Utilizzare 0,5 mg di RNA per ogni reazione di sintesi del DNA.
NOTA: La concentrazione di template di RNA può variare da 0,5 a 1.0 mg per ottenere sintesi ottimale cDNA. - Reverse trascrivere l'RNA utilizzando più primer inversa disegnati a valle del sito (sito di terminazione) poli (A) come mostrato nella figura 3A.
- Per ogni reazione di trascrizione inversa, aggiungere 5 ml di RNA template (0,5 mg), 1 dNTP mix microlitri (10 mM ciascuno), 2 ml di primer reverse C, D, E, F o G (50 pM ciascuno) (vedere la Figura 3A) e acqua priva di nucleasi. Il volume finale di reazione in ciascuna provetta è di 13 microlitri.
NOTA: Il numero di reazioni di trascrizione inversa dipenderà dal numero di primer inversi utilizzati per la sintesi di cDNA. Ad esempio, per ASC1 cinque primer inverso sono stati utilizzati e quindi cinque reazioni trascrizione inversa sono stati istituiti. Etichettare i tubi come C, D, E, F e G sulla base del primer reverse utilizzato per la sintesi di cDNA. - Incubare le provette contenenti RNA template, miscela dNTP e primer in un termociclatore a 65 ° C per 5 minuti per rimuovere ogni conformazione strutturale secondaria, e poi raffreddare a 4 ° C per almeno 2 min.
- Aggiungere 1 ml trascrittasi (200 U / mL) invertono, 4 microlitri di buffer e 2 ml di 0,1 M DTT in ogni provetta contenente il modello di RNA e innesco (passo 7,4). Mescolare pipettando gentilmente su e giù.
- Eseguire trascrizione inversa incubando la miscela di reazione in un termociclatore a 42 ° C per 60 min.
- Inattivare i trascrittasi inversa a 65 ° C per 20 min.
- Conservare il cDNA a -20 ° C o procedere al passo successivo.
8. amplificazione di cDNA
- Eseguire la reazione di PCR per l'amplificazione di ciascun preparato cDNA (etichettata C, D, E, F e G per ASC1) dal punto 7.8 come segue: template 3,0 microlitri di cDNA dal punto 7.8, 1.0 ml forward primer B (10 mM), 1,0 microlitri inversa Primer C o 10x polimerasi tampone D o e o F o G (10 micron), 2,5 microlitri PCR, 0,5 microlitri miscela dNTP (10 mm ciascuno), 1,0 ml MgCl 2 (2,5 mm), 15,5 acqua di grado microlitri PCR, e 0,5 microlitri termostabile polimerasi dell'enzima.
NOTA: diverse diluizioni di cDNA che va da 1: 5 a 1: 100 dovrebbero essere testati per ottimizzare la resa del prodotto di PCR. Un primer forward singolo promotore-prossimale sarà utilizzato per amplificare il cDNAottenuta utilizzando diversi inneschi inversa. Ad esempio, un singolo innesco B avanti situato vicino il promotore è stato usato in combinazione con cinque primer inversi da C a G per ASC1. BC, BD, BE, BF e BG sono stati usati in provette etichettate rispettivamente come C, D, E, F e G, come mostrato nella Figura 3A. - Eseguire la PCR utilizzando i seguenti parametri ciclo termico: 1 ciclo di 95 ° C per 2 min (hot start per l'attivazione della polimerasi), 30 - 40 cicli a 95 ° C per 30 s (denaturazione), 54 ° C per 15 s (ricottura) , 68 ° C per 1 min (estensione) e 1 ciclo a 68 ° C per 5 min (estensione finale).
NOTA: La temperatura di ricottura può variare a seconda delle primers specifici utilizzati e il tempo di estensione varia a seconda delle dimensioni del prodotto atteso. - Separare il prodotto di PCR mediante elettroforesi su 0,8%, 1,5%, o 2 gel di agarosio% a seconda della dimensione prevista del prodotto.
- Quantificare il prodotto di PCR come descritto in El Kaderi et al. , 2012 11.
NOTA: In alternativa, utilizzare strategia in tempo reale RT-qPCR per quantificare la quantità di trascritti nascenti.
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Representative Results
Per dimostrare l'applicabilità della procedura TRO BrUTP-strand-specifica nel rilevare un difetto di terminazione della trascrizione, abbiamo utilizzato un mutante sensibile alla temperatura di cessazione difettoso di RNA14 chiamato rna14-1. Il ruolo di Rna14 in cessazione di trascrizione di RNA polimerasi II è stata dimostrata con il saggio TRO tradizionale che ha rilevato l'RNA nella regione Terminator-prossimale di geni selezionati 1. La rilevazione di segnale RNA oltre la regione di terminazione nel mutante rna14-1 alla temperatura non permissiva stato interpretato come il difetto di terminazione. Il segnale osservato, tuttavia, potrebbe essere ascritta alla polimerasi trascrizione diffusamente che ha avviato trascrizione da qualche parte vicino all'estremità 3 'del gene, come mostrato nella Figura 2B. Per dimostrare definitivamente il ruolo di Rna14 cessazione, abbiamo effettuato TRO BrUTP-strand-specifico nel rna14-1mutante e il isogenico ceppo wild-type a 37 ° C. Ci si aspettava che nel ceppo selvatico, il segnale TRO sarà limitata tra le regioni promozione e di terminazione come illustrato nella Figura 1A. Nel mutante rna14-1, tuttavia, la polimerasi leggerà attraverso il segnale di terminazione e il segnale TRO verrà rilevato là all'estremità 3 'del gene, come mostrato nella Figura 1B e 2A.
In breve, siamo cresciuti il mutante rna14-1 e le sue isogenici cellule di tipo selvatico a 25 ° C a fase mid-log e poi spostato le cellule a 37 ° C per tre ore. run-on Trascrizione saggio è stato eseguito per incorporare BrUTP in RNA nascente sintetizzato da una RNA polimerasi trascrive attivamente come descritto sopra. Il BrUTP etichettato RNA è stato purificato e reverse trascritto utilizzando primer C, D, E, F, e G mostrato nella Figura 3A. Il corrispondente cDNA è stato amplificato PCR USIcoppie ng di primer BC, BD, BE, BF, e BG e frazionato su gel di agarosio (Figura 3B). Quantificazione di gel è mostrato in Figura 3C. La presenza di prodotti PCR amplificati dalle coppie di primer BE, BF, e BG nel mutante rna14-1 riflette una terminazione leggere fenotipo (Figura 3B, Corsia 11 - 13 e Figura 3C, regioni E, F e G). Nelle cellule wild type, tuttavia, il segnale TRO era limitata fino all'elemento terminatore (Figura 3B, corsie 2 e 3; e Figura 3C, regioni C e D). Non c'era alcun segnale TRO rilevabile oltre la regione di terminazione (Figura 3B, corsia 4 - 6; e Figura 3C, regioni E, F e G). Così, abbiamo potuto rilevare i trascritti nascenti promotore avviato che leggono attraverso il segnale di terminazione nel mutante ma non nelle cellule di tipo selvatico, confermando in tal modo che Rna14 è un fattore di terminazione.
Figura 1: Trascrizione Run-on (TRO) Assay rileva la presenza di trascrizionalmente attiva RNA polimerasi in diverse regioni di un gene. (A) Quando la terminazione è normale, non vi è alcun segnale polimerasi oltre la regione terminatore. (B) Alla cessazione difettoso, la polimerasi è in grado di leggere il segnale di terminazione e può essere rilevato là all'estremità 3 'del gene. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strand-specifica TRO Assay. Il dosaggio specifico TRO-strand grado di rilevare se la presenza di una polimerasi trascrizionalmente attivo oltre all'estremità 3 'di tha gene è un vero difetto cessazione dovuta a una polimerasi promoter avviata la lettura attraverso il segnale di terminazione (A), oppure è semplicemente una trascrizione polimerasi pervasively trascrivere in direzione senso (B), oppure è l'anti-senso ncRNA trascrizione polimerasi avvio dal 'estremità 3 (C). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rna14 è un fattore di terminazione come Polymerase Legge attraverso il segnale di terminazione nel mutante rna14-1. (A) Rappresentazione schematica del ASC1 gene che mostra la posizione del primer B avanti e cinque primers inversa, C, D, E, F, e G utilizzato per la sintesi di cDNA di purificato BrUTP marcato RNA. (B) cDNA a base di primer inverso C, D, E, F e G era PCR amplificato utilizzando rispettivamente i primer coppie BC, BD, BE, BF e BG. (C) L'analisi quantitativa dei dati riportati nella TRO (B) al di sopra di wild-type e le cellule rna14-1 a 37 ° C. 5 S RNA è stato usato come controllo di normalizzazione. Le barre di errore rappresentano una unità piena di deviazione standard sulla base di un minimo di tre prove. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo specifica TRO-filo usato qui è stato adattato dal protocollo utilizzato per GRO-Seq (Global Run On-Sequencing) analisi in cellule di mammifero 12. Abbiamo modificato con successo il protocollo di studiare la trascrizione nascente in erba lievito. Per analizzare in particolare il difetto di terminazione della trascrizione, abbiamo regolato il protocollo ulteriormente per sbarazzarsi della fase di RNA idrolisi. Questo ci ha permesso di rilevare in particolare la lunghezza trascrizioni nascenti che avviate dal sito di inizio della trascrizione nei pressi della regione del promotore.
Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo che devono essere eseguite con la massima cautela per ottenere un risultato significativo. Innanzitutto, il protocollo deve essere eseguita con crescita esponenziale cellule di lievito. Le cellule in fase di log (A 600 ~ 0,8-1,0) danno i migliori risultati come la maggior parte delle cellule in questa fase sono attivamente in crescita e mostrano trascrizione robusto. In secondo luogo, l'isolamento dell'RNA step deve essere eseguita più rapidamente possibile ad una temperatura tra di 2 - 4 ° C. In terzo luogo, prima di purificazione per affinità di Br-UMP etichettato RNA, senza personalità giuridica BrUTP deve essere rimosso dalla preparazione RNA. Abbiamo usato un kit di RNA per sbarazzarsi di BrUTP dalla preparazione RNA purificato. In quarto luogo, l'uso di un robusto trascrittasi inversa è fondamentale per buona riuscita del protocollo.
Il protocollo TRO specifico filamento usato qui ha vantaggi rispetto alla tecnica Northern blot nel rilevare il difetto di terminazione come è più sensibile, più veloce e presenta una risoluzione maggiore. Questo protocollo è anche migliore rispetto al tradizionale protocollo TRO come può distinguere i trascritti senso dai trascritti antisenso e se il risultato osservato è dovuta alla trascrizione o trascrizione aberrant promotore-avviata a partire da una zona a valle promotore. Il protocollo specifica TRO-filamento ha alcune limitazioni. E 'più laborioso e richiede tempo che costante vate tecniche di rilevazione di mRNA. Richiede gran numero di cellule. Pertanto, l'analisi della trascrizione di geni bassi trascrizione potrebbe essere un problema.
Abbiamo utilizzato con successo questa tecnica per studiare il difetto di terminazione nel ciclo trascrizione RNA polimerasi II in erba lievito 2. L'approccio può essere esteso per studiare la terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi I e RNA polimerasi III nel lievito pure. Con opportune modifiche, il metodo può essere applicato anche per studiare il difetto di terminazione della trascrizione in eucarioti superiori. Nel complesso, la tecnica è relativamente poco costoso, altamente riproducibile e richiede attrezzature standard utilizzato in un laboratorio di biologia molecolare.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
References
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