Abstract
Este manuscrito describe un protocolo para la detección de defecto de terminación de la transcripción in vivo. El protocolo TRO capítulo específico utilizando BrUTP describe aquí es un enfoque experimental poderosa para analizar el defecto terminación de la transcripción en condiciones fisiológicas. Al igual que el ensayo de TRO tradicional, se basa en la presencia de una polimerasa transcripcionalmente activo más allá del extremo 3 'del gen como un indicador de un defecto de terminación de la transcripción 1. Supera dos problemas importantes con el ensayo TRO tradicional. En primer lugar, se puede detectar si la polimerasa lectura a través de la señal de terminación es el que inicia la transcripción de la región próxima al promotor, o si es simplemente representa una polimerasa penetrante transcripción que inició de manera no específica de algún lugar del cuerpo o de la 3 ' final del gen. En segundo lugar, se puede distinguir si la señal de la polimerasa transcripcionalmente activo más allá de laregión terminadora es realmente la polimerasa mRNA sentido transcripción de lectura completa o una señal de ARN anti-sentido no codificante terminador iniciada. Brevemente, el protocolo implica permeabilización de las células de levadura en crecimiento exponencial, permitiendo que las transcripciones que iniciaron in vivo para alargar en presencia del nucleótido BrUTP, purificando el ARN marcado con BrUTP por el enfoque de afinidad, transcripción inversa el ARN naciente purificada y amplificar el ADNc usando cebadores específicos de cadena que flanquean las regiones de terminación del gen promotor y 2.
Introduction
El ciclo de la transcripción eucariótica consiste en tres pasos principales; iniciación, elongación y terminación. La terminación de la transcripción por la RNA polimerasa II consta de dos etapas distintas interdependientes 3. El primer paso implica la escisión, de poliadenilación y liberación de ARNm a partir de la plantilla, y es seguida inmediatamente por el segundo paso, marcado por el desacoplamiento de la polimerasa a partir de la plantilla. La terminación adecuada es crucial para el reciclado de la polimerasa durante la iniciación / reinicio de la transcripción, para la prevención de interferencia con la transcripción de genes aguas abajo, y para mantener la transcripción aberrante bajo control mediante la limitación de la transcripción de RNA penetrante 4, 5 no codificante. A pesar de los recientes avances, la terminación es de lejos el menos comprendido paso del ciclo de la transcripción de ARN polimerasa II. Un ensayo de terminación fiable es esencial para el estudio del mecanismo de underlying terminación de la transcripción por la ARN polimerasa II in vivo.
Un número de enfoques experimentales se utilizan para detectar el defecto de terminación en un gen de la transcripción de forma activa en condiciones fisiológicas. Estos incluyen transferencia Northern, chip factor de terminación (Inmunoprecipitación de cromatina) y el ensayo TRO tradicional. Cada una de estas técnicas tienen algunas ventajas y desventajas. El ensayo TRO tradicional solía ser el método más fiable y sensible para la detección de un defecto de terminación de la transcripción in vivo 1. Este ensayo se localizan las moléculas de polimerasa transcripcionalmente activos en las diferentes regiones de un gen dentro de la célula. En condiciones normales, el ensayo muestra moléculas transcriptionally comprometidos polimerasa estrictamente distribuidos entre el promotor y el terminador del gen de la región (Figura 1A). A la terminación defectuosa, sin embargo, la polimerasa es incapaz de leer la señal de terminacióny se detecta en la región corriente abajo del extremo 3 'del gen (Figura 1B).
Un defecto terminación de la transcripción se manifiesta en la presencia de un sentido de transcripción de la polimerasa que inicia a partir de la región próxima al promotor, y siendo incapaz de leer la señal de terminación, continúa la transcripción de la región aguas abajo del extremo 3 'de un gen, como se muestra en la figura 2A. Con la comprensión de que el genoma eucariota exhibe la transcripción omnipresente abrumadora en el sentido, así como las direcciones de sentido opuesto en los alrededores de un gen 6, 7, 8, 9, 10, pronto se hizo evidente que el ensayo TRO tradicional no puede detectar si la señal de la polimerasa aguas abajo de un gen representa una transcripción de promotor-iniciado (Figura 2A) o un ARN aberrante que inició somewhere en el medio del gen o aguas abajo del elemento terminador (Figura 2B), o la transcripción de la polimerasa en la dirección anti-sentido desde el extremo 3 'del gen (Figura 2C). El ensayo TRO específica de hebra usando BrUTP describe aquí puede distinguir si la señal de la polimerasa readthrough observado representa mRNA sentido extendido promotor-iniciado o un transcrito antisentido que inició aguas abajo del gen bajo examen. Hemos utilizado con éxito este método para demostrar el papel de Kin28 quinasa en la terminación de la transcripción de levadura en ciernes 2. Empleando el enfoque que aquí se muestra que Rna14 es necesaria para la terminación de la transcripción de levadura en ciernes ASC1.
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Protocol
NOTA: Este método fue utilizado en el artículo de investigación publicada en Medler, S y Ansari, A. 2.
1. cultivo y recogida de las células
- Iniciar un ml de cultivo de 5 de las células en medio YPD (10 g de extracto / L de levadura, 20 g / L de peptona, 2% de dextrosa) a partir de una placa de Saccharomyces cerevisiae recién rayada.
- Cultivar las células durante la noche en un agitador orbital a 30 ° C y 250 rpm.
- Diluir el cultivo crecido durante la noche de 100 veces a un volumen final de 100 ml en medio YPD en un matraz desconcertado a 250 ml.
NOTA: Se necesita un total de 100 ml de cultivo por reacción TRO; si se requieren múltiples reacciones, se debe utilizar un volumen mayor de la cultura. - Cultivar las células a una densidad óptica de 0,8 a 1,0 a 600 nm (A 600 ~ 0,8-1,0).
- Recoger las células por centrifugación a 820 xg durante 5 min a 4 ° C en un tubo cónico estéril de 50 ml.
- Resuspender las células en 10 ml de hielo frío bu TMNffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, NaCl 100 mM) y se incuba en hielo durante 5 min.
- Centrifugar a 820 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar las células. Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración.
2. permeabilización de las células y se preparan para la ejecución de Ensayo
- Resuspender las células en 1 ml de solución de sarcosil 0,6% pipeteando arriba y abajo suavemente con una punta truncada P 1000. Transferir la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga refrigerada 1,5 mL.
- Agitar suavemente las células a 4 ° C durante 25 minutos en un agitador de plataforma.
NOTA: Tubos de microcentrífuga deben ser empacados en un tubo cónico de 50 ml con hielo para mantener una temperatura fría, evitando la posibilidad de nuevos sucesos de inicio que se producen en el promotor en esta etapa. - Centrifugar las células a 1200 xg durante 6 minutos a 4 ° C utilizando una centrífuga de mesa refrigerada.
- Se aspira suavemente el sobrenadante para eliminar cualquier exceso de líquido por cadasedimento celular meabilized.
3. Transcripción de ejecución de Reacción
- Añadir 150 l de transcripción run-en tampón (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2, DTT 2 mM (ditiotreitol), 0,75 mM cada uno de ATP, CTP, GTP, y BrUTP, 200 U de RNasa inhibidor) al sedimento celular permeabilizada.
- Mezclar suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo usando una punta truncada P 200.
NOTA: Si el procesamiento de múltiples muestras, mantener todo en hielo hasta que todas las muestras están listas y luego proceder al siguiente paso. - Se incuba durante 5 minutos a 30 ° C en un baño de agua.
NOTA: Ajuste el tiempo de incubación entre 1 y 5 minutos para asegurar la óptima incorporación de BrUTP en el ARN naciente. - Se detiene la reacción mediante la adición de 500 l de reactivo de aislamiento de ARN fría lista para su uso. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
4. La extracción de RNA
- Añadir 200 l de perlas de vidrio lavadas con ácido a la Suspensiòn celularen (paso 3.4) y agitar enérgicamente durante 20 minutos a 4 ° C en un mezclador de vórtice.
- Perforar el fondo del tubo de microcentrífuga utilizando una aguja de 22 G caliente y colocarlo en la parte superior de un tubo cónico estéril de 15 ml.
- Centrifugar a 300 xg durante 1 min a 4 ° C para recoger el lisado celular. Transferir el lisado celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Añadir 500 l de reactivo de aislamiento de ARN en frío y 200 l de cloroformo al lisado celular. Mezclar el contenido en un mezclador de vórtice y se centrifuga a 16.168 xg durante 20 min a 4 ° C.
- Transferir la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga.
- Añadir un volumen igual de frío fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (125: 24: 1) pH 4-5. Agitar vigorosamente en un vórtex y se centrifuga a 16.168 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Transferir la fase que contiene RNA acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga. Repita el paso 4.6 dos veces más.
- A la fase acuosa que contiene RNA-final, añadir 5 M NaCl stock para obtener una concentración final de 0,3 M. Añadir 3 veces el volumen de etanol frío para precipitar el ARN.
- Incubar durante 1 hora o durante la noche a -20 ° C.
NOTA: Realice los pasos 4.9 - 4.11, mientras que las perlas anti-BrdU se incubaron durante bloqueo (véase el paso 5.3).
- Incubar durante 1 hora o durante la noche a -20 ° C.
- Centrifugar a 16.168 xg durante 20 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet de ARN en 100 l de agua DEPC (pirocarbonato de dietilo).
- Utilice un mini kit de aislamiento de ARN para separar el ARN de los nucleótidos no incorporados BrUTP. Eluir el ARN de la columna con 100 l de agua libre de RNasa.
- Incubar el ARN en un baño de agua a 65 ° durante 5 min y luego se transfieren a hielo durante al menos 2 min.
5. Purificación por Afinidad de ARN marcado con BrUTP
- Al 25 l de anti-BrdU se establecieron cuentas, añadir 500 l de 0,25 x SSPE (sodio fosfato salino EDTA) tampón de unión (20x SSPE: NaCl 3 M, 0,2 M NaH 2 PO 4
- Repita el paso 5.1 tres veces.
- Añadir 500 l de tampón de bloqueo (1x tampón de unión, 0,1% de polivinilpirrolidona, 1 mg ultra-pura albúmina de suero bovino (BSA)) a las perlas y agitar suavemente durante 1 - 2 horas a 4 ° C en un agitador de plataforma.
- Lavar las perlas dos veces más con 500 l de tampón de unión, como se describe en el paso 5.1.
- Añadir 400 l de tampón de unión a las perlas.
- Transferir 100 l de ARN (de la etapa 4.11) directamente a las perlas. Incubar con agitación suave durante 1 - 2 horas a 4 ° C en un agitador de plataforma.
- Lavar el perlas secuencialmente con 500 l de tampón de unión, 500 l de tampón de sal baja (SSPE 0,2x, EDTA 1 mM, 0,05% Tween), 500 l de tampón de sal alta (0.25x SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% de Tween, NaCl 100 mM), y dos veces con 500 l de tampón de TET (1x TE, 0,05% de Tween), girando a200 xg durante 30 s a 4 ° C en entre cada lavado.
- Eluir el ARN marcado con BrUTP a partir de perlas secuencialmente, dos veces con 150 l y una vez con 200 l de tampón de elución (DTT 20 mM, NaCl 150 mM, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 1 mM, 0,1% de SDS), incubando durante 4 minutos a 42 ° C en un baño de agua seguido de un breve centrifugado para separar los granos del sobrenadante.
6. La precipitación de ARN BrUTP Etiquetada
- Añadir 500 l de frío fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (125: 24: 1) pH 4 - 5 a la afinidad purificada BrUTP etiquetados ARN. Mezclar en un mezclador de vórtice y se centrifuga a 16.168 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Transferir la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga.
- Añadir 5 M NaCl común conseguir una concentración final de 0,3 M y 3 veces el volumen de etanol frío para precipitar el ARN.
- Se incuba a -20 ° C durante la noche.
- Recoger el ARN precipitado por centrifugación a 16.168 xg durante 30 min a 4 ° C. </ Li>
- Eliminar el sobrenadante y dejar que el precipitado se seque al aire durante 10 minutos.
- Resuspender el precipitado de ARN en 26 l de agua DEPC.
- Determinar la concentración final de ARN mediante la medición de la absorbancia a 260 nm usando un espectrofotómetro. Además, determinar la relación de 260/280. Una relación de ~ 2 es indicativa de una muestra de ARN puro.
- Almacenar las muestras de ARN en alícuotas a -80 ° C hasta que sea necesario para la síntesis de cDNA.
7. La transcripción inversa del ARN marcado con BrUTP
- Ajustar la concentración de ARN a 100 ng / l usando agua DEPC. Utilizar 0,5 g de ARN para cada reacción de síntesis de ADNc.
NOTA: La concentración de molde de RNA puede variar de 0,5 a 1,0 mg para lograr la síntesis de ADNc óptimo. - Transcripción inversa del ARN usando múltiples cebadores inversos diseñados aguas abajo del sitio (sitio de terminación) de poli (A) como se muestra en la Figura 3A.
- Para cada reacción de transcripción inversa, añadir 5 l de ARN template (0,5 g), 1 l de mezcla de dNTP (10 mM cada uno), 2 l de cebador inverso C, D, E, F o G (50 mM cada uno) (véase la figura 3A) y agua libre de nucleasa. El volumen de reacción final en cada tubo es de 13 l.
NOTA: El número de reacciones de transcripción inversa dependerá del número de cebadores inversos utilizados para la síntesis de ADNc. Por ejemplo, para ASC1 se utilizaron cinco cebadores inversos y por lo tanto cinco reacciones de transcripción inversa se establecieron. Etiquetar los tubos como C, D, E, F y G sobre la base del cebador inverso usado para la síntesis de ADNc. - Incubar los tubos que contienen plantilla de ARN, mezcla de dNTP y cebadores en un termociclador a 65 ° C durante 5 min para eliminar cualquier conformación estructural secundaria, y después se enfría a 4 ° C durante al menos 2 min.
- Añadir 1 l transcriptasa inversa (200 U / l) reversa, 4 l de tampón y 2 l de DTT 0,1 M a cada tubo que contiene la plantilla de ARN y el cebador (paso 7.4). Mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Realizar la transcripción inversa mediante la incubación de la mezcla de reacción en un termociclador a 42 ° C durante 60 min.
- Inactivar la transcriptasa inversa a 65 ° C durante 20 min.
- Almacenar el ADNc a -20 ° C o proceder al siguiente paso.
8. La amplificación de cDNA
- Realizar la reacción de PCR para la amplificación de cada preparación de cDNA (con la etiqueta C, D, E, F y G para ASC1) de la etapa 7.8 de la siguiente manera: Modelo de 3,0 l de cDNA de la etapa 7.8, 1.0 l cebador directo B (10 mM), 1,0 l cebador C inversa o 10x de la polimerasa PCR buffer D o e o F o G (10 mM), 2,5 l, 0,5 l de la mezcla dNTP (10 mM cada uno), 1,0 l de MgCl 2 (2,5 mM), 15,5 agua de grado l PCR, y 0.5 enzima polimerasa termoestable l.
NOTA: Las diferentes diluciones de cDNA plantilla que va de 1: 5 a 1: 100 debería realizarse una prueba para optimizar el rendimiento del producto de PCR. Un cebador directo único promotor-proximal se utiliza para amplificar cDNAobtenido utilizando diferentes cebadores inversos. Por ejemplo, se utilizó un cebador directo solo B situado cerca del promotor en combinación con cinco cebadores inversos de C a G para ASC1. BC, BD, BE, BF y BG se utilizaron en tubos etiquetados como C, D, E, F y G, respectivamente, como se muestra en la Figura 3A. - Ejecutar la PCR utilizando los siguientes parámetros de ciclo térmico: 1 ciclo de 95 ° C durante 2 min (arranque en caliente para la activación de la polimerasa), 30 - 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s (desnaturalización), 54 ° C durante 15 s (recocido) , 68 ° C durante 1 min (extensión), y 1 ciclo de 68 ° C durante 5 min (extensión final).
NOTA: La temperatura de hibridación puede variar dependiendo de los cebadores específicos que se utiliza y el tiempo de extensión varía dependiendo del tamaño de producto esperado. - Separar el producto de PCR por electroforesis en 0,8%, 1,5%, o 2% geles de agarosa, según el tamaño esperado del producto.
- Cuantificar el producto de PCR como se describe en El Kaderi et al. , 2012 11.
NOTA: Como alternativa, utilice estrategia en tiempo real RT-PCR cuantitativa para cuantificar la cantidad de transcritos nacientes.
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Representative Results
Para demostrar la aplicabilidad del procedimiento TRO BrUTP cadena específica en la detección de un defecto de terminación de la transcripción, hemos utilizado un mutante sensible a la temperatura de terminación defectuosa de RNA14 llama rna14-1. El papel de Rna14 en la terminación de la transcripción por la ARN polimerasa II se demostró usando el ensayo de TRO tradicional que detectó ARN en la región del terminador-proximal de genes seleccionados 1. La detección de la señal de RNA más allá de la región del terminador en el mutante rna14-1 a la temperatura no permisiva fue interpretado como el defecto de terminación. La señal observada, sin embargo, podría atribuirse a la transcripción de la polimerasa penetrante que inicia la transcripción de algún lugar cerca del extremo 3 'del gen como se muestra en la Figura 2B. Para demostrar de manera concluyente el papel de Rna14 en la terminación, se realizó TRO BrUTP cadena específica en el rna14-1mutante y la cepa de tipo salvaje isogénicas a 37 ° C. Nos espera que en la cepa de tipo salvaje, se verá limitada la señal TRO entre las regiones de promotor y terminador como se muestra en la Figura 1A. En el mutante rna14-1, sin embargo, la polimerasa va a leer a través de la señal de terminación y se detecta la señal de TRO más allá del extremo 3 'del gen como se muestra en la Figura 1B y 2A.
En pocas palabras, que creció el mutante rna14-1 y sus células de tipo salvaje isogénicas a 25 ° C a mediados de la fase de registro y luego desplazan las celdas de 37 ° C durante tres horas. carrera en la transcripción ensayo se realizó para incorporar BrUTP en ARN naciente sintetizado por una ARN polimerasa transcripción activa como se describe anteriormente. El BrUTP ARN marcado se purificó y se transcribió inversamente usando cebadores C, D, E, F, y G que se muestran en la Figura 3A. El ADNc correspondiente se amplificó por PCR USIpares de cebadores ng BC, BD, BE, BF y BG y se fraccionó en geles de agarosa (Figura 3B). La cuantificación de los geles se muestra en la Figura 3C. La presencia de productos de PCR amplificados a partir de los pares de cebadores BE, BF, BG y en el mutante rna14-1 refleja una terminación leer a través de fenotipo (Figura 3B, Lane 11-13; y la Figura 3C, las regiones E, F y G). En las células de tipo salvaje, sin embargo, la señal de TRO se limitaba hasta el elemento terminador (Figura 3B, carriles 2 y 3; y la Figura 3C, las regiones C y D). No hubo señal detectable TRO más allá de la región de terminación (Figura 3B, Lane 4-6; y la Figura 3C, las regiones E, F y G). Por lo tanto, se podría detectar las transcripciones nacientes de promotor-iniciado que leen a través de la señal de terminación en el mutante pero no en las células de tipo salvaje, lo que confirma que Rna14 es un factor de terminación.
Figura 1: Transcripción de ejecución en (TRO) Ensayo detecta la presencia de ARN polimerasa transcripcionalmente activo en las diferentes regiones de un gen. (A) Cuando la terminación es normal, no hay señal de la polimerasa más allá de la región del terminador. (B) A la terminación defectuosa, la polimerasa es incapaz de leer la señal de terminación y se puede detectar más allá del extremo 3 'del gen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ensayo TRO Strand-específica. El ensayo TRO capítulo específico puede detectar si la presencia de una polimerasa transcripcionalmente activo más allá del extremo 3 'de tque el gen es un verdadero defecto de terminación debido a una polimerasa promotor iniciada por la lectura a través de la señal de terminación (A), o es simplemente una transcripción de la polimerasa penetrante transcribir en el sentido de dirección (B), o es el anti-sentido NcRNA transcripción de la polimerasa iniciar desde el extremo 3 '(C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Rna14 es un factor de terminación como la polimerasa lee a través de la señal de terminación en el mutante rna14-1. (A) Representación esquemática del gen ASC1 que muestra la posición del cebador directo B y cinco cebadores inversos, C, D, E, F, y G utiliza para la síntesis de ADNc de ARN marcado con BrUTP purificada. (B) ADNc a partir de cebadores inversos C, D, E, F y G se amplificó por PCR utilizando los pares de cebadores BC, BD, BE, BF y BG, respectivamente. (C) El análisis cuantitativo de los datos mostrados en la TRO (B) por encima de tipo salvaje y las células rna14-1 a 37 ° C. 5 S RNA se utilizó como el control de normalización. Las barras de error representan una unidad completa de la desviación estándar en base a un mínimo de tres ensayos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo TRO capítulo específico utilizado aquí es una adaptación del protocolo utilizado para GRO-Sec (Global Run on-Sequencing) análisis en células de mamíferos 12. Hemos modificado con éxito el protocolo para estudiar la transcripción incipiente levadura en ciernes. Para analizar específicamente el defecto terminación de la transcripción, se ajustó el protocolo adicional mediante la eliminación de la etapa de hidrólisis de ARN. Esto nos permitió detectar específicamente la longitud naciente transcripciones completas que iniciaron desde el sitio de inicio de transcripción cerca de la región promotora.
Hay varios pasos críticos en el protocolo que se deben realizar con la mayor precaución para obtener un resultado significativo. En primer lugar, el protocolo debe ser realizado con células de levadura en crecimiento exponencial. Las células en la fase de registro (A 600 ~ 0.8 - 1.0) dará los mejores resultados que la mayoría de las células en esta etapa están creciendo activamente y muestran la transcripción robusta. En segundo lugar, el aislamiento de ARN step debe realizarse lo más rápidamente posible a una temperatura entre 2 - 4 de ° C. En tercer lugar, antes de la purificación por afinidad de Br-UMP ARN marcado, no incorporada BrUTP debe ser retirado de la preparación de ARN. Se utilizó un kit de ARN para deshacerse de BrUTP de la preparación de ARN purificado. En cuarto lugar, el uso de una transcriptasa inversa robusta es crítica para la adecuada realización del protocolo.
El protocolo TRO capítulo específico utilizado aquí tiene ventajas sobre la técnica de transferencia Northern para detectar el defecto de terminación, ya que es más sensible, más rápido y presenta una resolución más alta. Este protocolo también es mejor que el protocolo TRO tradicional, ya que puede distinguir las transcripciones sentido de las transcripciones antisentido y si el resultado observado es debido a la transcripción o la transcripción aberrante promotor iniciado-a partir de una región aguas abajo del promotor. El protocolo TRO capítulo específico tiene algunas limitaciones. Es más laborioso y requiere mucho tiempo de constante stcomió técnicas de detección de mRNA. Se requiere gran número de células. Por lo tanto, el análisis de la transcripción de genes bajo de transcripción puede ser un problema.
Hemos utilizado con éxito esta técnica para estudiar el defecto de terminación en el ciclo de la transcripción de ARN polimerasa II en la levadura en ciernes 2. El enfoque se puede extender a estudios de terminación de la transcripción por la ARN polimerasa I y la RNA polimerasa III en la levadura también. Con modificaciones apropiadas, el enfoque también se puede aplicar para estudiar el defecto terminación de la transcripción en eucariotas superiores. En general, la técnica es relativamente barato, altamente reproducible y requiere un equipo estándar utilizado en un laboratorio de biología molecular.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
References
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