Abstract
Dette håndskrift beskriver en protokol til påvisning transkriptionsstop defekt in vivo. Den streng-specifikke TRO-protokol under anvendelse BrUTP beskrevet her er en kraftfuld eksperimentel fremgangsmåde til analyse af transkriptionsterminering defekten under fysiologiske betingelser. Ligesom den traditionelle TRO assay, den bygger på tilstedeværelsen af et transkriptionelt aktiv polymerase uden 3'-enden af genet som en indikator for en transskriptionstermineringssekvens defekt 1. Det overvinder to store problemer med den traditionelle TRO analysen. For det første kan det identificere hvis polymerasen læsning gennem termineringssignalet er den, der initieres transkription fra promotoren-proksimale region, eller hvis det blot repræsenterer en gennemgribende omskriver polymerase, initieret ikke-specifikt fra et sted i kroppen eller 3 ' enden af genet. For det andet kan det skelne mellem om det transkriptionelt aktive polymerase signal ud over denterminator region er virkelig den gennemlæsning sense mRNA transskribere polymerase eller en terminator-initieret ikke-kodende antisense RNA signal. Kort fortalt protokollen involverer permeabilisering de eksponentielt voksende gærceller, så transkripterne, der er indledt in vivo til at forlænges i nærvær af BrUTP nukleotid, oprensning BrUTP-mærket RNA ved affinitetsmetoden, revers transskription af oprensede spirende RNA og amplifikation af cDNA under anvendelse af streng-specifikke primere, der flankerer promotoren og terminatoren områder af genet 2.
Introduction
Den eukaryote transskription cyklus består af tre store skridt; initiering, forlængelse og ophør. Opsigelsen af transskription af RNA-polymerase II består af to adskilte, indbyrdes afhængige trin 3. Det første trin involverer spaltning, polyadenylering og frigivelse af mRNA fra skabelonen, og efterfølges umiddelbart af det andet trin, angivet ved frigørelse af polymerase fra skabelonen. Korrekt opsigelse er afgørende for genbrug af polymerasen under initiering / reinitiering af transskription, for at forhindre interferens med transskription af nedstrøms gener, og for at holde afvigende transskription i skak ved at begrænse transskription af pervasive ikke-kodende RNA 4, 5. Trods nylige fremskridt, ophør er langt den mindst forståede trin af RNA-polymerase II transkription cyklus. En pålidelig afslutning assay er afgørende for at studere mekanismen underlying terminering af transkription med RNA-polymerase II in vivo.
Et antal eksperimentelle metoder anvendes til at opdage ophøret defekt i en aktivt omskriver gen under fysiologiske betingelser. Disse omfatter Northern blot, opsigelse faktor chip (Chromatin Immunfældning) og den traditionelle TRO analysen. Hver af disse teknikker har nogle fordele og ulemper. Den traditionelle TRO assay plejede at være den mest pålidelige og følsom fremgangsmåde til detektion af en transkriptionsterminerings defekt in vivo 1. Dette assay lokaliserer de transkriptionelt aktive polymerasemolekyler på forskellige områder af et gen inden i cellen. Under normale forhold assayet viser transkriptionelt engagerede polymerasemolekyler strengt fordelt mellem promotoren og terminatoren region af genet (figur 1A). Ved defekt terminering imidlertid polymerasen kan ikke læse termineringssignaletog detekteres i regionen nedstrøms for 3'-enden af genet (figur 1B).
En transskriptionstermineringssekvens defekt manifesteres i nærvær af en følelse-omskriver polymerase, som initieres fra promotoren-proksimale region, og er ude af stand til at læse termineringssignalet, fortsætter transskribere regionen nedstrøms for 3'-enden af et gen som vist i figur 2A. Med erkendelsen af, at det eukaryote genom udviser overvældende pervasive transkription i fornuft samt antisense-retninger i og omkring et gen 6, 7, 8, 9, 10, blev det hurtigt klart, at den traditionelle TRO assay ikke kan registrere, om polymerasen signal nedstrøms for et gen betegner en promotor-initieret transkript (figur 2A) eller en afvigende RNA, som initieres whichewhere i midten af genet eller nedstrøms for terminatoren element (figur 2B), eller polymerasen omskriver i anti-sense-retning fra 3 'enden af genet (figur 2C). Den streng-specifikke TRO under anvendelse BrUTP her beskrevne kan skelne mellem om det observerede gennemlæsning polymerase signal repræsenterer promotor-initieret udvidet forstand mRNA eller et anti-sense transskript der indledte nedstrøms for genet, der undersøges. Vi har med succes brugt denne metode til at demonstrere rolle Kin28 kinase i opsigelse af transskription i spirende gær 2. Anvender den tilgang, her viser vi, at Rna14 er nødvendig for terminering af transskription af ASC1 i spirende gær.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne metode blev anvendt i forskningsartikel rapporteret i Medler, S og Ansari, A. 2.
1. dyrkning af og høst af cellerne
- Start en 5 ml kultur af celler i YPD-medium (10 g / l gærekstrakt, 20 g / l pepton, 2% dextrose) fra en frisk udstrøget Saccharomyces cerevisiae plade.
- Grow cellerne natten over i en orbitalryster ved 30 ° C og 250 rpm.
- Fortynd overnight dyrkede kultur 100 gange til et endeligt volumen på 100 ml i YPD-medium i en 250 ml forvirret kolbe.
BEMÆRK: Der er behov for i alt 100 ml kultur pr TRO reaktion; hvis der er behov multiple reaktioner, skal der anvendes en større mængde kultur. - Grow cellerne til en optisk densitet på 0,8 - 1,0 ved 600 nm (A600 ~ 0,8 - 1,0).
- Cellerne høstes ved centrifugering ved 820 xg i 5 min ved 4 ° C i et sterilt 50 ml konisk rør.
- Resuspender cellerne i 10 ml iskold TMN buffer (10 mM Tris-HCI pH 7,5, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl) og inkuber på is i 5 minutter.
- Centrifuger ved 820 xg i 5 min ved 4 ° C for at pelletere cellerne. Fjern forsigtigt supernatanten ved aspiration.
2. permeabilisering og forberede Celler til Run-on Assay
- Resuspender cellerne i 1 ml 0,6% sarkosyl opløsning ved pipettering op og ned forsigtigt under anvendelse af en trunkeret P 1000 spids. Overfør cellesuspensionen til en afkølet 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Ryst cellerne forsigtigt ved 4 ° C i 25 min på et rystebord.
BEMÆRK: mikrocentrifugerør skal pakkes ind i en 50 ml konisk rør med is for at opretholde en kold temperatur, således at muligheden for eventuelle nye initieringsbegivenheder forekommer ved promotoren på nuværende tidspunkt. - Centrifuger cellerne ved 1200 xg i 6 min ved 4 ° C under anvendelse af en bordplade kølecentrifuge.
- aspireres forsigtigt supernatanten for at fjerne overskydende væske fra prmeabilized cellepellet.
3. Transskription Run-on Reaktion
- Tilsæt 150 pi af transskription run-on buffer (50 mM Tris-HCI pH 7,5, 100 mM KCI, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT (dithiothreitol), 0,75 mM af hver af ATP, CTP, GTP, og BrUTP, 200 U RNase inhibitor) til permeabiliserede cellepellet.
- Bland forsigtigt ved pipettering op og ned ved hjælp af en afkortet P 200 tip.
BEMÆRK: Hvis behandling flere prøver, holde alt på is, indtil alle prøver er klar og derefter gå videre til næste trin. - Der inkuberes i 5 minutter ved 30 ° C i et vandbad.
BEMÆRK: Juster inkubationstiden mellem 1 og 5 min for at sikre optimal inkorporering af BrUTP i den spirende RNA. - Reaktionen standses ved tilsætning af 500 pi kold klar-til-brug RNA-isolering reagens. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
4. RNA-ekstraktion
- Tilsæt 200 pi af syrevasket glasperler til cellen suspensipå (trin 3.4), og rystes kraftigt i 20 min ved 4 ° C i en vortex mixer.
- Punktere bunden af mikrocentrifugerør ved anvendelse af en varm 22 G nål og placere den på toppen af en 15-ml sterilt konisk rør.
- Centrifugeres ved 300 xg i 1 min ved 4 ° C for at opsamle cellelysatet. Overfør cellelysatet til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Der tilsættes 500 pi kold RNA-isolering reagens og 200 pi af chloroform til cellelysatet. Blande indholdet på en vortex-blander og centrifugeres ved 16.168 xg i 20 min ved 4 ° C.
- Overfør den øvre vandige fase til et nyt mikrocentrifugeglas.
- Tilsættes samme mængde af kold phenol / chloroform / isoamylalkohol (125: 24: 1) pH 4-5. Rystes kraftigt på en vortex-blander og centrifugeres ved 16.168 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Overfør den øvre vandige fase indeholdende RNA til et nyt mikrocentrifugeglas. Gentag trin 4.6 to gange mere.
- Til den endelige RNA-holdige vandige fase, tilsættes 5 M NaCl stock for at få en slutkoncentration på 0,3 M. Tilsæt 3 gange volumenet af kold ethanol til udfældning af RNA'et.
- Der inkuberes i 1 time eller natten over ved -20 ° C.
BEMÆRK: Udfør trin 4.9 - 4.11, mens anti-BrdU perler bliver inkuberes til at blokere (se trin 5.3).
- Der inkuberes i 1 time eller natten over ved -20 ° C.
- Centrifuger ved 16.168 xg i 20 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender RNA pellet i 100 pi DEPC (diethylpyrocarbonat) vand.
- Brug en RNA-isolering mini kit til at adskille RNA fra de ikke-inkorporerede BrUTP nukleotider. Eluere RNA'et fra søjlen med 100 pi RNase-frit vand.
- Inkubér RNA i en 65 ° C vandbad i 5 minutter og derefter overføre til is i mindst 2 minutter.
5. affinitetsoprensning af BrUTP-mærket RNA
- Til 25 pi anti-BrdU afregnes perler, tilsættes 500 pi 0,25x SSPE (Sodium Saline Phosphate EDTA) bindingsbuffer (20x SSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH 2 PO4
- Gentag trin 5.1 tre gange.
- Tilsæt 500 pi blokeringspuffer (1x bindingsbuffer, 0,1% polyvinylpyrrolidon, 1 mg ultrarent bovint serumalbumin (BSA)) til perlerne og rystes forsigtigt til 1 - 2 timer ved 4 ° C på en platform-ryster.
- Vask perlerne yderligere to gange med 500 pi bindingspuffer, som beskrevet i trin 5.1.
- Tilføj 400 pi bindingspuffer til perlerne.
- Overfør 100 pi RNA (fra trin 4.11) direkte til perlerne. Inkuber under forsigtig omrystning i 1 - 2 timer ved 4 ° C på en platform-ryster.
- sekventielt perler vaskes med 500 pi bindingspuffer, 500 pi lavsaltpuffer (0,2x SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween), 500 pi puffer med højt saltindhold (0,25x SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 100 mM NaCl), og to gange med 500 pi af tet-buffer (1x TE, 0,05% Tween), spinde- på200 xg i 30 sekunder ved 4 ° C i mellem hver vask.
- Eluere BrUTP-mærket RNA fra perlerne successivt, to gange med 150 pi og en gang med 200 pi elueringspuffer (20 mM DTT, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS), ved inkubering i 4 minutter ved 42 ° C i et vandbad, efterfulgt af en kort centrifugering for at adskille perler fra supernatanten.
6. Udfældning af BrUTP mærket RNA
- Tilsæt 500 pi kold phenol / chloroform / isoamylalkohol (125: 24: 1) pH 4 - 5 for den affinitetsoprensede BrUTP mærket RNA. Der blandes på en vortex-blander og centrifugeres ved 16.168 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Overfør den øvre vandige fase til et nyt mikrocentrifugeglas.
- Tilsæt 5 M NaCl lager for at få en slutkoncentration på 0,3 M og 3 gange volumenet af kold ethanol til udfældning af RNA'et.
- Inkuber ved -20 ° C natten over.
- Opsaml udfældede RNA ved centrifugering ved 16.168 x g i 30 minutter ved 4 ° C. </ Li>
- Fjern supernatanten og lad pelleten at lufttørre i 10 min.
- Resuspender RNA pellet i 26 pi DEPC vand.
- Bestemme den endelige RNA-koncentrationen ved måling af absorbansen ved 260 nm ved anvendelse af et spektrofotometer. Også bestemme forholdet på 260/280. Et forhold ~ 2 er tegn på en ren RNA-prøve.
- Opbevar RNA-prøver i portioner ved -80 ° C indtil brug til cDNA-syntese.
7. revers transkription af BrUTP-mærket RNA
- Juster RNA-koncentrationen til 100 ng / pl hjælp DEPC vand. Brug 0,5 ug af RNA for hver cDNA-syntesereaktionen.
BEMÆRK: Koncentrationen af RNA-templaten kan variere fra 0,5 til 1,0 ug for at opnå optimal cDNA-syntese. - Revers transkribere RNA ved hjælp af flere reverse primere udformet nedstrøms for poly (A) -site (termineringsstedet) som vist i figur 3A.
- Til hver revers transkription reaktion, tilsættes 5 pi RNA template (0,5 ug), 1 pi dNTP-blanding (10 mM hver), 2 pi revers primer C, D, E, F eller G (50 pM hver) (se figur 3A) og nuklease frit vand. Det endelige reaktionsvolumen i hvert rør er 13 pi.
BEMÆRK: Antallet af revers transkription reaktioner vil afhænge af antallet af reverse primere anvendt til cDNA-syntese. For eksempel til ASC1 fem reverse primere blev anvendt, og derfor fem revers transkription-reaktioner blev sat op. Mærk rørene som C, D, E, F og G på grundlag af den reverse primer, som anvendes til cDNA-syntese. - Inkubér rør indeholdende RNA-template, dNTP-blanding og primere i en thermocycler ved 65 ° C i 5 minutter til fjernelse af eventuelt sekundære strukturelle konformation, og afkøl derefter til 4 ° C i mindst 2 minutter.
- Tilsæt 1 pi revers transkriptase (200 U / pl), 4 pi buffer og 2 pi 0,1 M DTT til hvert rør indeholdende RNA-templaten og primeren (trin 7.4). Bland ved pipettering forsigtigt op og ned.
- Udføre revers transkription ved at inkubere reaktionsblandingen i en thermocycler ved 42 ° C i 60 minutter.
- Inaktivere revers transkriptase ved 65 ° C i 20 minutter.
- Opbevar cDNA ved -20 ° C eller gå videre til næste trin.
8. Amplifikation af cDNA
- Udfør PCR-reaktionen til amplifikation af hver cDNA-præparat (mærket C, D, E, F og G i ASC1) fra trin 7.8 som følger: 3,0 pi cDNA-skabelon fra trin 7,8, 1,0 pi fremadrettet primer B (10 uM), 1,0 pi reverse primer C eller D eller E eller F eller G (10 uM), 2,5 pi 10x polymerase PCR-buffer, 0,5 pi dNTP-blanding (10 mM hver), 1,0 pi MgCI2 (2,5 mM), 15,5 pi PCR-kvalitet vand og 0,5 pi termostabilt polymeraseenzym.
BEMÆRK: Forskellige fortyndinger af cDNA template i intervallet fra 1: 5 til 1: 100 bør testes for at optimere PCR-produktet udbytte. En enkelt promotor-proksimal fremadrettet primer vil blive anvendt til at amplificere cDNAopnået under anvendelse af forskellige reverse primere. For eksempel blev en enkelt fremad primer B ligger i nærheden af promotor anvendes i kombination med fem reverse primere fra C til G for ASC1. BC, BD, BE, BF og BG blev anvendt i rør mærket som C, D, E, F og G som vist i figur 3A. - Kør PCR ved anvendelse af følgende termiske cykliseringsparametre: 1 cyklus 95 ° C i 2 min (hot start for aktivering af polymerase), 30 - 40 cykler 95 ° C i 30 s (denaturering), 54 ° C i 15 s (annealing) , 68 ° C i 1 min (extension), og 1 cyklus 68 ° C i 5 min (forlængelse).
BEMÆRK: annealing temperaturen vil variere afhængigt af de specifikke primere, der anvendes, og forlængelsen tid vil variere afhængigt af det forventede produkt størrelse. - Adskil PCR-produktet ved elektroforese på 0,8%, 1,5% eller 2% agarosegeler afhængigt af den forventede størrelse af produktet.
- Kvantificere PCR produktet som beskrevet i El Kaderi et al. , 2012 11.
BEMÆRK: Alternativt kan du bruge realtid RT-qPCR strategi for at kvantificere mængden af spirende udskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere anvendeligheden af BrUTP-streng-specifikke TRO procedure at opdage en transkriptionsterminering defekt, vi brugte en udtræden defekt, temperaturfølsomme mutant af RNA14 kaldes rna14-1. Rolle Rna14 i opsigelse af transskription af RNA-polymerase II blev demonstreret ved hjælp af den traditionelle TRO analyse, som opdages RNA i terminator-proksimale region af udvalgte gener 1. Påvisningen af RNA signal ud over den terminator region i rna14-1 mutant ved den ikke-tolerante temperatur blev forstås som afslutning defekt. Den observerede signal kunne imidlertid tilskrives gennemgribende omskriver polymerase, som initieres transkription fra et sted nær 3'-enden af genet som vist i figur 2B. For definitivt at demonstrere rolle Rna14 i opsigelse, vi udførte BrUTP-streng-specifikke TRO i rna14-1mutant og den isogene vildtypestamme ved 37 ° C. Vi forventede, at i vildtypestammen, vil TRO signalet være begrænset mellem promotoren og terminator-regioner, som vist i figur 1A. I rna14-1 mutanten vil imidlertid polymerasen læse termineringssignalet og TRO signal blive detekteret uden for 3'-enden af genet som vist i figur 1B og 2A.
Kort fortalt, vi voksede rna14-1 mutanten og dens isogene type celler vilde ved 25 ° C til mid-log-fase og derefter flyttet celler til 37 ° C i tre timer. Transskription run-on assay blev udført til at optage BrUTP i spirende RNA syntetiseret ved en aktivt transkribere RNA-polymerase som beskrevet ovenfor. Den BrUTP mærkede RNA blev oprenset og revers transkriberet ved anvendelse af primerne C, D, E, F og G vist i figur 3A. Det tilsvarende cDNA blev PCR-amplificeret USIng primerpar BC, BD, BE, BF og BG og fraktionerede på agarose geler (figur 3b). Kvantificering af geler er vist i figur 3C. Tilstedeværelsen af PCR amplificerede produkter fra primerparrene BE, BF, og BG i rna14-1 mutanten afspejler en terminering læse fænotype (figur 3B, bane 11 - 13, og figur 3C, regioner E, F og G). I de vildtypeceller blev imidlertid TRO signal begrænset indtil terminatorelement (figur 3B, bane 2 og 3, og figur 3C, områderne C og D). Der var intet påviseligt TRO signal ud over terminator region (figur 3B, bane 4 - 6, og figur 3C, regioner E, F og G). Således kunne vi påvise promotor-initieret spirende transkripter som læser gennem termineringssignalet i mutanten, men ikke i de vild type celler, hvilket bekræfter, at Rna14 er en termineringsfaktor.
Figur 1: Transskription Run-on (TRO) Indhold detekterer tilstedeværelsen af transkriptionelt Active RNA-polymerase i forskellige regioner i en Gene. (A) Når terminering er normal, er der ingen polymerase signal ud over terminator region. (B) Ved defekt ophør, polymerasen kan ikke læse termineringssignalet og kan påvises ud over 3'-enden af genet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Strand-specifik TRO analysen. Den streng-specifikke TRO assay kan detektere hvis forekomsten af et transkriptionelt aktiv polymerase uden 3'-enden af than gen er en sand terminering defekt på grund af en promotor-initieret polymerase læsning gennem termineringssignalet (A), eller det er simpelthen en gennemgribende omskriver polymerase omskriver i sense retning (B), eller det er anti-sense ncRNA transskribere polymerase initiere fra 3'-enden (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Rna14 er et Opsigelse faktor som Polymerase Læser gennem Opsigelse Signal i rna14-1 Mutant. (A) Skematisk afbildning af ASC1 gen viser placeringen af den fremadrettede primer B og fem reverse primere, C, D, E, F og G anvendes til cDNA-syntese af oprenset BrUTP-mærket RNA. (B) cDNA fremstillet fra reverse primere C, D, E, F og G blev PCR-amplificeret ved anvendelse af primerne par BC, BD, BE, BF og BG henholdsvis. (C) Den kvantitative analyse af TRO data vist i (b) ovenfor i vildtype og rna14-1 celler ved 37 ° C. 5S RNA blev anvendt som normalisering kontrol. Fejlsøjlerne repræsenterer en fuld enhed af standardafvigelsen baseret på et minimum af tre forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den streng-specifikke TRO protokol, der bruges her blev tilpasset fra den anvendte protokol til GRO-Seq (Global Run On-Sequencing) analyse i pattedyrceller 12. Vi lykkedes ændret protokollen til at studere spirende transskription i spirende gær. For specifikt analysere transkriptionsterminering defekt, vi justeret protokollen yderligere ved at komme af RNA hydrolyse trin. Dette tillod os at specifikt at påvise fuld længde spirende transkripter der initieret fra transkriptionsstartstedet nær promotorregionen.
Der er flere kritiske trin i den protokol, der skal udføres med yderste forsigtighed for at få et meningsfuldt resultat. Først skal protokollen udføres med eksponentielt voksende gærceller. Cellerne i log-fase (A 600 ~ 0,8-1,0) giver de bedste resultater, som de fleste celler i denne fase er aktivt voksende og udstille robust transskription. Sekund, den RNA-isolering stskal udføres ep så hurtigt som muligt ved en temperatur mellem 2 - 4 ° C. Tredje, før affinitetsoprensning af Br-UMP mærket RNA, ikke-inkorporeret BrUTP bør fjernes fra RNA-præparat. Vi anvendte en RNA kit til at slippe af BrUTP fra den oprensede RNA-præparat. For det fjerde anvendelsen af en robust revers transkriptase er kritisk for en vellykket gennemførelse af protokollen.
Den streng-specifikke TRO protokol, der bruges her, har fordele i forhold til Northern blot teknik til at opdage opsigelsen defekt, da det er mere følsom, hurtigere og udviser højere opløsning. Denne protokol er også bedre end den traditionelle TRO-protokollen, da det kan skelne sense udskrifter fra de anti-sense udskrifter og hvis den observerede resultat skyldes promotor-initieret transskription eller afvigende transskription starter fra en promotor nedstrøms region. Den streng-specifikke TRO protokol har nogle begrænsninger. Det er mere omstændelig og tidskrævende end steady stspiste mRNA detektionsteknikker. Det kræver stort antal celler. Derfor kan en analyse af transkription af lave omskriver gener være et problem.
Vi har med succes anvendt denne teknik til at undersøge terminering defekt i RNA-polymerase II transkription cyklus i knopskydende gær 2. Den fremgangsmåde kan udvides til at studere terminering af transkription med RNA-polymerase I og RNA-polymerase III i gær samt. Med passende modifikationer kan tilgang også anvendes til at studere transkriptionsterminering defekt i højere eukaryoter. Samlet set teknikken er relativt billig, meget reproducerbar og kræver standard udstyr, der anvendes i et molekylærbiologisk laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
References
- Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
- Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription. Sci Rep. 5, 12586 (2015).
- Richard, P., Manley, J. L. Transcription termination by nuclear RNA polymerases. Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).
- Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).
- Porrua, O., Libri, D. Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).
- Jacquier, A. The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs. Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).
- Xu, Z., et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).
- Neil, H., et al. Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).
- Clark, M. B., et al.
- Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast. Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).
- El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C). Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
