Abstract
כתב יד זה מתאר פרוטוקול לאיתור פגם סיום שעתוק in vivo. פרוטוקול TRO ספציפי הגדיל באמצעות BrUTP המתואר כאן הוא גישה ניסויית עצמה לניתוח פגם סיום שעתוק בתנאים פיסיולוגיים. כמו assay TRO המסורתי, היא מסתמכת על הנוכחות של פולימראז תעתיק פעיל מעבר סוף '3 של גן כאינדיקטור פגם סיום שעתוק 1. זה מתגבר שתי בעיות עיקריות נתקלו עם assay TRO המסורתי. ראשית, הוא יכול לזהות אם פולימראז שקרא את אות הסיום הוא זה שיזם שעתוק מאזור האמרגן-הפרוקסימלי, או אם זה פשוט מייצג פולימראז transcribing pervasively שיזם הלא במיוחד מאיפשהו בגוף או '3 סוף הגן. שנית, הוא יכול להבחין אם אות פולימראז הפעילה תעתיק מעברבאזור terminator הוא באמת mRNA תחושה readthrough transcribing פולימראז או אות רנ"א אנטי במובן הלא קידוד terminator ביוזמת. בקצרה, פרוטוקול כרוך permeabilizing התאים שמרים גדל באופן אקספוננציאלי, מה שמאפשר את תמלילי כי יזם in vivo כדי להאריך בנוכחות של נוקלאוטיד BrUTP, טיהור RNA שכותרתו BrUTP לפי הגישה זיקה, הפוכה טרח להכין את RNA המתהווה מטוהרים הגברה cDNA באמצעות פריימרים גדיל ספציפי איגוף האמרגן ואת אזורי terminator של הגן 2.
Introduction
מחזור שעתוק איקריוטיים מורכב משלושה שלבים עיקריים; ייזום, התארכות והפסקה. סיומו של שעתוק על ידי RNA פולימראז II מורכב משני שלבים ברורים, תלויים זה בזה 3. השלב הראשון כולל מחשוף, polyadenylation ושחרור mRNA מהתבנית, והוא ומיד אחריו את השלב השני, בסימן ההתנתקות של פולימראז מהתבנית. סיום נכון הוא קריטי עבור המחזור של פולימראז במהלך חניכה / reinitiation של שעתוק, למניעת הפרעה עם השעתוק של גנים במורד זרם, ולשמירתו שעתוק סוטה לבדוק על ידי הגבלת השעתוק של מתפשט ללא קידוד RNA 4, 5. למרות ההתקדמות שחלה באחרונה, סיום הוא ללא ספק צעד הבין לפחות של מחזור שעתוק RNA פולימראז II. Assay סיום אמין חיוני ללימוד מנגנון underlyinסיום שעתוק g ידי RNA פולימראז II in vivo.
מספר גישות ניסיוניות המשמשים לאיתור פגם הסיום ב גן transcribing פעיל בתנאים פיסיולוגיים. אלה כוללים כתם הצפון, שבב גורם סיום (הכרומטין immunoprecipitation) ואת assay TRO המסורתית. כל הטכניקות האלה יש כמה יתרונות וחסרונות. את assay TRO המסורתי היה אמור להיות הגישה האמינה והרגישה ביותר לגילוי פגם סיום שעתוק vivo 1. assay זה localizes מולקולות פולימראז הפעילות יעתיק על אזורים שונים של גן בתוך התא. בתנאים רגילים, assay תערוכות מולקולות פולימראז מעורב תעתיק מופץ אך ורק בין אזור האמרגן terminator של (איור 1 א) הגן. עם הסיום פגום, לעומת זאת, פולימראז הוא לא יודע לקרוא את אות הסיוםוהוא זוהה באזור במורד הזרם של 3 'בסוף של הגן (איור 1B).
פגם סיום שעתוק מתבטא בנוכחות פולימראז חוש-בהעתקה שיזמה מאזור האמרגן-הפרוקסימלי, ולהיות מסוגל לקרוא את אות הסיום, ממשיך transcribing באזור במורד הזרם של סוף '3 של גן כפי שמוצג באיור 2A. עם ההכרה כי הגנום האיקריוטים מפגין שעתוק מתפשט המכריע במובן וכן כיוונים אנטי תחושה בתוך ומסביב גן 6, 7, 8, 9, 10, עד מהרה התברר כי assay TRO המסורתי אינו יכול לזהות אם האות פולימראז במורד הזרם של גן מייצג תעתיק ביוזמת האמרגן (איור 2 א) או RNA סוטה שיזמה סוםewhere באמצע הגן או במורד הזרם של אלמנט terminator (איור 2 ב), או בהעתקת פולימראז בכיוון אנטי תחושה מסוף '3 של הגן (איור 2 ג). את assay TRO ספציפי גדיל באמצעות BrUTP המתואר כאן ניתן להבחין אם האות פולימראז readthrough ציין מייצג mRNA במשמעות הרחבה ביוזמת האמרגן או תמליל אנטי במובן זה יזם במורד הזרם של הגן תחת בחינה. השתמשנו בהצלחה את הגישה הזאת כדי להדגים את התפקיד של קינאז Kin28 לסיום שעתוק ניצני שמרים 2. תוך שימוש בגישה כאן אנו מראים כי Rna14 נדרשת להפסקת השעתוק של ASC1 ב ניצני שמרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: שיטה זו שימשה במאמר במחקר דיווחו Medler, S ו- אנסארי, א 2.
1. Culturing ו קציר תאים
- התחל תרבות 5 מ"ל של תאים במדיום YPD (תמצית שמרים 10 גר '/ ל, 20 גר' / ל peptone, 2 דקסטרוז%) מתוך צלחת cerevisiae Saccharomyces טרי מפוספס.
- לגדל את התאים לילה ב שייקר מסלולית ב 30 ° C ו 250 סל"ד.
- לדלל את תרבות מבוגר לילה 100 פעמים לנפח סופי של 100 מ"ל במדיום YPD בבקבוק 250 מ"ל מבולבל.
הערה: סך של 100 מ"ל של התרבות נדרשת לכל תגובה TRO; אם תגובות מרובות נדרשות, נפח גדול יותר של התרבות חייב לשמש. - לגדל את תאי צפיפות אופטית של 0.8 - 1.0 ב 600 ננומטר (600 ~ 0.8 - 1.0).
- קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב 820 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C בצינור 50 מ"ל חרוטי סטרילית.
- Resuspend התאים 10 מ"ל של bu TMN קר קרחffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 מ"מ 2 MgCl, 100 מ"מ NaCl) ו דגירה על קרח למשך 5 דקות.
- צנטריפוגה ב 820 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולת התאים. בעדינות להסיר את supernatant על ידי שאיפה.
2. Permeabilizing תאי הכנות לקראת Run-על Assay
- Resuspend התאים 1 מ"ל של תמיסת 0.6% sarkosyl ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות בעזרת טיפ P 1000 קטום. מעבירים את ההשעיה לתא צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge צונן.
- לנער את התאים בעדינות על 4 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות על שייקר פלטפורמה.
הערה: צינורות Microcentrifuge צריכים להיות ארוזים לתוך צינור חרוטים 50 מיליליטר עם קרח כדי לשמור על טמפרטורה קרה, הימנעות את האפשרות של כל אירועי ייזום חדשים המתרחשים האמרגן בשלב זה. - צנטריפוגה התאים ב 1200 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגות בקירור שולחן.
- בעדינות לשאוב supernatant להסיר את הנוזלים העודפים מן לכלתא גלול meabilized.
תגובת 3. תמלול Run-על
- הוספת 150 μL של שעתוק ריצה על חיץ (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ DTT (dithiothreitol), 0.75 מ"מ כל אחד ATP, CTP, GTP, ו BrUTP, 200 U RNase מעכב) אל תא גלולה permeabilized.
- מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה באמצעות קצה P 200 קטום.
הערה: אם עיבוד דגימות מרובות, לשמור הכל על קרח עד שכל הדגימות מוכנות ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא. - דגירה במשך 5 דקות ב 30 מעלות צלזיוס באמבט מים.
הערה: כוונן את זמן הדגירה בין 1 ל 5 דקות כדי להבטיח שילוב אופטימלי של BrUTP לתוך RNA המתהווה. - עצור את התגובה על ידי הוספת 500 μL של מגיב בידוד RNA קר מוכן לשימוש. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. RNA הפקה
- הוספת 200 μL של חרוזי זכוכית חומצה שטף לתא suspensiעל (שלב 3.4), ולנער במרץ למשך 20 דקות ב 4 ° C במיקסר מערבולת.
- לנקב את החלק התחתון של הצינור microcentrifuge באמצעות מחט 22 G חם ומניחים אותו על גבי צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל.
- צנטריפוגה XG ב 300 דקות 1 ב 4 ° C כדי לאסוף את lysate התא. מעבירים את lysate לתא צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
- הוספת 500 μL של מגיב בידוד RNA קר 200 μL של כלורופורם אל lysate התא. מערבבים את התוכן על מערבל מערבולת צנטריפוגות ב 16,168 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- מעבירים את השלב מימית העליון לצינור microcentrifuge חדש.
- הוסף נפח שווה של פנול / כלורופורם קר / isoamyl אלכוהול (125: 24: 1) pH 4-5. לנער במרץ על מערבל מערבולת צנטריפוגות ב 16,168 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C..
- מעביר את RNA המכיל בשלב מהימי העליון לצינור microcentrifuge חדש. חזור על שלב 4.6 פעמים נוספות.
- אל השלב מהימי הסופי המכיל RNA, להוסיף 5 M NaCl stock כדי לקבל ריכוז סופי של 0.3 מ 'להוסיף 3 פעמים את הנפח של אתנול קר לזרז את הרנ"א.
- דגירה של 1 ש 'או לילה ב -20 ° C.
הערה: בצע את שלבי 4.9 - 4.11 בעוד החרוזים אנטי BrdU שמתבצעים וטופחו לחסימה (ראה שלב 5.3).
- דגירה של 1 ש 'או לילה ב -20 ° C.
- צנטריפוגה ב 16,168 XG במשך 20 דקות ב 4 °. הסר את supernatant ו resuspend גלולה רנ"א 100 μL של מים DEPC (diethylpyrocarbonate).
- השתמש ערכת מיני בידוד RNA להפריד בין RNA מן נוקלאוטידים BrUTP מאוגדים. Elute רנ"א מהעמודה עם 100 μL של מים RNase חינם.
- דגירה RNA באמבט מים C ° 65 במשך 5 דקות ולאחר מכן להעביר קרח דק 2 לפחות.
טיהור זיקה 5. RNA BrUTP שכותרתו
- כדי 25 μL של אנטי BrdU התיישבו חרוזים, להוסיף 500 μL של 0.25x SSPE (נתרן מלוחים פוספט EDTA) במאגר מחייב (20x SSPE: 3 M NaCl, 0.2 M לאא 2 PO 4
- חזור על שלב 5.1 שלוש פעמים.
- הוספת 500 μL של חיץ חסימת (1x חיץ מחייב, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 1 מ"ג אלבומין אולטרה-טהור שור (BSA)) על חרוזים ולנער בעדינות במשך 1 - 2 שעות ב 4 ° C על שייקר פלטפורמה.
- שטפו את החרוזים פעמיים נוספות עם 500 μL של חיץ מחייב, כפי שמתואר בשלב 5.1.
- להוסיף 400 μL של חיץ מחייב את החרוזים.
- העברת 100 μL של RNA (משלב 4.11) ישירות חרוזים. דגירה עם רעד עדין במשך 1 - 2 שעות ב 4 ° C על שייקר פלטפורמה.
- שטוף את ברצף החרוזים עם 500 μL של חיץ מחייב, 500 μL של חיץ מלח נמוך (SSPE 0.2X, 1 mM EDTA, 0.05% Tween), 500 μL של חיץ מלח גבוה (0.25x SSPE, 1 mM EDTA, 0.05% Tween, 100 מ"מ NaCl), ופעמיים עם 500 μL של חיץ TET (1x TE, 0.05% Tween), מסתובב בביתXG 200 למשך 30 שניות ב 4 מעלות צלזיוס בין כל שטיפה.
- Elute רנ"א BrUTP שכותרתו אמנות עשויים חרוזים ברצף, פעמיים עם 150 μl ופעם עם 200 μl של חיץ elution (20 מ"מ DTT, 150 מ"מ NaCl, 50 mM Tris-HCl 7.5 pH, 1 mM EDTA, 0.1% SDS), על ידי דוגרים עבור 4 דקות ב 42 מעלות צלזיוס באמבט מים ואחריו סיבוב קצר להפריד חרוזים מן supernatant.
רטיבות 6. RNA שכותרתו BrUTP
- הוספת 500 μL של פנול / כלורופורם קר / isoamyl אלכוהול (125: 24: 1) pH 4 - 5 עד הזיקה המטוהרת BrUTP שכותרתו RNA. מערבבים על מערבל מערבולת צנטריפוגות ב 16,168 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.
- מעבירים את השלב מימית העליון לצינור microcentrifuge חדש.
- הוסף 5 מניות M NaCl כדי לקבל ריכוז סופי של פעמים 0.3 M ו -3 היקף אתנול קר לזרז את הרנ"א.
- לדגור לילה -20 מעלות צלזיוס.
- אסוף את הרנ"א זירז ידי צנטריפוגה ב 16,168 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C. </ Li>
- הסר את supernatant ולאפשר גלולה לייבוש באוויר במשך 10 דקות.
- Resuspend גלולה רנ"א 26 μL של מים DEPC.
- קבע את ריכוז RNA הסופי על ידי מדידת הספיגה ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. כמו כן, קבע את היחס 260/280. יחס ~ 2 מעיד על מדגם RNA טהור.
- אחסן את דגימות רנ"א aliquots ב -80 ° C עד הצורך לסינתזה cDNA.
7. שעתוק לאחור של רנ"א שכותרתו BrUTP
- התאם את הריכוז RNA ל 100 ng / μL באמצעות מים DEPC. השתמש 0.5 מיקרוגרם של רנ"א עבור כל תגובה סינתזה cDNA.
הערה: ריכוז תבנית RNA עשוי לנוע בין 0.5 ל 1.0 מיקרוגרם להשיג סינתזת cDNA אופטימלית. - הפוך לתמלל את RNA באמצעות פריימרים הפוכים מרובים שנועדו במורד זרם של (אתר הסיום) פולי (א) אתר כפי שמוצג באיור 3 א.
- לתגובה כל שעתוק לאחור, להוסיף 5 μl RNA templatדואר (0.5 מיקרוגרם), 1 μL תמהיל dNTP (10 מ"מ כל אחד), 2 μL של C פריימר הפוכה, D, E, F או G (50 מיקרומטר אחד) (ראה איור 3 א) ומים חינם nuclease. היקף התגובה האחרון בצינור אחד הוא 13 μL.
הערה: מספר התגובות שעתוק לאחור יהיה תלוי במספר פריימרים הפוך המשמש לסינתזת cDNA. לדוגמא, עבור ASC1 חמישה פריימרים הפוכים שמשו ולכן חמש תגובות שעתוק לאחור הוקמו. לייבל הצינורות כמו C, D, E, F ו- G על בסיס של פריימר הפוכה המשמש לסינתזת cDNA. - דגירת הצינורות המכילים תבנית RNA, תמהיל dNTP ו פריימרים ב thermocycler על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להסיר כל קונפורמציה מבני משני, ולאחר מכן לצנן עד 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות לפחות.
- הוסף 1 μL הפוכה transcriptase (200 U / μL), 4 μL חיץ 2 μL של 0.1 M DTT צינור אחד המכיל את תבנית רנ"א פריימר (שלב 7.4). מערבבים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
- בצע שעתוק לאחור על ידי דוגר את תערובת התגובה ב thermocycler על 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- להשבית transcriptase הפוכה על 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- אחסן את cDNA ב -20 ° C או להמשיך לשלב הבא.
הגברת 8. של cDNA
- בצע את תגובת PCR עבור הגברה של כל הכנה cDNA (שכותרתו C, D, E, F ו- G עבור ASC1) משלב 7.8 כדלקמן: 3.0 תבנית cDNA μL משלב 7.8, 1.0 B פריימר קדימה μL (10 מיקרומטר), 1.0 מיקרוליטר C פריימר הפוכה או D או E או F או G (10 מיקרומטר), 2.5 μL 10x פולימראז חיץ PCR, 0.5 μL תמהיל dNTP (10 מ"מ כל אחד), 1.0 מיקרוליטר MgCl 2 (2.5 מ"מ), 15.5 מים כיתה μL PCR, ו -0.5 אנזים פולימראז thermostable μL.
הערה: דילולים שונים של תבנית cDNA הנעה בין 1: 5 ל -1: 100 צריכים להיבדק כדי לייעל את תשואת מוצר PCR. פריימר קדימה יחיד האמרגן-הפרוקסימלי ישמש כדי להגביר cDNAשהושג באמצעות פריימרים הפוך שונה. לדוגמא, ב פריימר קדימה יחיד הממוקם ליד האמרגן שמש בשילוב עם חמישה פריימרים הפוכים מ C ל G טוב ASC1. BC, BD, BE, BF ו BG שימשו צינורות שכותרתו כמו C, D, E, F ו- G בהתאמה כמוצג באיור 3 א. - הפעל את ה- PCR באמצעות פרמטרי רכיבת התרמית הבאות: 1 מחזור 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות (להתחיל חם עבור הפעלה של פולימראז), 30 - 40 מחזורים 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (denaturation), 54 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות (חישול) , 68 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 (הארכה), מחזור 1 68 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (הארכה הסופית).
הערה: טמפרטורת החישול תשתנה בהתאם פריימרים הספציפיים בשימוש והזמן הרחב ישתנה בהתאם לגודל התוצר הצפוי. - הפרד את מוצר ה- PCR על ידי אלקטרופורזה על 0.8%, 1.5%, או 2 ג'לים agarose% בהתאם לגודל הצפוי של המוצר.
- לכמת את מוצר ה- PCR, כמתואר El Kaderi et al. , 2012 11.
הערה: לחילופין, להשתמש בזמן אמת אסטרטגיה RT-qPCR כדי לכמת את כמות תמלילי המתהווה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את תחולת הנוהל TRO BrUTP גדיל ספציפי באיתור מום סיום שעתוק, השתמשנו מוטציה סיום-פגום, רגיש בטמפרטורה של RNA14 שנקרא rna14-1. תפקידו של Rna14 לסיום שעתוק על ידי RNA פולימראז II הודגם באמצעות assay TRO המסורתי שמזוהה RNA באזור terminator-הפרוקסימלי של גנים נבחרים 1. הגילוי של אותות RNA מעבר לאזור terminator של מוטצית rna14-1 בטמפרטורת אוֹסְרָנִי נתפרש פגם הסיום. האות ציינה, עם זאת, הייתה להקצותם פולימראז בהעתקת pervasively שיזם תעתיק מ איפשהו לקראת סוף '3 של הגן כפי שמוצג באיור 2B. כדי להדגים את התפקיד באופן חד משמעי של Rna14 לסיום, בצענו TRO BrUTP גדיל-ספציפי rna14-1מוטציה ואת מתח סוג בר isogenic על 37 מעלות צלזיוס. ציפינו כי בזן עכברי הסוג הבר, אות TRO תוגבל בין אזורי אמרגן terminator כפי שמוצגת באיור 1 א. ב מוטצית rna14-1, לעומת זאת, פולימראז ייקרא דרך אות הסיום ואת אות TRO תזוהה מעבר סוף '3 של הגן כפי שמוצגת באיור 1B ו 2A.
בקצרה, גדלנו את מוטצית rna14-1 ותאי סוג בר isogenic שלה ב -25 ° C עד שלב יומן באמצע ולאחר מכן העברנו תאים ל -37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. ריצה על assay תמלול בוצעה לשלב BrUTP לרנ"א המתהווה מסונתז על ידי RNA פולימראז transcribing פעיל כמתואר לעיל. BrUTP שכותרתו RNA היה מטוהר הפוך עבד באמצעות פריימרים C, D, E, F, G ו- המוצג באיור 3 א. את cDNA המקביל PCR היה מוגבר usi פריימר ng זוגות לפני הספירה, BD, BE, BF, ו BG ו מופרדים על ג'ל agarose (איור 3). כימות של ג'לים מוצגת באיור 3C. הנוכחות של מוצרי הגברה PCR מן זוגות פריימר BE, BF, ו BG של מוטציה rna14-1 משקף סיום לקרוא פנוטיפ (איור 3B, ליין 11 - 13; ואיור 3C, אזורים E, F ו- G). בתאי הסוג הברים, עם זאת, את אות TRO הוגבלה עד אלמנט terminator (איור 3B, Lanes 2 ו -3; והאיור 3C, אזורי C ו- D). לא היה שום אות TRO לזיהוי מעבר לאזור terminator (איור 3B, ליין 4 - 6; ואיור 3C, אזורים E, F ו- G). לפיכך, אנו יכולים לזהות את התמלילים המתהווים ביוזמת היזמת לקרוא את אות הסיום של המוטציה אך לא בתאי הסוג הברים, ובכך המאשרים כי Rna14 מהווה גורם סיום.
לשמור-together.within-page = "1"> 
איור 1: תמלול Run-על (TRO) Assay מזהה נוכחות של תעתיק Active RNA פולימראז באזורי הארץ השונים של ג'ין. (א) כאשר סיום נורמלי, אין אות פולימראז מעבר לאזור terminator. (ב) עם הסיום פגום, פולימראז הוא לא יודע לקרוא את אות הסיום ויכול להתגלות מעבר סוף '3 של הגן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: Strand ספציפי Assay TRO. את assay TRO ספציפי הגדיל יכול לזהות אם הנוכחות של פולימראז תעתיק הפעיל מעבר סוף '3 של tהגן הוא פגם סיום אמיתי בשל פולימראז אמרגן ביוזמת שקרא את אות הסיום (א), או זה פשוט בהעתקת פולימראז transcribing pervasively בכיוון תחושה (B), או שזה פולימראז transcribing ncRNA התחושה אנטי ייזום מסוף 3 '(C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: Rna14 הוא פקטור סיומת כמו פולימראז קורא דרך איתותי הסיומת של מוטצית rna14-1. (א) תיאור סכמטי של גן ASC1 המראה את המיקום של B פריימר קדימה וחמישה פריימרים הפוכים, C, D, E, F, ו- G המשמש לסינתזת cDNA של RNA מטוהר BrUTP שכותרתו. (B) cDNA עשוי C פריימרים ההפוך, D, E, F ו- G היה PCR מוגבר באמצעות הזוגות פריימרים לפנה"ס, BD, BE, BF ו BG בהתאמה. (ג) ניתוח כמותי של נתוני TRO שמוצגים (ב ') לעיל סוג בר ותא rna14-1 על 37 מעלות צלזיוס. S 5 RNA שימש כביקורת נורמליזציה. ברי השגיאה מייצגים יחידה אחת מלאה של סטיית התקן בהתבסס על מינימום של שלושה ניסויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול TRO ספציפי הגדיל משמש כאן הותאם מן הפרוטוקול המשמש GRO-Seq (Global לרוץ על-רצף) ניתוח בתאי יונקים 12. אנחנו בהצלחה שונה בפרוטוקול ללמוד שעתוק המתהווה ב ניצני שמרים. כדי לנתח את פגם סיום שעתוק במיוחד, מתאמנים את הפרוטוקול נוסף על ידי להיפטר צעד הידרוליזה RNA. זה מאפשר לנו לזהות את התמלילים המתהווים באורך מלא במיוחד שיזמה מאתר תחילת השעתוק ליד אזור האמרגן.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול כי צריכה להתבצע בזהירות רבה כדי לקבל תוצאות משמעותיות. ראשית, פרוטוקול חייב להתבצע עם תאי שמרים גדל באופן אקספוננציאלי. התאים בשלב היומן (600 ~ 0.8 - 1.0) לתת את התוצאות הטובות ביותר כמו רוב התאים בשלב זה הם ומתרחבים ולהציג שעתוק חזק. בידוד שנית, RNA stEP צריך להתבצע במהירות האפשרית בטמפרטורה בין 2 - 4 מעלות צלזיוס. שלישית, לפני טיהור הזיקה של Br-UMP שכותרתו RNA, מאוגדים BrUTP להסירו מן ההכנה RNA. השתמשנו ערכת RNA להיפטר BrUTP מן הכנת RNA המטוהרת. רביעית, השימוש של transcriptase ההפוכה חזקה הוא קריטי עבור הישג מוצלח של הפרוטוקול.
פרוטוקול TRO ספציפי הגדיל בשימוש יש כאן יתרונות על פני טכניקת הכתם הצפון באיתור פגם הסיום כפי שהוא רגיש יותר, מהר יותר ותערוכות ברזולוציה גבוהה יותר. פרוטוקול זה הוא גם טוב יותר מאשר פרוטוקול TRO המסורתי כפי שהוא יכול להבחין תמלילי התחושה מן התמלילים אנטי תחושה ואם התוצאה הנצפית נובעת אמרגן ביוזמת שעתוק או שעתוק סוטה החל מאזור במורד אמרגן. פרוטוקול TRO ספציפי הגדיל יש מספר מגבלות. זה יותר מייגע זמן רב יותר מאשר רחוב יציבאכלו שיטות לזיהוי mRNA. זה דורש מספר רב של תאים. לכן, הניתוח של שעתוק של גנים בהעתקה נמוכים עלול להיות בעיה.
השתמשנו בהצלחה בטכניקה זו כדי ללמוד את פגם הסיום במחזור שעתוק RNA פולימראז II ב ניצני שמרים 2. הגישה ניתן להאריך ללמוד סיום שעתוק על ידי RNA פולימראז I ו- RNA פולימראז III בשמרים גם כן. עם שינויים מתאימים, הגישה יכולה להיות מיושמת גם ללמוד את פגם סיום שעתוק אאוקריוטים גבוה. בסך הכל, את הטכניקה היא זולה יחסית, מאוד לשחזור ודורשת ציוד סטנדרטי המשמש במעבדה לביולוגיה מולקולרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
References
- Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
- Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription. Sci Rep. 5, 12586 (2015).
- Richard, P., Manley, J. L. Transcription termination by nuclear RNA polymerases. Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).
- Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).
- Porrua, O., Libri, D. Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).
- Jacquier, A. The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs. Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).
- Xu, Z., et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).
- Neil, H., et al. Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).
- Clark, M. B., et al.
- Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast. Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).
- El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C). Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
