Abstract
Dette manuskriptet beskriver en protokoll for påvisning av transkripsjonsterminerings defekt in vivo. Tråden spesifikke TRO protokollen ved hjelp av BrUTP er beskrevet her er en kraftfull eksperimentell tilnærming for analyse av transkripsjonsterminerings defekten under fysiologiske betingelser. Som den tradisjonelle TRO analysen, den er avhengig av tilstedeværelse av et transkripsjonelt aktivt polymerase forbi 3'-enden av genet som en indikator på en transkripsjonsterminerings defekt 1. Det overvinner to store problemene med den tradisjonelle TRO analysen. For det første kan det oppdage om polymerasen lese gjennom termineringssignal er den som initieres transkripsjon fra promotoren-proksimale område, eller om det er ganske enkelt representere en pervasively transkripsjon av polymerase som initieres ikke-spesifikt fra et sted i kroppen, eller den 3'- enden av genet. For det andre kan det skille hvis den transkripsjonelt aktive polymerase signal utoverterminator regionen er virkelig gjennomlesning fornuft mRNA transkribere polymerase eller en terminator-initierte ikke-kodende anti-sense RNA signal. I korthet innebærer den protokoll permeabilizing de eksponentielt voksende gjærceller, slik at transkriptene som igang in vivo til å forlenges i nærvær av BrUTP nukleotid, rense BrUTP-merket RNA av affiniteten tilnærming, revers transkribere det rensede begynnende RNA og amplifisere cDNA ved hjelp tråd-spesifikke primere som flankerer promotoren og terminator-regioner av genet to.
Introduction
Den eukaryote transkripsjons syklus består av tre hovedtrinn; initiering, forlengelse og avslutning. Avviklingen av transkripsjon av RNA polymerase II består av to atskilte, gjensidig avhengige trinn 3. Det første trinnet innebærer cleavage, polyadenylering og frigjøring av mRNA fra malen, og umiddelbart etterfølges av det andre trinnet, preget av frigjøring av polymerase fra malen. Riktig terminering er avgjørende for resirkulering av polymerase under oppstart / reinitiation av transkripsjon, for å hindre interferens med transkripsjon av nedstrømsgener, og for å holde avvikende transkripsjon i sjakk ved å begrense transkripsjon av gjennomgripende ikke-kodende RNA 4, 5. Til tross for de siste fremskritt, er oppsigelse langt den minst forståtte trinn av RNA polymerase II transkripsjon syklus. En pålitelig avslutning assay er avgjørende for å studere mekanismen underlying terminering av transkripsjon av RNA-polymerase II in vivo.
En rekke eksperimentelle tilnærminger benyttes for å påvise opphør defekten i en aktivt transkribere genet under fysiologiske betingelser. Disse inkluderer Northern blot, oppsigelse faktor brikke (Chromatin Immunpresipitasjon) og den tradisjonelle TRO analysen. Hver av disse teknikkene har noen fordeler og ulemper. Den tradisjonelle TRO test som benyttes for å være de mest pålitelige og følsomme metode for påvisning av en transkripsjonsterminerings defekt i vivo en. Denne analyse lokaliserer den transkripsjonelt aktive polymerasemolekyler på forskjellige områder av et gen inne i cellen. Under normale forhold, viser analysen transkripsjonelt engasjerte polymerasemolekyler strengt fordelt mellom promotoren og terminator-regionen til genet (figur 1A). Ved mangelfull avslutning, men er ute av stand til å lese termineringssignal polymerasenog detekteres i området nedstrøms for 3'-enden av genet (figur 1B).
En transkripsjonsterminerings feil er manifestert i nærvær av en følelse-transkribere polymerase som initieres fra promotoren-proksimale område, og blir ute av stand til å lese termineringssignal, fortsetter å transkribere den regionen nedstrøms for 3'-enden av et gen som vist på figur 2A. Med erkjennelsen av at det eukaryote genom viser overveldende gripende transkripsjon i fornuft samt anti-sense retninger i og rundt et gen 6, 7, 8, 9, 10, ble det snart klart at den tradisjonelle TRO analysen ikke kan oppdage om polymerase signal nedstrøms fra et gen som representerer en promoter-initiert transkripsjon (figur 2A) eller en avvikende RNA som initieres somewhere i midten av genet eller nedstrøms av terminatoren elementet (figur 2B), eller polymerasen transkribere i anti-sense-retning fra 3'-enden av genet (figur 2C). Strand-spesifikk TRO analysen bruker BrUTP beskrevet her kan skille hvis den observerte gjennomlesning polymerase signal representerer promoter-initiert utvidet forstand mRNA eller en anti-sense transkripsjon som startet nedstrøms fra genet under eksamen. Vi har med hell brukt denne tilnærmingen til å demonstrere rolle Kin28 kinase i oppsigelse av transkripsjon i spirende gjær 2. Ansette tilnærming her viser vi at Rna14 kreves for terminering av transkripsjon av ASC1 i spirende gjær.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne metoden ble brukt i forskningsartikkelen rapportert i Medler, S og Ansari, A. 2.
1. dyrking og høsting av celler
- Begynn en 5 ml kultur av celler i YPD-medium (10 g / l gjærekstrakt, 20 g / l pepton, 2% dekstrose) fra en fersk streket Saccharomyces cerevisiae plate.
- Dyrke cellene over natten i en orbital ristemaskin ved 30 ° C og 250 rpm.
- Fortynn over natten dyrket kultur 100 ganger til et sluttvolum på 100 ml i YPD-medium i en 250 ml kolbe forvirret.
MERK: Totalt 100 ml av kultur er nødvendig per TRO reaksjon; hvis flere reaksjoner er nødvendig, må et større volum av kultur bli anvendt. - Dyrke cellene til en optisk tetthet på 0,8 til 1,0 ved 600 nm (A 600 ~ 0,8 til 1,0).
- Høste cellene ved sentrifugering ved 820 xg i 5 minutter ved 4 ° C i et sterilt 50 ml konisk rør.
- Resuspender cellene i 10 ml iskald TMN buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl) og inkuber på is i 5 min.
- Sentrifuger ved 820 xg i 5 minutter ved 4 ° C for å pelletere cellene. fjern supernatanten forsiktig ved aspirasjon.
2. Permeabilizing og Forbereder Cells for Run-on-analyse
- Resuspender cellene i 1 ml 0,6% sarkosyl oppløsning ved å pipettere opp og ned forsiktig ved anvendelse av en avkortet P 1000 tips. Overfør cellesuspensjonen til en avkjølt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Rist cellene forsiktig ved 4 ° C i 25 min på en plattform shaker.
MERK: Mikrosentrifugerør bør pakkes inn i en 50 ml konisk rør med is for å opprettholde en kald temperatur, unngå muligheten for eventuelle nye innvielses hendelser som inntreffer på arrangøren på dette stadiet. - Sentrifuger cellene ved 1200 xg i 6 min ved 4 ° C ved anvendelse av en bordplate avkjølt sentrifuge.
- Forsiktig aspirer supernatanten for å fjerne overflødig væske fra det permeabilized celle pellet.
3. transkripsjon Run-on Reaction
- Tilsett 150 ul av transkripsjonsstoppbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT (ditiotreitol), 0,75 mM hver av ATP, CTP, GTP, og BrUTP, 200 U RNase inhibitor) til den permeabilisert cellepelleten.
- Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned ved hjelp av en avkortet P 200 tips.
MERK: Hvis behandlingen flere prøver, holde alt på is til alle prøvene er klare, og deretter gå videre til neste trinn. - Inkuberes i 5 minutter ved 30 ° C i et vannbad.
MERK: Juster inkubasjonstiden mellom 1 og 5 min for å sikre optimal inkorporering av BrUTP i den gryende RNA. - Stopp reaksjonen ved å tilsette 500 ul kald klar-til-bruk RNA isolering reagens. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
4. RNA Utvinning
- Tilsett 200 ul av syre-vaskede glassperler til cellen opphengningsvidere (trinn 3.4) og det hele rystes kraftig i 20 min ved 4 ° C i en virvelblander.
- Punktere bunnen av mikro røret ved hjelp av en varm 22 G nål og legg den på toppen av en 15-ml sterilt konisk tube.
- Sentrifuger ved 300 xg i 1 min ved 4 ° C for å samle opp cellelysat. Overfør cellelysatet til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Legge til 500 ul kald RNA isolering reagens og 200 ul kloroform til cellelysat. Blande innholdet på en vortex-blander og sentrifuger ved 16 168 xg i 20 min ved 4 ° C.
- Overfør den øvre vandige fase i et nytt mikrosentrifugerør.
- Legge til et likt volum av kald fenol / kloroform / isoamylalkohol (125: 24: 1) pH 4-5. Rist kraftig på en vortex-blander og sentrifuger ved 16 168 xg i 15 min ved 4 ° C.
- Overfør den øvre vandige fase inneholdende RNA i et nytt mikrosentrifugerør. Gjenta trinn 4.6 to ganger til.
- Til den endelige RNA-holdige vandige fasen, tilsett 5 M NaCl stock for å få en sluttkonsentrasjon på 0,3 M. Tilsett 3 ganger volumet av kald etanol for å utfelle RNA.
- Inkuber i 1 time eller over natten ved -20 ° C.
MERK: Utfør trinn 4.9 - 4.11, mens anti-BrdU perler blir inkubert for blokkering (se trinn 5.3).
- Inkuber i 1 time eller over natten ved -20 ° C.
- Sentrifuger ved 16168 x g i 20 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender RNA-pelleten i 100 ul DEPC (dietylpyrokarbonat) vann.
- Bruke et RNA isolering mini kit for å separere RNA fra uinkorporerte nukleotider BrUTP. Eluere RNA fra kolonnen med 100 ul RNase-fritt vann.
- Inkuber RNA i et 65 ° C vannbad i 5 minutter og deretter overføre til is i minst 2 min.
5. Affinity Rensing av BrUTP-merket RNA
- Til 25 mL av anti-BrdU avgjort perler, tilsett 500 mL av 0,25x SSPE (Sodium Saline Phosphate EDTA) bindingsbuffer (20x SSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH 2 PO 4
- Gjenta trinn 5.1 tre ganger.
- Tilsett 500 ul blokkeringsbuffer (1 x bindingsbuffer, 0,1% polyvinylpyrrolidon, 1 mg ultrarent bovint serumalbumin (BSA)) til kulene og riste forsiktig i 1 - 2 timer ved 4 ° C på en plattform shaker.
- Vask kulene ytterligere to ganger med 500 ul bindingsbuffer, slik det er beskrevet i trinn 5,1.
- Tilsett 400 ul av bindingsbuffer til kulene.
- Overfør 100 ul RNA (fra trinn 4.11) direkte til kulene. Inkuber med forsiktig risting i 1 - 2 timer ved 4 ° C på en plattform shaker.
- Vask kulene i rekkefølge med 500 ul av bindingsbuffer, 500 ul av lav saltbuffer (0,2 x SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween), 500 ul buffer med høyt saltinnhold (0,25x SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 100 mM NaCl), og to ganger med 500 ul av TET buffer (1x TE, 0,05% Tween), spinning ved200 x g i 30 sekunder ved 4 ° C i mellom hver vask.
- Eluer BrUTP-merket RNA fra perler sekvensielt, to ganger med 150 ul og en gang med 200 ul elueringsbuffer (20 mM DTT, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS), ved å inkubere i 4 minutter ved 42 ° C i et vannbad, fulgt av en kort sentrifugering for å skille kulene fra supernatanten.
6. Nedbør av BrUTP merket RNA
- Tilsett 500 pl kald fenol / kloroform / isoamylalkohol (125: 24: 1) pH 4. - 5. til affinitetsrenset BrUTP merket RNA. Bland på en vortex-blander og sentrifuger ved 16 168 xg i 15 min ved 4 ° C.
- Overfør den øvre vandige fase i et nytt mikrosentrifugerør.
- Tilsett 5 M NaCl lager for å få en sluttkonsentrasjon på 0,3 M og 3 ganger volumet av kald etanol for å utfelle RNA.
- Inkuber ved -20 ° C over natten.
- Samle det utfelte RNA ved sentrifugering ved 16 168 xg i 30 min ved 4 ° C. </ Li>
- Fjern supernatanten og tillate pelleten lufttørke i 10 minutter.
- Resuspender RNA pellet i 26 mL av DEPC vann.
- Bestemme den endelige RNA-konsentrasjonen ved å måle absorbansen ved 260 nm ved anvendelse av et spektrofotometer. Også, bestemme forholdet 260/280. Et forhold ~ 2 er indikativ for en ren prøve RNA.
- Oppbevar RNA prøver i alikvoter ved -80 ° C inntil det er behov for cDNA-syntese.
7. revers transkripsjon av BrUTP-merket RNA
- Juster RNA konsentrasjonen til 100 ng / mL hjelp DEPC vann. Bruk 0,5 mikrogram av RNA for hver cDNA syntese reaksjon.
MERK: Konsentrasjonen av RNA-templat kan varierer 0.5 til ca. 1,0 ug for å oppnå optimal cDNA-syntese. - Omvendt transkriberer RNA ved hjelp av flere reverse primere utformet nedstrøms fra poly (A) område (termineringssete) som vist i figur 3A.
- Til hver revers transkripsjon reaksjon, tilsett 5 mL RNA template (0,5 ug), 1 ul dNTP-blanding (10 mM hver), 2 ul av revers primer C, D, E, F eller G (50 mM hver) (se figur 3A) og nuklease fritt vann. Det endelige reaksjonsvolum i hvert rør er 13 pl.
MERK: Antallet av revers transkripsjon reaksjonene vil avhenge av antallet revers primere anvendt for cDNA-syntese. For eksempel, for ASC1 fem reverse primere ble brukt og derfor fem reverse transkripsjonsreaksjoner ble satt opp. Etiketten rørene som C, D, E, F og G på grunnlag av den reverse primer anvendt for cDNA-syntese. - Inkuber rørene som inneholdt RNA-templat, dNTP blanding og primere i en termosykler ved 65 ° C i 5 minutter for å fjerne eventuelt sekundære strukturelle konformasjon, og deretter avkjøles til 4 ° C i minst 2 min.
- Tilsett 1 pl revers transkriptase (200 U / ul), 4 pl buffer og 2 pl 0,1 M DTT til hvert rør inneholdende RNA-templat og primer (trinn 7.4). Bland ved pipettering forsiktig opp og ned.
- Utføre revers transkripsjon ved inkubering av reaksjonsblandingen i en termosykler ved 42 ° C i 60 min.
- Inaktivere revers transkriptase ved 65 ° C i 20 min.
- Oppbevar cDNA ved -20 ° C eller gå videre til neste trinn.
8. Forsterkning av cDNA
- Utføre PCR-reaksjonen for amplifisering av hver cDNA-preparat (merket C, D, E, F og G for ASC1) fra trinn 7.8 på følgende måte: 3,0 ul cDNA templat fra trinn 7,8, 1,0 ul forover primer B (10 mM), 1,0 ul revers primer C eller D eller E eller F eller G (10 mM), 2,5 ul 10 x polymerase PCR-buffer, 0,5 ul dNTP-blanding (10 mM hver), 1,0 ul MgCl2 (2,5 mM), 15,5 pl PCR klasse vann, og 0,5 mL termostabile polymerase enzym.
MERK: Forskjellige fortynninger av cDNA som templat i området fra 1: 5 til 1: 100 bør testes for å optimalisere PCR-produktutbytte. En enkelt promoter-proksimale fremover primer blir anvendt for å amplifisere cDNA-oppnås ved hjelp av ulike reverse primere. For eksempel ble en enkelt forover primer B ligger i nærheten promotoren anvendes i kombinasjon med fem revers primere fra C til G for ASC1. BC, BD, BE, BF og BG ble anvendt i rørene henholdsvis merket som C, D, E, F og G, som vist i figur 3A. - Kjør PCR ved anvendelse av de følgende termisk sykling parametere: en syklus 95 ° C i 2 min (hot start for aktivering av polymerase), 30 - 40 sykluser 95 ° C i 30 sekunder (denaturering), 54 ° C i 15 s (annealing) , 68 ° C i 1 minutt (forlengelse), og en syklus 68 ° C i 5 minutter (endelig forlengelse).
MERK: glødetemperaturen vil variere avhengig av de spesifikke primere som brukes og utvidelsen tid vil variere avhengig av det ønskede produktstørrelse. - Separere PCR-produkt ved elektroforese på 0,8%, 1,5% eller 2% agarosegeler, avhengig av den forventede størrelse av produktet.
- Kvantifisere PCR-produkt som er beskrevet i El Kaderi et al. , 2012 11.
MERK: Alternativt kan du bruke sanntid RT-qPCR strategi for å kvantifisere mengden av begynnende vitnemål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere anvendelsen av BrUTP-strand spesifikke TRO prosedyre i å oppdage en transkripsjon oppsigelse defekt, brukte vi en avslutning-defekt, temperaturfølsom mutant av RNA14 kalt rna14-1. Rollen Rna14 i oppsigelse av transkripsjon av RNA polymerase II ble demonstrert ved hjelp av tradisjonelle TRO analyse som oppdaget RNA i Terminator-proksimale delen av utvalgte gener 1. Påvisningen av RNA signal utover terminatorregion i den rna14-1 mutant ved den ikke-permissive temperaturen ble tolket som terminerings defekten. Den observerte signal, men kan tilskrives den pervasively transkribere polymerase som initieres transkripsjonen fra et sted nær den 3 'ende av genet, som vist i figur 2B. For endelig å demonstrere hvilken rolle Rna14 til oppsigelse, utførte vi BrUTP-strand spesifikke TRO i rna14-1mutant og isogene villtypestammen ved 37 ° C. Vi forventet at i villtypestammen, vil TRO signalet begrenses mellom promotoren og terminatorområdene som vist i figur 1A. I rna14-1 mutant, vil imidlertid polymerasen lese gjennom termineringssignal, og TRO signalet vil bli detektert utover den 3 'ende av genet, som vist i figur 1B og 2A.
I korte trekk ble det vi rna14-1 mutanten og dens isogene vill-type-celler ved 25 ° C til midt-log fase og deretter skiftet celler til 37 ° C i tre timer. Transkripsjon kjøre-on analyse ble utført for å innlemme BrUTP inn i begynnende RNA syntetisert ved hjelp av et aktivt transkribering av RNA-polymerase som beskrevet ovenfor. Den BrUTP merket RNA ble renset og revers transkribert ved å bruke primere C, D, E, F og G som er vist i figur 3A. Den tilsvarende cDNA ble PCR forsterket USIng primerpar BC, BD, BE, BF, og BG og fraksjonerte på agarosegeler (figur 3b). Kvantifisering av geler er vist i figur 3C. Tilstedeværelse av PCR-amplifiserte produkter fra primerparene BE, BF og BG i rna14-1 mutant reflekterer en avslutning lese gjennom fenotype (figur 3B, fil 11 - 13, og figur 3C, regioner E, F og G). I villtype-celler, ble imidlertid TRO signal begrenset til terminatorelement (figur 3B, Sporene 2 og 3, og figur 3C, områdene C og D). Det var ikke noe påvisbart signal TRO utover terminatorregion (figur 3B, fil 4. - 6. og figur 3C, regioner E, F og G). Således kunne vi påvise promotor-initiert begynnende transkripter som leser inn i termineringssignal i mutanten, men ikke i villtype-celler, og dermed bekrefter at Rna14 er en avslutning faktor.
Figur 1: transkripsjon Run-on (TRO) analysen detekterer tilstedeværelsen av transcriptionally Active RNA Polymerase i ulike regioner av et gen. (A) Ved avslutning er normalt, er det ingen polymerase signal utover terminatorregion. (B) Ved defekte avslutning, er det polymerase ute av stand til å lese termineringssignal og kan påvises utover den 3 'ende av genet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Strand-spesifikk TRO analysen. Tråden spesifikke TRO analysen kan oppdage om nærværet av et transkripsjonelt aktivt polymerase forbi 3'-enden av than-genet er en ekte avslutning feil på grunn av en promoter-initiert polymerase lese gjennom termineringssignal (A), eller det er ganske enkelt en pervasively transkripsjon av polymerase-transkripsjon i forstand retning (B), eller det er den anti-sense ncRNA transkripsjon av polymerase initierer fra 3'-enden (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Rna14 er en oppsigelse faktor som Polymerase Leser gjennom Oppsigelse Signal i rna14-1 Mutant. (A) Skjematisk fremstilling av ASC1 gen som viser posisjonen av den fremre primer B, og fem reverse primere, C, D, E, F og G som brukes for cDNA syntese av renset BrUTP-merket RNA. (B) cDNA laget fra reverse primere C, D, E, F og G var PCR forsterket ved hjelp av grunning parene BC, BD, BE, BF og BG hhv. (C) Den kvantitative analyse av TRO data som er vist i (b) ovenfor i villtype og rna14-1 cellene ved 37 ° C. 5 S-RNA ble anvendt som normaliseringskontroll. Feilstolpene utgjør en hel enhet av standardavviket basert på et minimum av tre forsøk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Strand-spesifikk TRO protokollen som brukes her var tilpasset fra protokollen som brukes for GRO-Seq (Global Run On-sekvensering) analyse i pattedyrceller 12. Vi lykkes modifisert protokollen for å studere gryende transkripsjon i spirende gjær. Å spesielt analysere transkripsjonstermineringskodende feil, vi justert protokollen ytterligere ved å bli kvitt den RNA hydrolysetrinnet. Dette tillot oss å spesifikt oppdage full lengde gryende transkripsjoner at initiert fra transkripsjon start stedet nær promoter-regionen.
Det er flere kritiske trinn i protokollen som skal utføres med største forsiktighet for å få et meningsfylt resultat. For det første må den protokoll utføres med eksponentielt voksende gjærceller. Cellene i loggen fase (A 600 ~ 0,8 til 1,0) gir de beste resultatene som majoriteten av celler på dette stadiet er aktivt voksende og viser robust transkripsjon. For det andre, RNA isolering step bør utføres så raskt som mulig ved en temperatur på mellom 2 - 4 ° C. For det tredje, før affinitet rensing av Br-UMP merket RNA, unincorporated BrUTP bør fjernes fra RNA forberedelse. Vi brukte en RNA kit for å bli kvitt BrUTP fra renset RNA forberedelse. For det fjerde, er bruken av en robust revers transkriptase kritisk for vellykket gjennomføring av protokollen.
Tråden spesifikke TRO protokollen som brukes her har fordeler fremfor den Northern blot teknikk for å påvise opphør defekten som den er mer følsom, raskere og utviser høyere oppløsning. Denne protokollen er også bedre enn den tradisjonelle TRO protokollen som det kan skille sanse transkripsjoner fra anti-sense transkripsjoner og hvis den observerte resultatet skyldes arrangøren initierte transkripsjon eller avvikende transkripsjon fra en promoter nedstrøms regionen. Tråden-spesifikke TRO protokoll har noen begrensninger. Det er mer arbeidskrevende og tidskrevende enn en jevn stspiste mRNA påvisningsteknikker. Det krever stort antall celler. Derfor kan analyse av transkripsjonen av gener lave transkribere være et problem.
Vi har med hell brukt denne teknikken til å studere oppsigelse feil i RNA polymerase II transkripsjon sykle i spirende gjær 2. Tilnærmingen kan utvides for å studere terminering av transkripsjon av RNA-polymerase I og RNA-polymerase III i gjær også. Med passende modifikasjoner kan den tilnærmingen også anvendes for å studere transkripsjonsterminerings defekt i høyere eukaryoter. Totalt sett er teknikken relativt billig, svært reproduserbare og krever standard utstyr som brukes i en molekylærbiologi laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
References
- Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
- Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription. Sci Rep. 5, 12586 (2015).
- Richard, P., Manley, J. L. Transcription termination by nuclear RNA polymerases. Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).
- Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).
- Porrua, O., Libri, D. Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).
- Jacquier, A. The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs. Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).
- Xu, Z., et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).
- Neil, H., et al. Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).
- Clark, M. B., et al.
- Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast. Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).
- El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C). Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
