Abstract
Эта рукопись описывает протокол для обнаружения терминации транскрипции дефекта в естественных условиях. Нить-специфический протокол TRO использованием BrUTP, описанный здесь мощный экспериментальный подход для анализа дефекта терминации транскрипции в физиологических условиях. Как и в традиционном анализе TRO, он опирается на наличие транскрипционно активного полимеразой за 3' - конца гена в качестве индикатора терминации транскрипции дефекта 1. Он преодолевает две основные проблемы, связанные с традиционным анализом TRO. Во-первых, он может обнаружить, если полимеразной чтение через сигнал завершения является тот, который инициировал транскрипцию с промотора проксимальных области, или если он просто представляя pervasively переписывание полимеразы, вызвавшее неспецифически откуда-то в теле или 3 ' конец гена. Во-вторых, он может различить, если транскрипционно активный сигнал полимеразной за пределытерминатор область поистине readthrough мРНК чувство транскрибировать полимеразы или некодирующей РНК сигнала несмысловая терминатор инициируемого. В кратком изложении, протокол включает в себя permeabilizing экспоненциально растущие клетки дрожжей, позволяя транскрипты , которые инициированы в естественных условиях , чтобы удлинить в присутствии нуклеотид BrUTP, очистив BrUTP-меченой РНК с помощью аффинной подход, обратный транскрибировать очищенный возникающую РНК и амплификации кДНК с использованием прядей-специфических праймеров , фланкирующих промотор и терминатор области гена 2.
Introduction
Эукариотической транскрипции цикл состоит из трех основных этапов; инициация, удлинение и прекращение. Терминации транскрипции с помощью РНК - полимеразы II состоит из двух различных, взаимозависимых шагов 3. Первый этап включает в себя расщепление, полиаденилирования и высвобождение мРНК из шаблона, и сразу же следует второй стадии, отмеченной разъединении полимеразы из шаблона. Надлежащее прекращение имеет решающее значение для рециркуляции полимеразы во время инициации / повторной инициации транскрипции, для предотвращения помех транскрипции генов вниз по течению, а также для поддержания аберрантную транскрипции в проверке путем ограничения транскрипции распространенным некодирующие РНК 4, 5. Несмотря на недавние успехи, прекращение на сегодняшний день является наименее изученной стадией цикла транскрипции РНК-полимеразы II. Надежный анализ прекращения имеет важное значение для изучения механизма по вкладуг прекращение транскрипции РНК - полимеразы II в естественных условиях.
Ряд экспериментальных подходов используются для обнаружения дефектов терминации в активно транскрибировать ген в физиологических условиях. К ним относятся блоттинга, фактор прекращения Обломок (иммунопреципитации хроматина) и традиционного TRO анализа. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки. Традиционный анализ TRO имел обыкновение быть самым надежным и чувствительным подходом для обнаружения дефекта терминации транскрипции в естественных условиях 1. Этот анализ локализует транскрипционно активных молекул-полимеразу на разных районах гена внутри клетки. В нормальных условиях, анализ показывает , транскрипционно молекулы полимеразы , заходят самые перспективные строго распределены между промотором и терминатором области гена (рис 1А). При неисправном прекращении, однако полимераза не может прочитать сигнал завершенияи обнаруживается в области ниже по потоку от 'конца гена (рис 1б) 3.
Дефект терминации транскрипции проявляется в присутствии чувственное транскрибировать полимеразы, инициировавшего из промотора проксимальных области, и будучи не в состоянии прочитать сигнал завершения, продолжает расшифровывать область вниз по течению от 3' - конца гена , как показано на рисунке 2A. С осознанием того, что эукариотический геном проявляет подавляющую распространяющееся транскрипцию в смысле, а также направления антисмысловые и вокруг гена 6, 7, 8, 9, 10, вскоре стало ясно , что традиционный анализ TRO не может обнаружить , если сигнал полимеразы вниз по течению гена представляет собой промотор инициированное транскрипт (фиг.2А) или аберрантных РНК, вызвавшее сомаewhere в середине гена или вниз по потоку от терминатора элемента (Фигура 2В) или полимеразной транскрибировать в направлении антисмысловой от 3' - конца гена (фиг.2с). Прядь конкретных TRO анализа с использованием BrUTP, описанный здесь можно выделить, если наблюдаемый сигнал readthrough полимераза представляет промотор инициированное мРНК обобщенно или антисмысловой транскрипт, который инициировал вниз по течению гена под экспертизой. Мы успешно использовали этот подход , чтобы продемонстрировать роль Kin28 киназы в терминации транскрипции в почкующихся дрожжей 2. Используя подход здесь мы покажем , что Rna14 требуется для прекращения транскрипции ASC1 в почкующихся дрожжей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот метод был использован в научно - исследовательской статье сообщается в Medler, S и Ансари, A. 2.
1. Культивирование и сбор клеток
- Начало 5 мл культуры клеток в среде YPD (10 г / л дрожжевого экстракта, 20 г / л пептона, 2% раствор декстрозы) из свежеприготовленного прожилками Saccharomyces CEREVISIAE пластины.
- Grow клеток в течение ночи в орбитальном шейкере при 30 ° С и 250 оборотах в минуту.
- Развести на ночь выросшую культуру в 100 раз до конечного объема 100 мл в YPD среде в колбе с перегородками 250 мл.
Примечание: В общей сложности 100 мл культуры необходимо на реакции TRO; если требуется несколько реакций, необходимо использовать больший объем культуры. - Grow клетки до оптической плотности 0,8 - 1,0 при 600 нм (А 600 ~ 0,8 - 1,0).
- Урожай клетки центрифугированием при 820 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С в стерильной 50 мл коническую трубку.
- Ресуспендируют клеток в 10 мл охлажденного льдом TMN бушельffer (10 мМ Трис-HCl , рН 7,5, 5 мМ MgCl 2, 100 мМ NaCl) , и инкубируют на льду в течение 5 мин.
- Центрифуга при 820 х г в течение 5 мин при 4 ° С для осаждения клеток. Осторожно удалите супернатант аспирацией.
2. Permeabilizing и получения клеток для Run-на анализе
- Ресуспендируют клеток в 1 мл 0,6% раствора саркозила пипетированием вверх и вниз , осторожно , используя усеченную Р 1000 наконечника. Передача суспензии клеток в 1,5 мл охлажденной трубки микроцентрифужных.
- Взболтать клетки осторожно при температуре 4 ° С в течение 25 мин на платформе шейкера.
Примечание: микропробирок должны быть упакованы в 50 мл коническую трубку со льдом для поддержания пониженной температуры, избегая возможность каких-либо новых инициирующих событий, происходящих на промоторе на данном этапе. - Центрифуга клеток при 1200 х г в течение 6 мин при температуре 4 ° С, используя настольную охлаждаемой центрифуге.
- Аккуратно аспирата супернатант, чтобы удалить лишнюю жидкость из перmeabilized осадок клеток.
3. Транскрипция выбега реакции
- Добавьте 150 мкл транскрипции выбега буфера (50 мМ Трис-HCl , рН 7,5, 100 мМ КСl, 10 мМ MgCl 2, 2 мМ ДТТ (дитиотреитола), 0,75 мМ каждого из АТФ, CTP, GTP и BrUTP 200 U - РНКазы ингибитор) к проницаемыми клеточного осадка.
- Осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз , используя усеченную P 200 наконечника.
ПРИМЕЧАНИЕ: При обработке нескольких образцов, держать все на льду, пока все образцы не будут готовы, а затем перейти к следующему шагу. - Выдержите в течение 5 мин при 30 ° С в водяной бане.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время инкубации от 1 до 5 мин, чтобы обеспечить оптимальное включение BrUTP в зарождающейся РНК. - Остановить реакцию путем добавления 500 мкл холодного реагента для выделения РНК готова к употреблению. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
4. Экстракция РНК
- Добавить 200 мкл кислоты вымытые стеклянные шарики клетки suspensi(этап 3.4), и энергично встряхивают в течение 20 мин при 4 ° С в вихревом смесителе.
- Прокол в нижней части трубки микроцентрифужных, используя горячий 22 G иглу и поместить его на верхней стерильной конической трубе 15 мл.
- Центрифуга при 300 мкг в течение 1 мин при температуре 4 ° С для сбора клеточного лизата. Передача лизата клеток в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Добавьте 500 мкл реагента изоляции холодного РНК и 200 мкл хлороформа до клеточного лизата. Смешайте содержимое на вихревом смесителе и центрифуге при 16,168 х г в течение 20 мин при 4 ° C.
- Перенести верхнюю водную фазу к новой трубки микроцентрифужных.
- Добавить равный объем холодного фенол / хлороформ / изоамиловый спирт (125: 24: 1) рН 4-5. Встряхивать на вихревом смесителе и центрифуге при 16,168 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
- Перенести верхнюю водную фазу, содержащую РНК в новую пробирку микроцентрифужных. Повторите шаг 4,6 еще два раза.
- К конечной водной фазы РНК-содержащий, добавляют 5 М NaCl КТВЗРK, чтобы получить конечную концентрацию 0,3 М. Добавить 3 раза объем холодного этанола, чтобы осадить РНК.
- Инкубировать в течение 1 ч или в течение ночи при -20 ° С.
Примечание: Выполните шаги 4.9 - 4.11 в то время как анти-BrdU шарики инкубируют для блокировки (см шаг 5.3).
- Инкубировать в течение 1 ч или в течение ночи при -20 ° С.
- Центрифуга на 16,168 мкг в течение 20 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок РНК в 100 мкл DEPC (диэтилпирокарбонатом) воды.
- С помощью мини-набора изоляции РНК, чтобы отделить РНК неинкорпорированного нуклеотидов BrUTP. Элюции РНК из колонки с помощью 100 мкл РНКазы воды.
- Выдержите РНК в водяной бане C 65 ° в течение 5 мин, а затем переносить их на льду в течение не менее 2 мин.
5. Сродство Очистка BrUTP-меченой РНК
- К 25 мкл анти-BrdU , осевшие шарики, добавьте 500 мкл 0.25x псл (натрий ЭДТА солевым фосфатным) связывание буфера (20х ГНПП: 3 М NaCl, 0,2 М NaH 2 PO 4
- Повторите шаг 5.1 в три раза.
- Добавить 500 мкл блокирующего буфера (1х буфере для связывания, 0,1% поливинилпирролидона, 1 мг сверхчистой бычий сывороточный альбумин (БСА)) к гранулам и осторожно в течение 1 встряхивания - 2 ч при 4 ° С на качалке с платформой.
- Вымойте бисером еще два раза с 500 мкл буфера для связывания, как описано в пункте 5.1.
- Добавить 400 мкл буфера для связывания с гранулами.
- Перенести 100 мкл РНК (со стадии 4.11) непосредственно к шарикам. Инкубируют при осторожном встряхивании в течение 1 - 2 ч при 4 ° С на качалке с платформой.
- Промыть шарики последовательно с 500 мкл буфера для связывания 500 мкл буфера низкой соли (0,2 x SSPE, 1 мМ ЭДТА, 0,05% Tween), 500 мкл буфера высокой соли (0.25x псл, 1 мМ ЭДТА, 0,05% Tween, 100 мМ NaCl) и дважды 500 мкл буфера ТЕТ (1x TE, 0,05% твин), вращающийся на200 мкг в течение 30 с при температуре 4 ° C между каждой промывке.
- Элюируют BrUTP-меченой РНК из бисера последовательно, дважды 150 мкл и один раз 200 мкл буфера для элюции (20 мМ ДТТ, 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 0,1% ДСН), путем инкубирования в течение 4 мин при 42 ° с в водяной бане с последующим коротким отжимом отделить бусинки от надосадочной жидкости.
6. Осаждение BrUTP меченой РНК
- Добавить 500 мкл холодного фенол / хлороформ / изоамиловый спирт (125: 24: 1) рН 4 - 5 с аффинно-очищенные BrUTP меченой РНК. Смешать на вихревом смесителе и центрифуге при 16,168 х г в течение 15 мин при 4 ° C.
- Перенести верхнюю водную фазу к новой трубки микроцентрифужных.
- Добавьте 5 М NaCl запас, чтобы получить конечную концентрацию 0,3 М и 3-кратного объема холодного этанола, чтобы осадить РНК.
- Инкубируйте при -20 ° С в течение ночи.
- Собирают выпавшую в осадок РНК центрифугированием при 16,168 х г в течение 30 мин при температуре 4 ° С. </ Li>
- Удалить супернатант и позволяют гранулы высохнуть на воздухе в течение 10 мин.
- Ресуспендируют осадок РНК в 26 мкл DEPC воды.
- Определить конечную концентрацию РНК путем измерения оптической плотности при 260 нм с использованием спектрофотометра. Кроме того, определяют соотношение 260/280. Отношение ~ 2 свидетельствует о чистом образце РНК.
- Хранить образцы РНК в виде аликвот при -80 & deg; С до тех пор, пока требуется для синтеза кДНК.
7. обратной транскрипции BrUTP-меченой РНК
- Регулировка концентрации РНК до 100 нг / мкл с использованием DEPC воды. С помощью 0,5 мкг РНК для каждой реакции синтеза кДНК.
Примечание: Концентрация РНК-матрицы, может изменяться от 0,5 до 1,0 мкг до достижения оптимального синтеза кДНК. - Обратный транскрибировать РНК с использованием нескольких обратных праймеров , сконструированных ниже сайта (окончание сайта) поли (А) , как показано на рисунке 3А.
- Для каждой реакции обратной транскрипции, добавляют 5 мкл РНК templatе (0,5 мкг), 1 мкл дНТФ смеси (10 мМ каждый), 2 мкл обратного праймера C, D, E, F или G (50 мкМ каждого) (см 3A) и нуклеазы свободной воды. Конечный объем реакционной смеси в каждую пробирку 13 мкл.
Примечание: Число обратных реакций транскрипции будет зависеть от количества обратных праймеров, используемых для синтеза кДНК. Например, для ASC1 использовали пять обратных праймеров и , следовательно , пять обратной реакции транскрипции были установлены. Этикетка труб, как C, D, E, F и G на основе обратного праймера, используемого для синтеза кДНК. - Инкубировать пробирки, содержащие РНК-матрицу, дНТФ смесь и праймеров в амплификатор при 65 ° С в течение 5 мин для удаления любого вторичного структурной конформации, а затем охлаждают до 4 & deg; С в течение по меньшей мере 2 мин.
- Добавить 1 мкл обратной транскриптазы (200 ед / мкл), 4 мкл буфера и 2 мкл 0,1 М ДТТ в каждую пробирку, содержащую РНК-матрицы, и праймер (этап 7.4). Смешайте с помощью пипетки осторожно вверх и вниз.
- Выполните обратную транскрипцию путем инкубации реакционной смеси в амплификаторе при 42 ° С в течение 60 мин.
- Инактивировать обратной транскриптазы при 65 ° С в течение 20 мин.
- Хранить кДНК при -20 ° С или перейти к следующему шагу.
8. Амплификация кДНК
- Проведение реакции ПЦР - амплификации каждого синтеза кДНК (меченой С, D, Е, F и G для ASC1) с шага 7.8 следующим образом : шаблон 3,0 мкл кДНК , полученной на стадии 7.8, 1,0 мкл прямого праймера B (10 мкМ), 1,0 мкл обратный праймер , С или D или Е или F или G (10 мкМ), 2,5 мкл 10х - полимеразы ПЦР - буфера, 0,5 мкл дНТФ смеси (10 мМ каждого), 1,0 мкл MgCl 2 (2,5 мМ), 15,5 воды класса мкл ПЦР, и 0,5 мкл термостабильный фермент полимеразы.
Примечание: Различные разведения матрицы кДНК в диапазоне от 1: 5 до 1: 100 должна быть проверена, чтобы оптимизировать выход ПЦР-продукта. Один промотор-проксимальный прямой праймер будет использоваться для амплификации кДНКполученные с использованием различных обратных праймеров. Например, один прямой праймер B расположен вблизи промотора был использован в сочетании с пятью обратных праймеров от С до G для ASC1. BC, BD, BE, BF и BG были использованы в трубах помечены как C, D, E, F и G соответственно , как показано на рисунке 3А. - Выполните ПЦР с использованием следующих тепловых параметров езда на велосипеде: 1 цикл 95 ° С в течение 2 мин (горячий старт для активации полимеразы), 30 - 40 циклов 95 ° С в течение 30 с (денатурация), 54 ° С в течение 15 сек (отжиг) , 68 & deg; С в течение 1 мин (расширение), и 1 цикл 68 ° С в течение 5 мин (конечное расширение).
Примечание: Температура отжига будет варьироваться в зависимости от конкретных праймеров используется, а время расширение будет меняться в зависимости от ожидаемого размера продукта. - Отделить ПЦР-продукта с помощью электрофореза на 0,8%, 1,5%, или на 2% агарозном геле, в зависимости от ожидаемого размера продукта.
- Количественная ПЦР - продукта , как описано в Эль - Kaderi и др. , 2012 11.
Примечание: В качестве альтернативы, использовать стратегию в реальном масштабе времени RT-КПЦР для количественного определения количества зарождающихся транскриптов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать применимость BrUTP-нитка-специфической процедуры TRO при обнаружении дефекта терминации транскрипции, мы использовали терминации исправный, чувствительный к температуре мутант RNA14 называется rna14-1. Роль Rna14 в прекращении транскрипции с помощью РНК - полимеразы II была продемонстрирована с использованием традиционного TRO анализа , который обнаружил РНК в терминатора-проксимальной области выбранных генов 1. Обнаружение сигнала РНК за пределами области терминатора в rna14-1 мутанта в непермиссивной температуре истолковано как дефект терминации. Наблюдаемый сигнал, тем не менее, можно было бы приписать pervasively транскрибирования полимеразой , который инициации транскрипции где - то вблизи 3' - конца гена , как показано на фигуре 2В. Для того, чтобы убедительно доказать роль Rna14 в прекращении, мы провели BrUTP-ручьевая специфичную TRO в rna14-1Мутант и изогенных штамма дикого типа при 37 ° С. Мы ожидали , что в штамме дикого типа, сигнал TRO будет ограничен между промотором и терминатором областей , как показано на рисунке 1А. В rna14-1 мутанта, однако полимераза прочтет через сигнал терминации и сигнал TRO будет обнаружен за 3' - концом гена , как показано на рисунке 1В и 2А.
Если коротко, то мы росли в rna14-1 мутанта и его изогенных клеток дикого типа при 25 ° С до середины логарифмического , а затем сместился клетки до 37 ° С в течение трех часов. Транскрипция выбега анализ проводили включать BrUTP в зарождающейся РНК синтезируется активно транскрибировать РНК-полимеразы, как описано выше. BrUTP меченой РНК очищали и обратной транскрипции с использованием праймеров , C, D, E, F и G , показанные на рисунке 3А. Соответствующая кДНК ПЦР-амплификации USIпары нг праймера BC, BD, BE, BF и BG и фракционированного на агарозном геле (рис 3б). Количественное гелей показано на фиг.3С. Присутствие ПЦР - амплифицированных продуктов из пар праймеров BE, BF и BG в rna14-1 мутанта отражает завершение чтения через фенотип (рис 3B, Lane 11 - 13 и 3С, области Е, F и G). В клетках дикого типа, однако, сигнал TRO был ограничен до элемента терминации (фигура 3В, Дорожки 2 и 3, а также на фиг.3С, области C и D). Там обнаружено не было ТРО сигнала за пределы области терминатора (фигура 3В, дорожка 4 - 6, и 3С, области E, F и G). Таким образом, мы могли бы обнаружить промотор по инициативе зарождающиеся транскриптов, которые считывают через сигнал терминации в мутанта, но не в клетках дикого типа, тем самым подтверждая, что Rna14 является фактором прекращения.
Рисунок 1: Транскрипция выбега (TRO) Анализ определяет наличие транскрипционно активной РНК - полимеразы в различных областях гена. (А) При прекращении нормально, нет полимеразной сигнала за пределы области терминатора. (В) В случае неисправной прекращения полимераза не может прочитать сигнал терминации и может быть обнаружена за 3' - конца гена. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Strand конкретных TRO анализа. Прядь конкретных ТРО анализ может обнаружить, если присутствие транскрипционно активного полимеразы за пределы конца 3'-тон ген представляет собой истинный дефект прекращение в связи с промотором инициируемого полимеразы чтения через сигнала терминации (A), или это просто pervasively транскрибировать полимеразной Цитирование в смысловом направлении (В), или это несмысловая ncRNA транскрибировать полимеразу инициирующий от 3 'конце (с). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Rna14 представляет собой фактор , как прекращение полимеразной Читает через терминирующий сигнал в rna14-1 мутанта. (А) Схематическое изображение гена ASC1 , показывающий положение праймера B вперед и пять обратных праймеров, C, D, E, F и G использовали для синтеза кДНК очищенного BrUTP-меченой РНК. (B) кДНК сделаны из обратного праймеров C, D, E, F и G был ПЦР - амплификации с использованием праймеров пары BC, BD, BE, BF и BG соответственно. (C) Количественный анализ данных Тро , показанных в (B) выше , в дикого типа и rna14-1 клеток при 37 ° С. 5 S РНК использовали в качестве контроля нормализации. Столбики ошибок обозначают один полный блок стандартного отклонения, основываясь на минимуме трех испытаний. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нить-специфический протокол TRO , используемый здесь был адаптирован из протокола , используемого для анализа GRO-Seq (Global Run On-секвенирования) в клетках млекопитающих 12. Мы успешно изменили протокол для изучения формирующегося транскрипции в почкующихся дрожжей. Для того, чтобы конкретно проанализировать дефект терминации транскрипции, мы скорректировали протокол дальше, избавившись от стадии гидролиза РНК. Это позволило нам специфичному детектированию полной длины формирующиеся транскрипты, которые инициированы с сайта инициации транскрипции вблизи области промотора.
Есть несколько важных шагов в протоколе, которые должны быть выполнены с особой осторожностью, чтобы получить значимый результат. Во-первых, этот протокол должен быть выполнен с экспоненциально растущих клеток дрожжей. Клетки в логарифмической фазе (A 600 ~ 0,8 - 1,0) дают лучшие результаты , так как большинство клеток на данном этапе активно растут и демонстрируют устойчивую транскрипцию. Во-вторых, выделение РНК-йер должна быть выполнена как можно быстрее, при температуре в интервале от 2 - 4 ° С. В-третьих, перед тем аффинной очистки Br-UMP меченой РНК, некорпоративная BrUTP должны быть удалены из препарата РНК. Мы использовали набор РНК, чтобы избавиться от BrUTP из очищенного препарата РНК. В-четвертых, использование надежной обратной транскриптазы имеет решающее значение для успешного выполнения протокола.
Нить-специфический протокол TRO, используемый здесь имеет преимущества по сравнению с Северной блот техники при обнаружении дефекта завершения, как он более чувствителен, быстрее и имеет более высокое разрешение. Этот протокол также лучше, чем традиционный протокола TRO, как он может различать смысловые транскрипты от антисмысловых транскриптов и, если наблюдаемый результат обусловлен промотором инициации транскрипции или аберрантной транскрипции, начиная с нижней по потоку области промотора. Нить-специфический протокол TRO имеет некоторые ограничения. Это более трудоемкий и чем установившемся й разпоел методы обнаружения мРНК. Для этого требуется большое количество ячеек. Таким образом, анализ транскрипции генов низких переписывание может быть проблемой.
Мы успешно использовали эту технику для изучения терминации дефекта в цикле транскрипции РНК - полимеразы II в почкующихся дрожжей 2. Подход может быть продлен до окончания исследования транскрипции с помощью РНК-полимеразы I и РНК-полимеразы III в дрожжах, а также. С соответствующими изменениями, подход также может быть применен для изучения дефектов терминации транскрипции в высших эукариот. В целом, этот метод является относительно недорогим, высоко воспроизводимым и требует стандартного оборудования, используемого в лаборатории молекулярной биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
References
- Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
- Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription. Sci Rep. 5, 12586 (2015).
- Richard, P., Manley, J. L. Transcription termination by nuclear RNA polymerases. Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).
- Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).
- Porrua, O., Libri, D. Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).
- Jacquier, A. The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs. Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).
- Xu, Z., et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).
- Neil, H., et al. Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).
- Clark, M. B., et al.
- Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast. Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).
- El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C). Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
