Abstract
Bu el yazması in vivo transkripsiyon sonlandırma kusuru tespit etmek için bir protokol tanımlamaktadır. kullanarak BrUTP Burada anlatılan iplikçik özgü TRO protokolü fizyolojik koşullar altında transkripsiyon sonlandırma kusuru analiz etmek için güçlü bir deneysel yaklaşımdır. Geleneksel TRO tahlilinde olduğu gibi, bir transkripsiyon sonlandırma kusuru 1 bir göstergesi olarak genin 3 'ucunun ötesine, transkripsiyonal olarak aktif polimeraz varlığına dayanır. Geleneksel TRO testi ile karşılaştı iki büyük sorunlar üstesinden gelir. Birincisi, bu sonlandırma sinyalleri aracılığıyla okuma polimeraz promotör-proksimal bölgeden transkripsiyonu başlatılan biridir olmadığını algılamak, ya da basitçe bir yerde vücutta gelen non-spesifik olarak başlatılan yaygın bir transkripsiyonu polimeraz ya da 3 'temsil eğer genin sonu. İkinci olarak, ayırt eğer ötesinde transkripsiyonel olarak aktif polimeraz sinyalisonlandırıcı bölge gerçek okuma domeyni sens mRNA transkripsiyonu polimeraz ya da bir terminatör başlatılan kodlayıcı olmayan anti-sens RNA sinyalidir. Kısaca, protokol, katlanarak büyüyen maya hücrelerini geçirimli afinite yaklaşımla BrUTP etiketli RNA saflaştırılması, BrUTP nükleotid mevcudiyetinde ince uzun in vivo olarak başlatılan transkript izin içerir saflaştırılmış Yeni oluşan RNA transkripsiyonu ve cDNA amplifiye kullanılarak ters promoteri ve gen 2'nin sonlandırıcı bölgeleri çevreleyen tel-spesifik primerler.
Introduction
Ökaryotik transkripsiyon döngüsü üç ana adımdan oluşur; başlatma, uzama ve sonlanma. RNA polimeraz II transkripsiyonun sonlandırılması, iki farklı, birbirine Adım 3 oluşur. İlk adım, şablondan ayrılması, poliadenilasyonu ve mRNA'nm salınmasını içerir ve hemen şablondan polimerazın ayrılma ile işaretlenmiş, ikinci aşama takip eder. Uygun sonlandırma ve RNA 4, 5 kodlayıcı olmayan yaygın transkripsiyonunu sınırlayarak kontrol anormal transkripsiyonu tutmak için aşağı genlerin transkripsiyonu müdahaleyi önlemek için, transkripsiyon başlama / yeniden başlatılması sırasında polimeraz geri dönüşümü için hayati önem taşımaktadır. Son gelişmelere rağmen, fesih RNA polimeraz II transkripsiyon döngüsü çok az anlaşılan adım olduğunu. Güvenilir bir sonlandırma tahlil mekanizmasını underlyin eğitim için gerekli olanin vivo RNA polimeraz II tarafından transkripsiyon g sonlandırma.
Deneysel bir kısım yaklaşımlar, fizyolojik koşullar altında, bir aktif transkripsiyonu gen sonlandırma kusuru tespit etmek için kullanılır. Bunlar, Kuzey benek, fesih faktörü ChIP (Kromatin Immunoprecipitation) ve geleneksel TRO deneyini içerirler. Bu tekniklerin her biri bazı avantajları ve dezavantajları vardır. Kullanılan geleneksel TRO deney in vivo 1 bir transkripsiyon sonlandırma kusur tespiti için en güvenilir ve hassas bir yaklaşım olarak. Bu tahlil hücre içinde bir genin farklı bölgelerde transkripsiyonel olarak aktif polimeraz molekülleri lokalize. Normal koşullar altında, deney katı geni (Şekil 1A) promoter ve terminatör bölgesi arasında dağıtıldı transkripsiyonel kavranan polimeraz molekülleri gösterir. kusurlu sona ermesi üzerine, ancak, polimeraz sonlandırma sinyali okuyamıyorve gen (Şekil 1B) 3 'ucunun alt baş bölgesinde saptanır.
Bir transkripsiyon sonlandırma kusur promotör yakın bölgeden başlatılan duyu-transkripsiyon polimeraz mevcudiyetinde ortaya ve sonlandırma sinyali Okuyamamak olup, Şekil 'de gösterildiği gibi, bir genin 3' ucunun alt baş bölgesi transkripsiyonu devam Şekil 2A. Genom ve bir genin 6, 7, 8, 9, 10 civarında ezici yaygın anlamda transkripsiyonu yanı sıra anti-sens yön gösteren gerçekleştirilmesi, yakında geleneksel TRO tahlil algılayamaz belli oldu polimeraz sinyali ise bir genin bir teşvikçinin akış aşağısına başlatılan transkript (Şekil 2A) ya da som başlatılan anormal RNA temsilbir gen ya da terminatör elemanı (Şekil 2B) ya da genin (Şekil 2C) 3 'anti-sens yönünde polimeraz transkripsiyonu alt baş ortasına ewhere. gözlenen okuma domeyni polimeraz sinyal yükseltici tarafından başlatılan uzun sens mRNA veya inceleme konusu genin alt başlatılan bir anti-sens transkripti temsil ediyorsa kullanılarak BrUTP burada açıklanan şerit spesifik TRO deney ayırt edebilir. Biz başarıyla maya 2 tomurcuklanan transkripsiyon sonlandırılmasında Kin28 kinaz rolünü göstermek için bu yaklaşımı kullandık. Burada bir yaklaşımı uygulamak suretiyle Biz Rna14 maya tomurcuklanmasına ASC1 transkripsiyon sonlandırma için gerekli olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Bu yöntem Medler, S ve Ansari, A. 2'de bildirilen araştırma makalesinde kullanılmıştır.
1. Kültürleme ve Hasat Hücreler
- Yeni boyanmış bir Saccharomyces cerevisiae plakadan YPD ortamında (10 g / L maya ekstresi, 20 g / L pepton,% 2 dekstroz) hücre 5 ml'lik bir kültürden başlatın.
- 30 ° C ve 250 rpm'de bir orbital çalkalayıcı içinde gece boyunca hücrelerin büyütün.
- 250 mL'lik bölmeli bir şişe içerisinde gece boyunca büyütülmüş kültürden YPD ortamı içinde 100 ml'lik bir nihai hacme 100 kez seyreltilir.
Not: kültür, 100 mL toplam TRO reaksiyon başına gerekli olan; Birden reaksiyonlar gerektiği takdirde, kültür daha büyük bir hacim kullanılmalıdır. - 0.8 bir optik yoğunluğa kadar hücreler büyümek - 1.0, 600 nm (600 ~ 0,8-1,0).
- Bir steril 50 ml konik bir tüp içinde, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 820 x g'de santrifüj ile hücreler hasat edilir.
- buz TMN met 10 mL hücrelerin yeniden süspanseffer (10 mM Tris-HCI pH 7.5, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCI) ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 820 x g'de santrifüj pelet hücreleri. Yavaşça aspirasyon ile süpernatantı kaldırmak.
Deney çalışma üzerinde 2. permeabilizing ve hazırlanması Hücreler
- Yukarı ve aşağı pipetleme hafifçe kesilmiş bir P 1000 ucunu kullanarak% 0.6 sarkosil solüsyonu 1 ml hücrelerin tekrar. soğutulmuş bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın.
- bir çalkalama platformunda 25 dakika boyunca 4 ° C 'de yavaşça hücreler çalkalayın.
Not: mikrosantrifüj tüpleri bu aşamada promoteri meydana gelen yeni bir başlatma olaylarına olma olasılığı önlenmiş olur, soğuk sıcaklık korumak için buz ile 50 ml konik bir tüp içine paketlenmiş olmalıdır. - Bir masa soğutmalı santrifüj kullanılarak 4 ° C'de 6 dakika boyunca 1200 x g'de santrifüjleyin hücreleri.
- Yavaşça per fazla suyu çıkarmak için süpernatant aspiremeabilized hücre topağı.
3. Transkripsiyon Run-on Tepki
- Transkripsiyon 150 mcL çalışma tampon çözelti (50 mM Tris-HCI pH 7.5, 100 mM KCI, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT (ditiyotreitol), 0.75 mM ATP, CTP, GTP ve BrUTP, 200 U RNaz her permeabilize hücre pelletine inhibitörü).
- Yukarı pipetleme ve kesik P 200 ucunu kullanarak aşağı yavaşça karıştırın.
NOT: Birden fazla numune işleme, tüm numuneler hazır olana kadar buz üzerinde her şeyi tutmak ve sonra bir sonraki adıma geçin. - Bir su banyosu içinde 30 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe edilir.
Not: olgunlaşmamış RNA'ya BrUTP optimum dahil edilmesini sağlamak için 1 ila 5 dak arasında fırınlama süresi ayarlayın. - Soğuk hazır kullanım RNA izolasyon reaktif 500 uL ilave ederek reaksiyonu durdurun. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
4. RNA Ekstraksiyon
- Hücre suspensi için asitle yıkanmış cam boncuklar 200 uL ekleyin(3.4 adım a) ve vorteks karıştırıcıda 4 ° C'de 20 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır ilgili.
- Sıcak 22 G iğne kullanılarak mikrosantrifüj tüpü alt delme ve 15 ml steril konik tüp üzerine yerleştirin.
- 4 ° C'de 1 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücre lizatı toplamak. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne hücre lizat aktarın.
- Soğuk RNA izolasyon reaktif 500 ul hücre lisatı kloroform 200 uL ekleyin. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16.168 x g'de vorteksli bir mikserde ve santrifüj içeriğini karıştırın.
- Yeni bir mikrosantrifüj tüpü, üst sulu faz transfer.
- pH 4-5 izoamil alkol / (: 24: 1 125), soğuk fenol / kloroform eşit hacim. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 16.168 x g'de vorteksli bir mikserde ve santrifüj ile kuvvetli bir şekilde çalkalanır.
- Yeni bir mikrosantrifüj tüpü, üst sulu faz ihtiva eden RNA aktarın. Adımı yineleyin 4.6 iki kez daha.
- Nihai RNA içeren sulu faz için, 5 M NaCI stoc ekleme0.3 M bir son konsantrasyon RNA çökeltilmesi için 3 kez soğuk etanol hacim kazandırmak için k.
- 1 saat veya gece -20 ° C'de inkübe edin.
NOT: - anti-BrdU boncuklar (adım 5.3) engelleme inkübe edilirken 4.11 adımları 4.9 gerçekleştirin.
- 1 saat veya gece -20 ° C'de inkübe edin.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16.168 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı ve DEPC (diethylpyrocarbonate) su 100 ul RNA pelletini.
- unincorporated BrUTP nükleotidlerden RNA ayırmak için bir RNA izolasyonu, mini kiti kullanın. RNaz içermeyen su, 100 uL ile kolondan RNA Zehir.
- 5 dakika için 65 ° C su banyosu içinde RNA inkübe ve daha sonra en az 2 dakika süreyle buza transfer.
BrUTP etiketli RNA 5. Affinity Arıtma
- 25 mcL anti-BrdU ekleyin, boncuk yerleşti 500 0.25X SSPE (Sodyum Salin Fosfat EDTA) bağlayıcı tampon (20x SSPE uL: 3 M NaCl, 0.2 M NaH 2 PO 4
- Adımı yineleyin 5.1 üç kez.
- tanelerine (1 mg ultra saf sığır serum albümini (BSA) tampon,% 0.1 polivinilpirolidon, 1 x bağlama) blokaj tamponu içinde 500 ul ilave edin ve yavaşça 1 çalkalayın - bir çalkalama platformunda 4 ° C'de, 2 saat.
- Adım 5.1'de tarif edildiği gibi, bağlama tamponu, 500 uL boncuk iki kez daha yıkanır.
- tanelere bağlayıcı tampon 400 ul ekle.
- boncuk doğrudan (adım 4.11 itibaren) RNA 100 uL aktarın. bir çalkalama platformunda 4 ° C'de 2 saat - yumuşak 1 çalkalayarak kuluçkalayın.
- bağlama tamponu, 500 uL, düşük tuz tamponu 500 uL (0.2x SSPE, 1 mM EDTA,% 0.05 Tween), yüksek tuz tamponu 500 uL (0.25X SSPE, 1 mM EDTA,% 0.05 Tween ile boncuk birbiri ardına yıkandı, 100 mM NaCI) ve iki kez TET tampon 500 uL (1X TE,% 0.05 Tween), sıkma ileHer yıkama arasında 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 200 x g.
- 150 ul iki kez sıralı boncuklardan BrUTP etiketli RNA Zehir ve bir kez yıkama tamponu (20 mM DTT, 150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 7.5, 1 mM EDTA,% 0.1 SDS), 200 ul, inkübe edilerek süpernatandan boncuk ayırmak için kısa bir sıkma ve ardından bir su banyosu içinde 42 ° C 'de 4 dakika karıştırıldı.
BrUTP Etiketli RNA 6. Yağış
- izoamil alkol / soğuk fenol / kloroform, 500 uL ekleyin (: 24: 125 1), pH 4 - 5 BrUTP saflaştınldı afinite RNA etiketli. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 16.168 x g'de vorteksli bir mikserde ve santrifüj ile karıştırın.
- Yeni bir mikrosantrifüj tüpü, üst sulu faz transfer.
- RNA çökeltilmesi için soğuk etanol, 0.3 M 3 kez hacimli bir son konsantrasyon elde etmek için 5 M NaCI stok ekleyin.
- -20 ° C sıcaklıkta gece boyunca inkübe edilir.
- 4 ° C'de 30 dakika boyunca 16.168 x g'de santrifüje edilerek çöktürüldü RNA toplayın. </ Li>
- Süpernatantı ve 10 dakika boyunca havada kurumaya pelet izin verir.
- DEPC su 26 uL RNA pelletini.
- bir spektrofotometre kullanılarak 260 nm'de absorbans ölçülerek son RNA konsantrasyonunun belirlenmesi. Ayrıca, 260/280 oranını belirlemek. A oranı yaklaşık 2 saf RNA numunesinin bir göstergesidir.
- cDNA sentezi için gerekli olana kadar -80 ° C 'de parçalar halinde RNA örnekleri saklayın.
BrUTP etiketli RNA 7. Arka Transkripsiyon
- 100 ng RNA konsantrasyonu ayarlama / uL DEPC su ile. Her cDNA sentez reaksiyonu için RNA, 0.5 ug kullanın.
Not: RNA şablonu konsantrasyonunun uygun cDNA sentezi elde etmek için 0.5 ile 1.0 ug değişebilir. - Şekil 3A'da gösterildiği gibi, aşağı doğru poli (A) alanı (sonlanma) tasarlanmış çok sayıda ters primerleri kullanılarak RNA nın ters transkripsiyonunu.
- Her bir ters transkripsiyon reaksiyonu için RNA templat ul 5 eklemeE (0.5 ug), 1 pL dNTP karışımı (her biri 10 mM), revers primer C, D, E, F ya da G'nin 2 uL (50 uM her biri) ve nükleaz serbest su (Şekil 3A). Her bir tüp içinde son reaksiyon hacmi 13 ml.
Not: Ters transkripsiyon reaksiyonları sayısı cDNA sentezi için kullanılan ters primer sayısına bağlıdır. Örneğin, ASC1 beş ters primerler kullanılmıştır ve bu nedenle, beş, ters transkripsiyon reaksiyonları kurulmuştur. cDNA sentezi için kullanılan ters primer temelinde C, D, E, F ve G gibi bir tüp etiketleyin. - Herhangi bir ikincil yapısal yapıyı çıkarmak için 5 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir PCR RNA şablonu, dNTP karışımı ve primerler ihtiva eden tüpler inkübe ve en az 2 dakika süreyle 4 ° C'ye kadar soğutulur.
- 1 pL transkriptazı (200 U / ml) ters ekleme, 4 ul tampon ve RNA şablon ve primer ihtiva eden her tüpe 0.1 M DTT 2 uL (7.4 adım). yukarı ve aşağı hafifçe pipetleme karıştırın.
- 60 dakika boyunca 42 ° C 'de bir PCR reaksiyon karışımı inkübe edilerek ters transkripsiyon gerçekleştirin.
- 20 dakika boyunca, 65 ° C'de ters transkriptaz inaktive.
- -20 ° C'de cDNA Mağaza ya da bir sonraki adıma geçin.
cDNA 8. amplifikasyonu
- Aşama 7.8, 1.0 uL ileri primer B (10 uM), 1.0 ul den 3.0 uL cDNA şablonu aşağıdaki gibidir: Aşama 7.8 (ASC1 C, D, E, F ve G etiketli) Her cDNA hazırlanması amplifikasyonu için PCR reaksiyonunu gerçekleştirmek ters primer C veya D veya E veya F veya G (10 uM), 2.5 uL 10x polimeraz PCR tamponu, 0.5 uL dNTP karışımı (10 mM), 1.0 uL MgCl2 (2.5 mM), 15.5 pL PCR dereceli su ve 0.5 uL termostabil polimeraz enzimi.
Not: 5 ila 1: 1 arasında değişen bir cDNA şablonu değişik seyreltileri 100 PCR ürünü verimini optimize etmek için test edilmelidir. Tek bir promotör-yakın ileri primer cDNA yı çoğaltmak için kullanılırFarklı geri primerler kullanılarak elde edilmiştir. Örneğin, promotör yakınındaki tek ileri primer B ASC1 G C beş ters primerler ile birlikte kullanılmıştır. BC, BD, Şekil 3A'da gösterildiği gibi, BF ve BG, sırasıyla C, D, E, F ve G olarak işaretlenmiş tüplere kullanılmıştır, BE. - Aşağıdaki termal döngü parametreleri kullanılarak PCR çalışması: 1 döngü 2 dakika süreyle, 95 ° C (polimeraz aktivasyonu için sıcak başlangıç), 30-40 döngü 30 saniye (cinsini değiştirme), 15 saniye için 54 ° C, 95 ° C (tavlama) 1 dakika (uzatma) ve 1 devir 5 dakika için 68 ° C (son uzatma) için 68 ° C'dir.
Not: bağlanma sıcaklığı kullanılan özel primerler bağlı olarak değişir ve uzatma süresi Beklenen ürün boyutuna bağlı olarak değişir. - % 0.8,% 1.5 ya da ürünün beklenen boyutuna bağlı olarak% 2 agaroz jelleri üzerinde elektroforez ile PCR ürünü ayırın.
- El kaderi ve diğerleri de tarif edildiği gibi bir PCR ürünü ölçmek. 2012 11.
NOT: Alternatif olarak, doğmakta olan transkript miktarını ölçmek için gerçek zamanlı RT-qPCR stratejisini kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir transkripsiyon sonlandırma kusur tespit BrUTP iplikli spesifik TRO prosedürü uygulanabilirliğini göstermek için, RNA14 bir sonlandırma arızalı, sıcaklığa duyarlı bir mutant rna14-1 adı kullanılır. RNA polimeraz II, transkripsiyon sona erdirilmesi Rna14 rolü seçilen gen 1 terminatör-proksimal bölgesinde RNA tespit geleneksel TRO tahlili kullanılarak ortaya çıkartılmıştır. Permisif olmayan sıcaklıkta rna14-1 mutant terminatör bölge ötesinde RNA sinyalinin tespiti sonlandırma defekti şeklinde oldu. Gözlenen sinyal Ancak, Şekil 2B'de gösterildiği gibi bir yerde geninin 3 'sonuna yakın transkripsiyonun başlatıldığı yaygın bir transkripsiyon polimeraz atfedilen edilebilir. Kesin sonlandırılmasına Rna14 rolünü göstermek için, biz rna14-1 içinde BrUTP iplikli özgü yasaklama emri uygulandıMutant ve 37 ° C'de izogenik vahşi tip suşu. Bu Şekil 1A 'de gösterildiği gibi, vahşi tip suşu, TRO sinyal promotör ve terminatör bölgeleri arasında kısıtlı beklenmektedir. Rna14-1 mutant Ancak polimeraz terminasyon sinyali okumak ve Şekil 1B ve 2A'da gösterildiği gibi, TRO sinyali genin 3 'ucunun ötesine algılanır.
Kısaca, biz rna14-1 mutantını ve orta log fazı 25 ° C de izogenik vahşi tipli hücreleri büyüdü ve daha sonra üç saat boyunca 37 ° C'ye kadar hücreleri kaymıştır. Transkripsiyon çalışma ile ilgili deneyde, yukarıda tarif edildiği gibi, bir aktif transkripsiyonu, RNA polimeraz aracılığıyla sentezlenebilir oluşmakta olan RNA'ya BrUTP birleştirmek için gerçekleştirilmiştir. BrUTP RNA saflaştırıldı ve, Şekil 3A'da gösterilen primerler C, D, E, F ve G kullanılarak ters transkripsiyon etiketli. karşılık gelen cDNA USI büyütülmüştürng primer çiftleri M.Ö., BD, BE, BF ve BG ve agaroz jelleri (Şekil 3B) üzerinde fraksiyone. Jellerin Niceleme Şekil 3C'de gösterilmiştir. Primer çiftleri PCR amplifiye edilmiş ürünlerin mevcudiyeti, BF BE ve BG rna14-1 mutant fenotipi ile oku sonlandırma (Şekil 3B, Lane 11-13 ve Şekil 3C, bölgeler, E, F ve G) gösterir. Vahşi tip hücrelerde ise, TRO sinyal terminatör elemanı kadar sınırlıydı (Şekil 3B, kulvarlar 2 ve 3 ve Şekil 3C, bölgeler C ve D). Terminatör bölgesi dışındaki tespit edilebilir bir TRO sinyal vardı (Şekil 3B, Şerit 4-6 ve Şekil 3C, bölgeler, E, F ve G). Böylece, bu şekilde Rna14 bir sonlandırma faktör olduğunu teyit mutant fakat vahşi tip hücrelerde sonlandırma sinyali okumak yükseltici tarafından başlatılan olgunlaşmamış transkript tespit olabilir.
Şekil 1: Transkripsiyon Run-on (TRO) Tahlili bir Genin Farklı Bölgelerinde transkripsiyonel Aktif RNA Polimeraz Durum algılar. Sonlandırma normal olduğunda (A), terminatör bölgesi dışında hiçbir polimeraz sinyali yoktur. Arızalı sona ermesi üzerine (B), polimeraz sonlandırma sinyali okuyamıyor ve genin 3 'ucunun ötesine tespit edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Strand özgü TRO Deneyi. şerit spesifik TRO deney tespit eğer T 3 'ucunun ötesine, transkripsiyonal olarak aktif polimeraz varlığıo gen nedeniyle sonlandırma sinyali (A) ile okuma bir promotör tarafından başlatılan polimeraz gerçek sonlandırma kusur, ya da basitçe anlamda yönünde bir yaygın bir transkripsiyonu polimeraz transkripsiyon (B), ya da ncRNA başlatan polimeraz transkripsiyonu, anti-duygusu 3 'ucunda (C). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Polimeraz rna14-1 Mutant içinde Sonlandırma Sinyal aracılığıyla okur olarak Rna14 bir Sonlandırma faktör. (A), ileri primer B, beş ters primerler, C, D, E, F ve G konumunu gösteren ASC1 geninin şematik olarak gösterilmesi saflaştırılmıştır BrUTP etiketli RNA, cDNA sentezi için kullanılan. (Arka primerler C, D, E yapılmış B) cDNA, F ve G, PCR, sırasıyla primer çiftleri BC, BD, BE, BF ve BG kullanılarak büyütülmüştür. (C) 37 ° C 'de vahşi tip ve rna14-1 hücreleri yukarıdaki (B)' de gösterilen TRO de niceliksel veri analizi. 5S RNA normalizasyon kontrol olarak kullanılmıştır. Hata çubukları üç çalışmanın en az dayanan standart sapmanın bir tam birimi temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada kullanılan iplikçik özgü TRO protokolü memeli hücrelerinde 12 Gro-Sek (Global Run On-Sıralama) analiz için kullanılan protokol uyarlanmıştır. Biz başarıyla maya tomurcuklanan doğmakta olan transkripsiyonu incelemek için protokol güncellenmiştir. Özellikle transkripsiyon sonlandırma kusur analiz etmek, biz RNA hidroliz adımı kurtularak daha protokolü ayarlanır. Bu bize özellikle promotör bölgenin yakınında transkripsiyon başlangıç sitesinden başlatılan tam uzunlukta oluşmakta olan transkript algılamak için izin verdi.
anlamlı bir sonuç elde etmek için son derece dikkatli yapılmalıdır protokolde birkaç kritik adımlar vardır. İlk olarak, iletişim kuralı katlanarak büyüyen maya hücreleri ile gerçekleştirilmelidir. Log fazında hücreler (600 ~ 0,8-1,0), bu aşamada hücreler çoğunluğu elde iyi sonuçlar aktif olarak büyüyen ve güçlü transkripsiyon sergiler. İkincisi, RNA izolasyonu st4 ° C - EP 2 arasındaki bir sıcaklıkta mümkün olduğu kadar çabuk yapılması gerekir. Br-UMP afinite saflaştırma RNA etiketli önce Üçüncüsü, adi BrUTP RNA hazırlama çıkarılmalıdır. Biz saflaştırılmış RNA hazırlığından BrUTP kurtulmak için bir RNA kiti kullanıldı. Dördüncü olarak, sağlam bir ters transkriptazın kullanım protokolü başarılı başarı için önemlidir.
daha hızlı, daha hassas ve daha yüksek çözünürlük sergileyen burada kullanılan iplikçik özgü TRO protokolü sonlandırma kusur tespit Kuzey blot üzerinde avantajlara sahiptir. anti-sense transkript duygusu transkript ayırt ve gözlenen sonuç nedeniyle eğer bir promotör aşağı bölgeden başlayarak transkripsiyonu ya da anormal transkripsiyonu promotör tarafından başlatılan gibi bu protokol aynı zamanda geleneksel TRO protokolü daha iyidir. iplikçik özgü TRO protokolü bazı sınırlamalar vardır. Daha zahmetli ve zaman istikrarlı st daha alıcıdırmRNA algılama teknikleri yedik. Bu hücreler, çok sayıda gerektirir. Bu nedenle, düşük transkripsiyon genlerin transkripsiyonu analizi bir sorun olabilir.
Biz başarıyla maya 2 tomurcuklanan RNA polimeraz II transkripsiyon döngüsünde sonlandırma kusur incelemek için bu tekniği kullandık. yaklaşım da mayada RNA polimeraz I ve RNA polimeraz III transkripsiyon sonlandırma çalışma uzatılabilir. Uygun düzenlemeler ile, bu yaklaşım aynı zamanda daha yüksek ökaryotlarda transkripsiyon sonlandırma kusur çalışma uygulanabilir. Genel olarak, teknik yüksek tekrarlanabilir, nispeten ucuz ve moleküler biyoloji laboratuarında kullanılan standart ekipman gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
References
- Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
- Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription. Sci Rep. 5, 12586 (2015).
- Richard, P., Manley, J. L. Transcription termination by nuclear RNA polymerases. Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).
- Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).
- Porrua, O., Libri, D. Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).
- Jacquier, A. The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs. Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).
- Xu, Z., et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).
- Neil, H., et al. Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).
- Clark, M. B., et al.
- Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast. Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).
- El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C). Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
