Abstract
यह पांडुलिपि विवो में प्रतिलेखन समाप्ति दोष का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। कतरा-विशिष्ट TRO प्रोटोकॉल BrUTP का उपयोग कर यहाँ वर्णित शारीरिक शर्तों के तहत प्रतिलेखन समाप्ति दोष का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है। पारंपरिक TRO परख की तरह, यह एक प्रतिलेखन समाप्ति दोष 1 के एक संकेत के रूप में जीन के 3 'के अंत से परे एक transcriptionally सक्रिय पोलीमर्स की उपस्थिति पर निर्भर करता है। यह दो प्रमुख पारंपरिक TRO परख के साथ सामना करना पड़ा समस्याओं पर काबू। सबसे पहले, यह यदि पोलीमर्स समाप्ति संकेत के माध्यम से पढ़ने से एक है कि प्रमोटर समीपस्थ क्षेत्र से प्रतिलेखन शुरू की है का पता लगाने, या कर सकते हैं अगर यह बस एक pervasively transcribing पोलीमर्स कि कहीं शरीर में से शुरू की गैर-विशेष या 3 'प्रतिनिधित्व कर रहा है जीन का अंत। दूसरे, यह भेद कर सकते हैं, तो परे transcriptionally सक्रिय पोलीमर्स संकेतटर्मिनेटर क्षेत्र वास्तव में readthrough भावना mRNA transcribing पोलीमर्स या एक टर्मिनेटर द्वारा आरंभ किए गए गैर-कोडिंग विरोधी भावना आरएनए संकेत है। संक्षेप में, प्रोटोकॉल तेजी से बढ़ रही खमीर कोशिकाओं permeabilizing, टेप है कि इन विवो में शुरू BrUTP न्यूक्लियोटाइड की उपस्थिति में बढ़ाना करने के लिए, सफ़ाई आत्मीयता के दृष्टिकोण से BrUTP लेबल शाही सेना की अनुमति के शामिल है, शुद्ध नवजात आरएनए transcribing और सीडीएनए amplifying का उपयोग कर रिवर्स कतरा-विशिष्ट प्राइमरों प्रमोटर और जीन 2 के टर्मिनेटर क्षेत्रों flanking।
Introduction
यूकेरियोटिक प्रतिलेखन चक्र तीन प्रमुख चरणों के होते हैं; दीक्षा, बढ़ाव और समाप्ति। शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय द्वारा प्रतिलेखन की समाप्ति के दो अलग-अलग, अन्योन्याश्रित चरण 3 के होते हैं। पहला कदम टेम्पलेट से दरार, polyadenylation और mRNA की रिहाई शामिल है, और तुरंत दूसरे चरण के लिए, टेम्पलेट से पोलीमर्स की मुक्ति के द्वारा चिह्नित द्वारा पीछा किया जाता है। उचित समाप्ति बहाव के जीन के प्रतिलेखन के साथ हस्तक्षेप को रोकने, और गैर-कोडिंग व्यापक आरएनए 4, 5 के प्रतिलेखन सीमित द्वारा जांच में न्यायपालिका प्रतिलेखन रखने के लिए के लिए, प्रतिलेखन की दीक्षा / reinitiation दौरान पोलीमर्स की रीसाइक्लिंग के लिए महत्वपूर्ण है। हाल ही में प्रगति के बावजूद, समाप्ति शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन चक्र की अब तक कम से कम समझ में आ कदम से है। एक विश्वसनीय समाप्ति परख तंत्र underlyin का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैविवो में शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय द्वारा प्रतिलेखन के छ समाप्ति।
प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के एक नंबर शारीरिक शर्तों के तहत एक सक्रिय रूप से transcribing जीन में दोष समाप्ति का पता लगाने के लिए किया जाता है। ये उत्तरी धब्बा, समाप्ति कारक चिप (chromatin immunoprecipitation) और पारंपरिक TRO परख शामिल हैं। इन तकनीकों में से प्रत्येक के कुछ फायदे और नुकसान है। पारंपरिक TRO इस्तेमाल किया परख विवो 1 में एक प्रतिलेखन समाप्ति दोष का पता लगाने के लिए सबसे अधिक विश्वसनीय और संवेदनशील दृष्टिकोण हो। इस परख सेल के अंदर एक जीन के विभिन्न क्षेत्रों पर transcriptionally सक्रिय पोलीमर्स अणुओं localizes। सामान्य परिस्थितियों के अंतर्गत, परख सख्ती से जीन (चित्रा 1 ए) के प्रमोटर और टर्मिनेटर क्षेत्र के बीच वितरित transcriptionally लगे पोलीमर्स अणुओं से पता चलता है। दोषपूर्ण समाप्ति पर, तथापि, पोलीमर्स समाप्ति संकेत पढ़ने में असमर्थ हैऔर इस क्षेत्र जीन (चित्रा 1 बी) के 3 'अंत के बहाव में पता चला है।
एक प्रतिलेखन समाप्ति दोष भावना-transcribing पोलीमर्स कि प्रमोटर समीपस्थ क्षेत्र से शुरू की उपस्थिति में प्रकट होता है, और समाप्ति संकेत पढ़ने में असमर्थ जा रहा है, इस क्षेत्र में एक जीन के 3 'अंत के बहाव transcribing के रूप में चित्र में दिखाया गया जारी है 2A। अहसास है कि यूकेरियोटिक जीनोम में और एक जीन 6, 7, 8, 9, 10 के आसपास अर्थों में भारी व्यापक प्रतिलेखन के साथ ही विरोधी भावना दिशाओं प्रदर्शन के साथ, यह जल्द ही स्पष्ट हो गया है कि पारंपरिक TRO परख का पता नहीं लगा सकता है अगर पोलीमर्स संकेत एक जीन के बहाव के एक प्रमोटर की पहल की प्रतिलिपि (2A चित्रा) या एक न्यायपालिका आरएनए कि सोम की पहल का प्रतिनिधित्व करता हैजीन या टर्मिनेटर तत्व (चित्रा 2 बी), या जीन (चित्रा 2 सी) के 3 'अंत से विरोधी भावना दिशा में पोलीमर्स transcribing के बहाव के बीच में ewhere। यदि मनाया readthrough पोलीमर्स संकेत प्रमोटर शुरू की विस्तारित भावना mRNA या एक विरोधी भावना प्रतिलेख कि परीक्षा के तहत जीन के बहाव शुरू कर दी प्रतिनिधित्व कतरा विशिष्ट TRO परख BrUTP का उपयोग कर यहाँ वर्णित भेद कर सकते हैं। हम सफलतापूर्वक खमीर 2 नवोदित में प्रतिलेखन के समापन में Kin28 काइनेज की भूमिका प्रदर्शित करने के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है। यहाँ दृष्टिकोण को रोजगार हम बताते हैं कि Rna14 नवोदित खमीर में ASC1 का प्रतिलेखन की समाप्ति के लिए आवश्यक है।
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Protocol
नोट: इस विधि अनुसंधान लेख Medler, एस और अंसारी, ए 2 में रिपोर्ट में इस्तेमाल किया गया था।
1. संवर्धन और कटाई प्रकोष्ठों
- एक हौसले से परेशान Saccharomyces cerevisiae थाली से YPD मध्यम (10 जी / एल खमीर निकालने, 20 ग्राम / एल peptone, 2% डेक्सट्रोज) में कोशिकाओं का एक 5 एमएल संस्कृति की शुरुआत करें।
- 30 डिग्री सेल्सियस और 250 rpm पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन में रात भर कोशिकाओं को विकसित।
- एक 250 एमएल चकित फ्लास्क में रातोंरात बड़े संस्कृति YPD माध्यम में 100 एमएल की अंतिम मात्रा से 100 गुना पतला।
नोट: संस्कृति की 100 मिलीलीटर की कुल TRO प्रतिक्रिया प्रति की जरूरत है; अगर कई प्रतिक्रियाओं की जरूरत है, संस्कृति की एक बड़ी मात्रा में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। - (- 1.0 एक 600 ~ 0.8) 600 एनएम पर 1.0 - 0.8 की एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए कोशिकाओं को विकसित।
- एक बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 820 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसल।
- बर्फ के ठंडे TMN बू के 10 एमएल में कोशिकाओं Resuspendffer (10 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.5, 5 मिमी 2 MgCl, 100 मिमी NaCl) और 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 820 XG पर अपकेंद्रित्र गोली कोशिकाओं। धीरे आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
2. Permeabilizing और परख भागो-ऑन के लिए कक्षों की तैयारी
- ऊपर और नीचे pipetting धीरे एक छोटा पी 1000 टिप का उपयोग करके 0.6% sarkosyl समाधान के 1 एमएल में कोशिकाओं Resuspend। एक ठंडा 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण।
- एक मंच प्रकार के बरतन पर 25 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धीरे कोशिकाओं हिला।
नोट: microcentrifuge ट्यूबों एक ठंडे तापमान को बनाए रखने के लिए, किसी भी नए दीक्षा घटनाओं को इस स्तर पर प्रमोटर पर होने वाली की संभावना से बचने बर्फ के साथ एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पैक किया जाना चाहिए। - कोशिकाओं को एक टेबलटॉप प्रशीतित अपकेंद्रित्र का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 1,200 XG पर अपकेंद्रित्र।
- धीरे प्रति से किसी भी अतिरिक्त तरल दूर करने के लिए सतह पर तैरनेवाला aspiratemeabilized सेल गोली।
3. ट्रांसक्रिप्शन रन-पर प्रतिक्रिया
- प्रतिलेखन के 150 μL जोड़े रन पर बफर (50 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.5, 100 मिमी KCl, 10 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी डीटीटी (dithiothreitol), 0.75 मिमी एटीपी, सीटीपी, जीटीपी, और BrUTP, 200 यू RNase के प्रत्येक अवरोध) permeabilized सेल गोली।
- ऊपर pipetting द्वारा और एक छोटा पी 200 टिप का उपयोग कर नीचे धीरे मिलाएं।
नोट: कई नमूने प्रसंस्करण हैं, जब तक सभी नमूने तैयार कर रहे हैं बर्फ पर सब कुछ रखने के लिए और उसके बाद अगले कदम के लिए आगे बढ़ें। - एक पानी के स्नान में 30 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
नोट: नवजात आरएनए में BrUTP का इष्टतम समावेश सुनिश्चित करने के लिए 1 से 5 मिनट के बीच गर्मी के समय को समायोजित करें। - ठंड के लिए तैयार करने के लिए उपयोग शाही सेना अलगाव अभिकर्मक के 500 μL जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
4. शाही सेना निकालना
- एसिड धोया कांच के मोती के 200 μL सेल suspensi में जोड़े(3.4 कदम), और सख्ती 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक भंवर मिक्सर में मिलाने पर।
- एक गर्म 22 जी सुई का उपयोग microcentrifuge ट्यूब के नीचे पंचर और एक 15 एमएल बाँझ शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर जगह है।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र सेल lysate इकट्ठा करने के लिए। एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब सेल lysate स्थानांतरण।
- ठंड शाही सेना अलगाव अभिकर्मक के 500 μL और सेल lysate को क्लोरोफॉर्म के 200 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,168 XG पर एक भंवर मिक्सर और सेंट्रीफ्यूज पर सामग्री मिश्रण।
- एक नया microcentrifuge ट्यूब ऊपरी जलीय चरण स्थानांतरण।
- ठंड फिनोल / क्लोरोफॉर्म के एक बराबर मात्रा जोड़ें / isoamyl शराब (125: 24: 1) पीएच 4-5। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,168 XG पर एक भंवर मिक्सर और सेंट्रीफ्यूज पर सख्ती से हिला।
- एक नया microcentrifuge ट्यूब ऊपरी जलीय चरण युक्त आरएनए स्थानांतरण। दोहराएँ कदम 4.6 दो बार।
- अंतिम शाही सेना युक्त जलीय चरण के लिए, जोड़ने के 5 एम NaCl stocपाने के लिए 0.3 एम के अंतिम एकाग्रता आरएनए वेग 3 बार ठंड इथेनॉल की मात्रा में जोड़ें कश्मीर।
- 1 घंटे के लिए या रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
नोट: - 4.11, जबकि विरोधी BrdU मोती अवरुद्ध (कदम 5.3 देखें) के लिए incubated किया जा रहा है कदम 4.9 प्रदर्शन करना।
- 1 घंटे के लिए या रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,168 XG पर अपकेंद्रित्र। तैरनेवाला निकालें और DEPC (diethylpyrocarbonate) पानी की 100 μL में शाही सेना गोली resuspend।
- अनिगमित BrUTP न्यूक्लियोटाइड से शाही सेना को अलग करने के एक शाही सेना अलगाव मिनी किट का प्रयोग करें। RNase मुक्त पानी के 100 μL के साथ स्तंभ से शाही सेना Elute।
- 5 मिनट के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शाही सेना सेते हैं और फिर कम से कम 2 मिनट के लिए बर्फ के लिए स्थानांतरण।
5. BrUTP लेबल शाही सेना की आत्मीयता शुद्धि
- 25 μL करने के लिए विरोधी BrdU मोती बसे, जोड़ने के 500 0.25x SSPE (सोडियम फास्फेट खारा EDTA) बाध्यकारी बफर (20x SSPE की μL: 3 एम NaCl, 0.2 एम नः 2 4 पीओ
- दोहराएँ कदम 5.1 तीन बार।
- बफर अवरुद्ध (1x बफर, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 1 मिलीग्राम अति शुद्ध गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) बाध्यकारी) मोती के 500 μL जोड़ें और 1 के लिए धीरे से मिलाने - एक मंच प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे।
- मोती 5.1 कदम के रूप में वर्णित, बाध्यकारी बफर के 500 μL के साथ दो बार धोएं।
- मोती के लिए बाध्यकारी बफर के 400 μL जोड़ें।
- मोती के लिए आरएनए (कदम 4.11 से) के 100 μL स्थानांतरण सीधे। एक मंच प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच - कोमल 1 के लिए झटकों के साथ सेते हैं।
- बाध्यकारी बफर के 500 μL, कम नमक बफर के 500 μL (0.2X SSPE, 1 मिमी EDTA, 0.05% के बीच), उच्च नमक बफर के 500 μL (0.25x SSPE, 1 मिमी EDTA, 0.05% के बीच के साथ मोती क्रमिक रूप से धो लें, 100 मिमी NaCl), और दो बार) TET बफर के 500 μL (1x ते, 0.05% के बीच है, कम से कताई के साथ200 प्रत्येक धोने के बीच में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए XG।
- 150 μl के साथ Elute क्रमिक रूप से मोतियों से BrUTP लेबल शाही सेना, दो बार और एक बार क्षालन बफर (20 मिमी डीटीटी, 150 मिमी NaCl, 50 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.5, 1 मिमी EDTA, 0.1% एसडीएस) के 200 μl के साथ, incubating द्वारा सतह पर तैरनेवाला से मोती अलग करने के लिए एक छोटी स्पिन के बाद एक पानी के स्नान में 42 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए।
6. BrUTP लेबल शाही सेना की वर्षा
- 500 μL ठंड फिनोल / क्लोरोफॉर्म के isoamyl शराब जोड़ें / (: 24: 125 1) 4 पीएच - आत्मीयता शुद्ध BrUTP करने के लिए 5 लेबल शाही सेना। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,168 XG पर एक भंवर मिक्सर और सेंट्रीफ्यूज पर मिलाएं।
- एक नया microcentrifuge ट्यूब ऊपरी जलीय चरण स्थानांतरण।
- 5 एम NaCl शेयर जोड़े आरएनए वेग 0.3 एम और 3 बार ठंड इथेनॉल की मात्रा के अंतिम एकाग्रता पाने के लिए।
- -20 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 16,168 XG पर centrifugation से उपजी शाही सेना को ले लीजिए। </ Li>
- तैरनेवाला निकालें और 10 मिनट के लिए शुष्क हवा गोली अनुमति देते हैं।
- DEPC पानी के 26 μL में शाही सेना गोली Resuspend।
- 260 एनएम पर absorbance को मापने के एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके अंतिम आरएनए एकाग्रता का निर्धारण। इसके अलावा, निर्धारित 260/280 अनुपात। एक अनुपात ~ 2 एक शुद्ध शाही सेना के नमूने का संकेत है।
- -80 पर aliquots में शाही सेना के नमूने स्टोर डिग्री सेल्सियस तक सीडीएनए संश्लेषण के लिए की जरूरत है।
7. BrUTP लेबल शाही सेना की रिवर्स प्रतिलेखन
- 100 एनजी शाही सेना एकाग्रता समायोजित / μL DEPC पानी का उपयोग कर। प्रत्येक सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया के लिए शाही सेना के 0.5 ग्राम का प्रयोग करें।
नोट: शाही सेना टेम्पलेट की एकाग्रता इष्टतम सीडीएनए संश्लेषण हासिल करने के लिए 0.5 से 1.0 माइक्रोग्राम करने के लिए भिन्न हो सकते हैं। - आरएनए टाइप कई रिवर्स पाली (ए) साइट (समाप्ति साइट) के बहाव के लिए बनाया गया प्राइमरों के रूप में चित्रा 3 ए में दिखाया गया है का उपयोग कर उल्टा।
- प्रत्येक रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया करने के लिए, आरएनए templat μl 5 जोड़नेई (0.5 माइक्रोग्राम), 1 μL dNTP मिश्रण (10 मिमी प्रत्येक), रिवर्स प्राइमर सी, डी, ई, एफ या जी के 2 μL (50 माइक्रोन के प्रत्येक) और nuclease मुफ्त पानी (चित्रा 3A देखें)। प्रत्येक ट्यूब में अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा 13 μL है।
नोट: रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं की संख्या रिवर्स सीडीएनए संश्लेषण के लिए इस्तेमाल प्राइमरों की संख्या पर निर्भर करेगा। उदाहरण के लिए, ASC1 के लिए पांच रिवर्स प्राइमरों इस्तेमाल किया गया है और इसलिए पांच रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं की स्थापना की थी। रिवर्स सीडीएनए संश्लेषण के लिए इस्तेमाल प्राइमर के आधार पर सी, डी, ई, एफ और जी के रूप में ट्यूबों के लेबल। - किसी भी माध्यमिक संरचनात्मक रचना को दूर करने के 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक thermocycler में शाही सेना टेम्पलेट, dNTP मिश्रण और प्राइमरों युक्त ट्यूबों सेते हैं, और उसके बाद कम से कम 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस तक शांत।
- जोड़े 1 μL रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (200 यू / μL), 4 μL बफर और आरएनए टेम्पलेट और प्राइमर युक्त प्रत्येक ट्यूब 0.1 एम डीटीटी के 2 μL (कदम 7.4)। धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स।
- 60 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर एक thermocycler में प्रतिक्रिया मिश्रण incubating द्वारा रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन करना।
- 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस निष्क्रिय।
- -20 डिग्री सेल्सियस पर सीडीएनए स्टोर या अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
8. सीडीएनए के प्रवर्धन
- कदम 7.8, 1.0 μL आगे प्राइमर बी (10 माइक्रोन), 1.0 से 3.0 μL μL सीडीएनए टेम्पलेट: इस प्रकार के रूप में कदम 7.8 से प्रत्येक सीडीएनए तैयारी (ASC1 के लिए सी, डी, ई, एफ और जी लेबल) के प्रवर्धन के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया प्रदर्शन रिवर्स प्राइमर सी या डी या ई या एफ या जी (10 माइक्रोन) के 2.5 μL 10x पोलीमर्स पीसीआर बफर, 0.5 μL dNTP मिश्रण (10 मिमी प्रत्येक), 1.0 μL 2 MgCl (2.5 मिमी), 15.5 μL पीसीआर ग्रेड पानी, और 0.5 μL थर्मास्टाइबल पोलीमर्स एंजाइम।
नोट: 5 से 1: 1 से लेकर सीडीएनए टेम्पलेट के विभिन्न dilutions 100 पीसीआर उत्पाद उपज अनुकूलन करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। एक एकल प्रमोटर समीपस्थ आगे प्राइमर सीडीएनए बढ़ाना लिए इस्तेमाल किया जाएगाअलग रिवर्स प्राइमरों का उपयोग प्राप्त की। उदाहरण के लिए, एक भी आगे प्राइमर प्रमोटर के पास स्थित B पांच ASC1 के लिए जी सी से रिवर्स प्राइमरों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया था। ई.पू., बीडी, बीई, के रूप में चित्रा 3 ए में दिखाया गया बीएफ और बीजी क्रमशः सी, डी, ई, एफ और जी के रूप में चिह्नित ट्यूबों में इस्तेमाल किया गया। - निम्नलिखित थर्मल साइकिल मापदंडों का उपयोग पीसीआर चलाएँ: 1 चक्र 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस (पोलीमर्स के सक्रियण के लिए गर्म शुरू), 30 - 40 चक्रों 30 एस (विकृतीकरण), 15 एस के लिए 54 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस (annealing) 1 मिनट (विस्तार), और 1 चक्र 5 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस (अंतिम विस्तार) के लिए 68 डिग्री सेल्सियस।
नोट: annealing तापमान विशिष्ट प्राइमरों के आधार पर इस्तेमाल किया जा रहा है अलग अलग होंगे और विस्तार के समय अपेक्षित उत्पाद आकार के आधार पर अलग अलग होंगे। - अलग पीसीआर उत्पाद वैद्युतकणसंचलन द्वारा 0.8%, 1.5%, या 2% agarose उत्पाद की उम्मीद आकार पर निर्भर करता है जैल पर।
- एल Kaderi एट अल में वर्णित के रूप में पीसीआर उत्पाद यों। 2012 11।
नोट: वैकल्पिक रूप से, वास्तविक समय RT-qPCR रणनीति का उपयोग नवजात टेप की राशि यों।
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Representative Results
एक प्रतिलेखन समाप्ति दोष का पता लगाने में BrUTP-कतरा विशिष्ट TRO प्रक्रिया के लागू प्रदर्शित करने के लिए, हम RNA14 का समापन-दोषपूर्ण, तापमान के प्रति संवेदनशील उत्परिवर्ती rna14-1 बुलाया करते थे। शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय द्वारा प्रतिलेखन के समापन में Rna14 की भूमिका परंपरागत TRO परख है कि चयनित जीन 1 की टर्मिनेटर-समीपस्थ क्षेत्र में शाही सेना का पता चला का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। गैर अनुमोदक के तापमान पर rna14-1 उत्परिवर्ती में टर्मिनेटर क्षेत्र से परे आरएनए संकेत का पता लगाने समाप्ति दोष के रूप में लगाया गया था। मनाया संकेत है, तथापि, pervasively transcribing पोलीमर्स है कि कहीं न कहीं जीन के 3 'अंत के पास से प्रतिलेखन शुरू की के रूप में चित्रा 2 बी में दिखाया गया है के लिए जिम्मेदार माना जा सकता है। निर्णायक समाप्ति में Rna14 की भूमिका को प्रदर्शित करने के लिए, हम rna14-1 में BrUTP-कतरा विशिष्ट TRO प्रदर्शनउत्परिवर्ती और 37 डिग्री सेल्सियस पर isogenic जंगली प्रकार तनाव। हमें उम्मीद है कि जंगली प्रकार के तनाव में, tro संकेत के रूप में चित्रा 1 ए में दिखाया गया प्रमोटर और टर्मिनेटर क्षेत्रों के बीच विवश हो जाएगा। Rna14-1 उत्परिवर्ती में, हालांकि, पोलीमर्स समाप्ति संकेत के माध्यम से पढ़ा होगा और TRO संकेत के रूप में चित्रा 1 बी और 2A में दिखाया जीन के 3 'अंत से परे पता लगाया जाएगा।
संक्षेप में, हम rna14-1 उत्परिवर्ती और मध्य लॉग चरण के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अपने isogenic जंगली प्रकार की कोशिकाओं की वृद्धि हुई और उसके बाद तीन घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं स्थानांतरित कर दिया। ट्रांसक्रिप्शन रन पर परख के रूप में ऊपर वर्णित एक सक्रिय रूप से transcribing शाही सेना पोलीमरेज़ द्वारा संश्लेषित नवजात शाही सेना में शामिल करने के लिए BrUTP प्रदर्शन किया गया था। BrUTP लेबल शाही सेना शुद्ध किया गया था और प्राइमरों सी, डी, ई, एफ, जी और चित्रा 3 ए में दिखाया गया है का उपयोग करते हुए लिखित उल्टा। इसी सीडीएनए पीसीआर परिलक्षित किया गया था यूएसआईएनजी प्राइमर जोड़े ई.पू., बीडी, बीई, बीएफ, और बीजी और agarose जैल (चित्रा 3 बी) पर fractionated। जैल की मात्रा चित्रा -3 सी में दिखाया गया है। प्राइमर जोड़े से पीसीआर प्रवर्धित उत्पादों की उपस्थिति, बीएफ, और rna14-1 उत्परिवर्ती में बीजी एक समाप्ति phenotype के माध्यम से पढ़ा (चित्रा 3 बी, लेन 11 - 13, और चित्रा -3 सी, क्षेत्रों ई, एफ और जी) को दर्शाता है। जंगली प्रकार की कोशिकाओं में, हालांकि, tro संकेत टर्मिनेटर तत्व तक ही सीमित था (चित्रा 3 बी, गलियों 2 और 3, और चित्रा -3 सी, क्षेत्रों सी और डी)। टर्मिनेटर क्षेत्र से परे नहीं detectable TRO संकेत नहीं था (चित्रा 3 बी, लेन 4 - 6, और चित्रा -3 सी, क्षेत्रों ई, एफ और जी)। इस प्रकार, हम प्रमोटर द्वारा आरंभ किए गए नवजात टेप कि उत्परिवर्ती में है, लेकिन जंगली प्रकार की कोशिकाओं में नहीं समाप्ति संकेत के माध्यम से पढ़ा पता लगा सकता है, जिससे इस बात की पुष्टि है कि Rna14 एक समाप्ति कारक है।
चित्रा 1: ट्रांसक्रिप्शन रन-पर (TRO) परख एक जीन के विभिन्न क्षेत्रों में सक्रिय Transcriptionally आरएनए पोलीमरेज़ की उपस्थिति का पता लगाता। (क) जब समाप्ति सामान्य है, वहाँ टर्मिनेटर क्षेत्र से परे नहीं पोलीमर्स संकेत है। (बी) दोषपूर्ण समाप्ति पर, पोलीमर्स समाप्ति संकेत पढ़ने में असमर्थ है और जीन के 3 'अंत से परे का पता लगाया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: कतरा विशिष्ट TRO परख। कतरा-विशिष्ट TRO परख का पता लगाने कर सकते हैं अगर टी के 3 'के अंत से परे एक transcriptionally सक्रिय पोलीमर्स की उपस्थितिवह जीन प्रमोटर द्वारा आरंभ किए गए पोलीमर्स समाप्ति संकेत (ए) के माध्यम से पढ़ने के कारण एक सच्चे समाप्ति दोष है, या यह बस भावना दिशा में एक pervasively transcribing पोलीमर्स transcribing (बी) है, या यह विरोधी भावना ncRNA transcribing पोलीमर्स की शुरुआत है 3 'के अंत (सी) से। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: Rna14 एक समाप्ति फैक्टर के रूप में पोलीमरेज़ rna14-1 उत्परिवर्ती में समाप्ति संकेत के माध्यम से पढ़ता है। (ए) आगे प्राइमर बी और पांच रिवर्स प्राइमरों, सी, डी, ई, एफ, जी और की स्थिति को दिखा ASC1 जीन की योजनाबद्ध चित्रण शुद्ध BrUTP लेबल शाही सेना के सीडीएनए संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया। (बी) सीडीएनए रिवर्स प्राइमरों सी, डी, ई से बना है, एफ और जी पीसीआर क्रमश प्राइमरों जोड़े ई.पू., बीडी, बीई, बीएफ और बीजी का उपयोग कर परिलक्षित किया गया था। (सी) 37 डिग्री सेल्सियस पर जंगली प्रकार और rna14-1 कोशिकाओं में ऊपर (बी) में दिखाया गया TRO डेटा के मात्रात्मक विश्लेषण। 5 एस आरएनए सामान्य बनाने के नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। त्रुटि सलाखों तीन परीक्षणों की एक न्यूनतम के आधार पर मानक विचलन का एक पूर्ण इकाई का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
कतरा-विशिष्ट TRO यहां इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल स्तनधारी कोशिकाओं 12 में GRO-Seq (ग्लोबल भागो पर अनुक्रमण) के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया था। हम सफलतापूर्वक खमीर नवोदित में नवजात प्रतिलेखन अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल संशोधित। विशेष रूप से प्रतिलेखन समाप्ति दोष का विश्लेषण करने के लिए, हम द्वारा शाही सेना हाइड्रोलिसिस कदम से छुटकारा पाने के लिए आगे प्रोटोकॉल समायोजित। यह हमें विशेष रूप से पूरी लंबाई नवजात टेप है कि प्रमोटर क्षेत्र के पास प्रतिलेखन शुरू साइट से शुरू की पता लगाने के लिए अनुमति दी।
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम है कि एक सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए अत्यंत सावधानी के साथ किया जाना चाहिए रहे हैं। सबसे पहले, प्रोटोकॉल तेजी से बढ़ रही खमीर कोशिकाओं के साथ किया जाना चाहिए। लॉग चरण में कोशिकाओं (ए 600 ~ 0.8 - 1.0) देने के लिए इस स्तर पर कोशिकाओं के बहुमत के रूप में सबसे अच्छा परिणाम सक्रिय रूप से बढ़ रही है और मजबूत प्रतिलेखन प्रदर्शन कर रहे हैं। दूसरा, आरएनए अलगाव सेंट4 डिग्री सेल्सियस - ईपी 2 के बीच एक के तापमान पर के रूप में जल्दी संभव के रूप में किया जाना चाहिए। तीसरा, बीआर-UMP की आत्मीयता शुद्धि लेबल शाही सेना से पहले, अनिगमित BrUTP आरएनए तैयारी से हटाया जाना चाहिए। हम एक आरएनए किट शुद्ध शाही सेना तैयारी से BrUTP से छुटकारा पाने के लिए इस्तेमाल किया। चौथा, एक मजबूत रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के उपयोग के प्रोटोकॉल के सफल उपलब्धि के लिए महत्वपूर्ण है।
के रूप में इसे और अधिक संवेदनशील है, तेजी से और उच्च संकल्प को दर्शाती कतरा विशिष्ट TRO यहां इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल समाप्ति दोष का पता लगाने में उत्तरी धब्बा तकनीक से अधिक लाभ है। इस प्रोटोकॉल के रूप में यह विरोधी भावना टेप से भावना टेप भेद कर सकते हैं और अगर मनाया परिणाम की वजह से है एक प्रमोटर बहाव के क्षेत्र से शुरू प्रमोटर शुरू की प्रतिलेखन या न्यायपालिका प्रतिलेखन भी पारंपरिक TRO प्रोटोकॉल की तुलना में बेहतर है। कतरा-विशिष्ट TRO प्रोटोकॉल कुछ सीमाएँ हैं। यह और अधिक कठिन और समय स्थिर सेंट की तुलना में काफ़ी हैmRNA पता लगाने की तकनीक खा लिया। यह कोशिकाओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता है। इसलिए, कम Transcribing जीनों के प्रतिलेखन के विश्लेषण के लिए एक समस्या हो सकती है।
हम सफलतापूर्वक खमीर 2 नवोदित में शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन चक्र में समाप्ति दोष का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है। दृष्टिकोण खमीर में शाही सेना पोलीमरेज़ मैं और आरएनए पोलीमर्स तृतीय द्वारा प्रतिलेखन की समाप्ति का अध्ययन करने के साथ ही बढ़ाया जा सकता है। उचित संशोधनों के साथ, दृष्टिकोण भी उच्च eukaryotes में प्रतिलेखन समाप्ति दोष का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। कुल मिलाकर, तकनीक अपेक्षाकृत सस्ती है, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और मानक एक आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला में इस्तेमाल उपकरणों की आवश्यकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
References
- Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
- Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription. Sci Rep. 5, 12586 (2015).
- Richard, P., Manley, J. L. Transcription termination by nuclear RNA polymerases. Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).
- Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).
- Porrua, O., Libri, D. Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).
- Jacquier, A. The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs. Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).
- Xu, Z., et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).
- Neil, H., et al. Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).
- Clark, M. B., et al.
- Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast. Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).
- El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C). Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
