Abstract
توضح هذه المخطوطة بروتوكول للكشف عن النسخ إنهاء الخلل في الجسم الحي. بروتوكول TRO-حبلا محددة صفها باستخدام BrUTP هنا هو المنهج التجريبي قوية لتحليل عيب إنهاء النسخ في ظل الظروف الفسيولوجية. مثل فحص TRO التقليدي، فإنه يعتمد على وجود البلمرة نشط transcriptionally وراء نهاية 3 'من الجينات كمؤشر من النسخ إنهاء عيب 1. فإنه يتغلب على مشكلتين رئيسيتين واجهتها مع مقايسة TRO التقليدي. أولا، فإنه يمكن الكشف إذا كان البلمرة القراءة من خلال إشارة الإنهاء هو الذي بادر النسخ من منطقة المروج القريبة، أو إذا كان ببساطة يمثل البلمرة الكتابة انتشارا التي بدأت غير تحديدا من مكان ما في الجسم أو "3 نهاية هذا الجين. ثانيا، يمكن أن نميز إذا كانت إشارة البلمرة النشطة transcriptionally خارجالمنطقة فاصل هي حقا readthrough البلمرة الشعور مرنا الكتابة أو مكافحة الشعور إشارة غير الترميز الحمض النووي الريبي بدأ فاصل. لفترة وجيزة، ويشمل البروتوكول permeabilizing خلايا الخميرة تنمو باطراد، مما يتيح للنصوص التي بدأت في الجسم الحي لإطالة بحضور النوكليوتيدات BrUTP، وتنقية RNA المسمى BrUTP من قبل نهج تقارب، عكس الكتابة الحمض النووي الريبي الوليدة النقي وتضخيم [كدنا باستخدام الاشعال حبلا محددة المرافقة المروج والمناطق فاصل من الجين 2.
Introduction
تتكون دورة النسخ حقيقية النواة من ثلاث خطوات رئيسية. بدء، واستطالة وإنهاء الخدمة. إنهاء النسخ التي كتبها RNA البلمرة الثاني يتكون من اثنين متميزة، خطوات مترابطة 3. تتضمن الخطوة الأولى الانقسام، تذييل بعديد الأدينيلات وإطلاق مرنا من القالب، ويليه مباشرة الخطوة الثانية، التي تميزت فك الارتباط من البلمرة من القالب. إنهاء السليم هو أمر حاسم لإعادة التدوير من خلال البلمرة بدء / باستعادة النسخ، لمنع التدخل في النسخ من الجينات المصب، وحفظ النسخ الشاذة في الاختيار عن طريق الحد من النسخ من انتشارا غير الترميز الحمض النووي الريبي 4 و 5. وعلى الرغم من التطورات الحديثة، وإنهاء هو إلى حد بعيد أقل خطوة يفهم من دورة النسخ RNA البلمرة الثاني. إنهاء الخدمة فحص موثوق ضروري لدراسة آلية underlyinز إنهاء النسخ التي كتبها RNA البلمرة الثاني في الجسم الحي.
ويستخدم عدد من المناهج التجريبية للكشف عن الخلل إنهاء في الجينات الاختزال بنشاط في ظل الظروف الفسيولوجية. وتشمل هذه وصمة عار الشمالية، عامل إنهاء رقاقة (لونين مناعي) وفحص TRO التقليدي. كل من هذه التقنيات لديها بعض المزايا والعيوب. فحص TRO التقليدية المستخدمة ليكون النهج الأكثر موثوقية وحساسة للكشف عن وجود خلل إنهاء النسخ في الجسم الحي 1. هذا الاختبار يموضع الجزيئات النشطة البلمرة transcriptionally على مناطق مختلفة من الجينات داخل الخلية. في ظل ظروف طبيعية، ويظهر فحص الجزيئات البلمرة المتفاعلة transcriptionally موزعة بدقة بين المروج وفاصل المنطقة من الجين (الشكل 1A). عند انتهاء معيب، ومع ذلك، فإن البلمرة غير قادر على قراءة إشارة الإنهاءويتم الكشف في منطقة المصب من 'نهاية 3 من الجين (الشكل 1B).
ويتجلى عيب إنهاء النسخ في وجود البلمرة إحساس-الاختزال التي بدأت من منطقة المروج القريبة، وعدم القدرة على قراءة إشارة الإنهاء، تواصل الكتابة في منطقة المصب من نهاية 3 'من الجينات كما هو مبين في الشكل 2A. مع إدراك أن جينوم وحيد الخلية المعارض النسخ انتشارا هائلا في المعنى وكذلك الاتجاهات المضادة للمعنى في وحول الجينات 6، 7، 8، 9، 10، وسرعان ما أصبح واضحا أن TRO الفحص التقليدي لا يمكن الكشف عن إذا كانت إشارة البلمرة المصب من الجين يمثل نسخة بمبادرة المروج (الشكل 2A) أو الحمض النووي الريبي الشاذة التي بدأت سومewhere في منتصف هذا الجين أو المصب من عنصر فاصل (الشكل 2B)، أو الاختزال البلمرة في اتجاه مضاد للإحساس من نهاية 3 'من الجين (الشكل 2C). فحص TRO-حبلا محددة صفها باستخدام BrUTP هنا يمكن التمييز إذا تمثل إشارة البلمرة readthrough ملاحظ بدأت المروج الشعور الموسعة مرنا أو مستخرج مكافحة بمعنى أن بدأت المصب من الجينات قيد البحث والدراسة. وقد استخدمنا بنجاح هذا النهج للتدليل على دور كيناز Kin28 في إنهاء النسخ في مهدها الخميرة 2. إستخدام أسلوب هنا تبين لنا أن Rna14 هو مطلوب لإنهاء النسخ من ASC1 في مهدها الخميرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: وقد استخدم هذا الأسلوب في المادة دراسة نشرت في Medler، S والأنصاري، A. 2.
1. التثقيف وحصاد الخلايا
- بدء ثقافة 5 مل من الخلايا في YPD المتوسطة (10 جم / لتر خلاصة الخميرة، 20 جرام / لتر ببتون، 2٪ سكر العنب) من خميرة الخباز لوحة يشوبه طازجة.
- تنمو الخلايا بين عشية وضحاها في شاكر المداري في 30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة.
- تمييع ثقافة نمت بين عشية وضحاها 100 مرات الحجم النهائي من 100 مل في YPD المتوسطة في قارورة حيرة 250 مل.
ملاحظة: هناك حاجة إلى ما مجموعه 100 مل من ثقافة في رد الفعل TRO. إذا كانت هناك حاجة ردود فعل متعددة، يجب استخدام حجم أكبر من الثقافة. - تنمو الخلايا إلى الكثافة البصرية من 0،8-1،0 في 600 نانومتر (A 600 ~ 0،8-1،0).
- حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 820 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في العقيمة أنبوب 50 مل المخروطية.
- resuspend الخلايا في 10 مل من الجليد الباردة بو TMNffer (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 5 ملي MgCl 2، 100 مم كلوريد الصوديوم)، واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
- أجهزة الطرد المركزي في 820 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لتكوير الخلايا. إزالة بلطف طاف بواسطة الطموح.
2. Permeabilizing وخلايا الاستعداد للتشغيل على الفحص
- Resuspend الخلايا في 1 مل من 0.6٪ محلول sarkosyl pipetting صعودا وهبوطا بلطف باستخدام اقتطاع P 1000 رأس. نقل تعليق خلية إلى المبرد أنبوب 1.5 مل microcentrifuge.
- يهز الخلايا بلطف عند 4 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة على شاكر منصة.
يجب أن تكون معبأة أنابيب microcentrifuge في أنبوب مخروطي 50 مل مع الثلج للحفاظ على درجة حرارة باردة، وتجنب احتمال وقوع أي أحداث الشروع الجديدة التي تحدث في المروج في هذه المرحلة: ملاحظة. - الطرد المركزي الخلايا في 1200 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية باستخدام الطاولة المبردة الطرد المركزي.
- نضح بلطف وطاف لإزالة أي السائل الزائد من نصيببيليه خلية meabilized.
رد الفعل 3. النسخ على تشغيل
- إضافة 150 ميكرولتر من النسخ التشغيل على العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، و 100 ملي بوكل، 10 ملي MgCl 2، 2 ملي DTT (dithiothreitol)، 0.75 ملي كل من ATP، CTP، GTP، وBrUTP، 200 U ريبونوكلياز المانع) إلى بيليه الخلية permeabilized.
- المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا باستخدام اقتطاع P 200 رأس.
ملاحظة: إذا تجهيز عينات متعددة، والحفاظ على كل شيء على الجليد حتى جميع العينات جاهزة ومن ثم انتقل إلى الخطوة التالية. - احتضان لمدة 5 دقائق عند 30 درجة مئوية في حمام مائي.
ملاحظة: ضبط الوقت من الحضانة بين 1-5 دقيقة لضمان الدمج الأمثل للBrUTP في الحمض النووي الريبي الوليدة. - وقف رد الفعل من خلال إضافة 500 ميكرولتر من البرد RNA العزلة كاشف جاهزة للاستخدام. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. استخراج الحمض النووي الريبي
- إضافة 200 ميكرولتر من الخرز الزجاجي حمض غسلها لأنظمة التعليق الخليةعلى (الخطوة 3.4)، ويهز بقوة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في خلاط دوامة.
- ثقب أسفل أنبوب microcentrifuge باستخدام الساخنة 22 G الإبرة ووضعه على رأس أنبوب مخروطي العقيمة 15 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية لجمع المحللة الخلية. نقل الخلايا المحللة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- إضافة 500 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي البارد العزلة الكاشف و 200 ميكرولتر من كلوروفورم إلى الخلايا المحللة. خلط محتويات على خلاط دوامة والطرد المركزي في 16168 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- نقل المرحلة المائية العليا لأنبوب microcentrifuge جديد.
- إضافة حجم مساو من البرد الفينول / الكلوروفورم / كحول أيزو أميلي (125: 24: 1) درجة الحموضة 4-5. هزة بقوة على خلاط دوامة والطرد المركزي في 16168 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- نقل مائي المرحلة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي العلوي لأنبوب microcentrifuge جديد. كرر الخطوة 4.6 مرتين أخريين.
- إلى المرحلة المائية النهائية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي، إضافة 5 M كلوريد الصوديوم جواربك للحصول على التركيز النهائي من 0.3 م أضف 3 أضعاف حجم الايثانول البارد لترسيب الحمض النووي الريبي.
- احتضان لمدة 1 ساعة أو بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: تنفيذ الخطوات 4،9-4،11 بينما يجري المحتضنة الخرز مكافحة BrdU لمنع (راجع الخطوة 5.3).
- احتضان لمدة 1 ساعة أو بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي في 16168 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه الحمض النووي الريبي في 100 ميكرولتر من DEPC (diethylpyrocarbonate) المياه.
- استخدام الحمض النووي الريبي عدة العزلة مصغرة لفصل الحمض النووي الريبي من النيوكليوتيدات BrUTP الفردية. أزل الحمض النووي الريبي من العمود مع 100 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه.
- احتضان الحمض النووي الريبي في 65 ° C حمام الماء لمدة 5 دقائق، ثم نقل إلى الجليد لمدة 2 دقيقة على الأقل.
5. الانجذاب تنقية من الحمض النووي الريبي وصفت BrUTP-
- إلى 25 ميكرولتر من مكافحة BrdU استقر الخرز، وإضافة 500 ميكرولتر من 0.25X SSPE (الصوديوم المالحة الفوسفات EDTA) العازلة ملزمة (20x وSSPE: 3 M كلوريد الصوديوم، 0.2 M ناه 2 ص 4
- كرر الخطوة 5.1 ثلاث مرات.
- إضافة 500 ميكرولتر من عرقلة العازلة (1X العازلة ملزمة، 0.1٪ بوفيدون، 1 ملغ نقي للغاية المصل البقري الزلال (BSA)) إلى الخرز ويهز بلطف لمدة 1-2 ساعة عند 4 درجات مئوية على شاكر منصة.
- تغسل حبات مرتين أكثر مع 500 ميكرولتر من العازلة ملزمة، كما هو موضح في الخطوة 5.1.
- إضافة 400 ميكرولتر من العازلة ملزمة لحبات.
- نقل 100 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (من الخطوة 4.11) مباشرة إلى الخرز. احتضان مع طيف تهتز ل1 - 2 ساعة عند 4 درجات مئوية على شاكر منصة.
- غسل بالتتابع حبات مع 500 ميكرولتر من العازلة ملزمة، 500 ميكرولتر من العازلة قليل الملح (0.2x SSPE، 1 ملم EDTA، 0.05٪ توين)، 500 ميكرولتر من العازلة الملح العالية (0.25X SSPE، 1 ملم EDTA، 0.05٪ توين، 100 مم كلوريد الصوديوم)، ومرتين مع 500 ميكرولتر من العازلة TET (1X TE، 0.05٪ توين)، والغزل في200 x ج لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية في ما بين كل غسل.
- أزل الحمض النووي الريبي وصفت BrUTP-من الخرز بالتتابع، مرتين مع 150 ميكرولتر ومرة واحدة مع 200 ميكرولتر من شطف العازلة (20 ملي DTT و 150 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 1 ملم EDTA، 0.1٪ SDS)، التي يحتضنها لمدة 4 دقائق في درجة حرارة 42 درجة مئوية في حمام مائي تليها تدور قصيرة لفصل حبات من طاف.
6. إن الأمطار من الحمض النووي الريبي BrUTP إعتبر
- إضافة 500 ميكرولتر من البرد الفينول / الكلوروفورم / كحول أيزو أميلي (125: 24: 1) درجة الحموضة 4-5 لتقارب تنقية BrUTP المسمى الحمض النووي الريبي. خلط في خلاط دوامة والطرد المركزي في 16168 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- نقل المرحلة المائية العليا لأنبوب microcentrifuge جديد.
- إضافة 5 الاسهم M كلوريد الصوديوم للحصول على التركيز النهائي من 0.3 M و 3 أضعاف حجم الايثانول البارد لترسيب الحمض النووي الريبي.
- احتضان عند -20 درجة مئوية خلال الليل.
- جمع الحمض النووي الريبي عجل بواسطة الطرد المركزي عند 16،168 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. </ لى>
- إزالة طاف والسماح للبيليه الهواء الجاف لمدة 10 دقيقة.
- Resuspend بيليه في الحمض النووي الريبي في 26 ميكرولتر من المياه DEPC.
- تحديد تركيز الحمض النووي الريبي النهائي عن طريق قياس الامتصاصية في 260 نانومتر باستخدام مطياف. أيضا، تحديد نسبة 260/280. وهناك نسبة 2 ~ يدل على عينة الحمض النووي الريبي نقية.
- تخزين عينات الحمض النووي الريبي في aliquots في -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها لتخليق [كدنا].
7. النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي وصفت BrUTP-
- ضبط تركيز الحمض النووي الريبي إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام المياه DEPC. استخدام 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لكل رد فعل التوليف [كدنا].
ملاحظة: إن تركيز قالب الحمض النووي الريبي قد تختلف 0،5-1،0 ميكروغرام لتحقيق التوليف [كدنا الأمثل. - عكس نسخ الحمض النووي الريبي متعددة باستخدام بادئات عكس تصميم المصب من بولي (A) الموقع (site إنهاء) كما هو مبين في الشكل 3A.
- إلى كل رد فعل النسخ العكسي، إضافة 5 ميكرولتر أي نماذج RNAه (0.5 ميكروغرام)، 1 ميكرولتر مزيج dNTP (10 ملم لكل منهما)، 2 ميكرولتر من العكسي التمهيدي C، D، E، F أو G (50 ميكرومتر لكل منهما) (انظر الشكل 3A) والمياه مجانا nuclease. حجم رد الفعل النهائي في كل أنبوب 13 ميكرولتر.
ملاحظة: إن عدد من ردود الفعل النسخ العكسي تعتمد على عدد من الاشعال عكس تستخدم لتخليق [كدنا]. على سبيل المثال، لASC1 استخدمت خمسة بادئات العكسي وبالتالي تم تعيين خمسة ردود الفعل النسخ العكسي يصل. تسمية أنابيب كما C، D، E، F و G على أساس التمهيدي العكسي تستخدم لتخليق [كدنا]. - احتضان الأنابيب التي تحتوي على قالب الحمض النووي الريبي، مزيج dNTP والاشعال في thermocycler عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإزالة أي التشكل الهيكلي الثانوي، ثم تبرد إلى 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة على الأقل.
- إضافة 1 ميكرولتر عكس الناسخ (200 U / ميكرولتر)، 4 ميكرولتر العازلة و 2 ميكرولتر من 0.1 M DTT إلى كل أنبوب يحتوي القالب RNA والتمهيدي (خطوة 7.4). مزيج من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
- أداء النسخ العكسي التي يحتضنها مزيج رد فعل في thermocycler في 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- إبطال نشاط الناسخ العكسي عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- تخزين كدنا] في -20 درجة مئوية أو انتقل إلى الخطوة التالية.
8. التضخيم من [كدنا
- نفذ تفاعل PCR لتضخيم كل إعداد كدنا] (المسمى C، D، E، F و G لASC1) من الخطوة 7.8 على النحو التالي: قالب 3.0 ميكرولتر [كدنا من الخطوة 7.8، 1.0 ميكرولتر التمهيدي إلى الأمام ب (10 ميكرون)، 1.0 ميكرولتر عكس التمهيدي C أو عازلة PCR 10X البلمرة D أو E أو F أو G (10 ميكرون)، 2.5 ميكرولتر، مزيج dNTP 0.5 ميكرولتر (10 ملم لكل منهما)، 1.0 ميكرولتر MgCl 2 (2.5 ملم)، و 15.5 ميكرولتر PCR المياه الصف، و 0.5 ميكرولتر بوليميريز بالحرارة الانزيم.
ملاحظة: التخفيفات مختلفة من قالب [كدنا تتراوح بين 1: 5-1: 100 وينبغي اختبار لتحسين المحصول المنتج PCR. وسيتم استخدام التمهيدي إلى الأمام واحد المروج الأقرب إلى تضخيم [كدناتم الحصول عليها باستخدام بادئات عكس مختلفة. على سبيل المثال، تم استخدام واحد إلى الأمام التمهيدي ب تقع بالقرب من المروج في تركيبة مع خمسة الاشعال عكس من C إلى G لASC1. قبل الميلاد، دينار بحريني، BE، استخدمت BF وBG في أنابيب وصفت بأنها C، D، E، F و G على التوالي كما هو مبين في الشكل 3A. - تشغيل PCR باستخدام المعلمات الدراجات الحرارية التالية: 1 دورة 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (بداية ساخنة لتفعيل البلمرة)، 30 - 40 دورات 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (تمسخ)، 54 درجة مئوية لمدة 15 ثانية (الصلب) ، 68 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (التمديد)، و 1 دورة 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (تمديد النهائي).
ملاحظة: درجة الحرارة الصلب تختلف تبعا لالاشعال محددة تستخدم وتمديد الوقت سوف تختلف تبعا لحجم المنتج المتوقع. - فصل المنتج PCR بواسطة الكهربائي عن 0.8٪، 1.5٪، أو 2 المواد الهلامية٪ الاغاروز اعتمادا على الحجم المتوقع للمنتج.
- تحديد المنتج PCR كما هو موضح في El القادري وآخرون. ، 2012 11.
ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم في الوقت الحقيقي استراتيجية RT-QPCR لقياس كمية من النصوص الوليدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للتدليل على تطبيق الإجراء TRO BrUTP حبلا محددة في الكشف عن وجود خلل إنهاء النسخ، استخدمنا، حساسة للحرارة متحولة الإنهاء عيب من RNA14 دعا rna14-1. وقد تجلى دور Rna14 في إنهاء النسخ التي كتبها RNA البلمرة الثاني باستخدام فحص TRO التقليدي الذي الكشف عن الحمض النووي الريبي في المنطقة فاصل القريب من جينات منتقاة 1. ويفسر الكشف عن إشارة RNA خارج المنطقة فاصل في متحولة rna14-1 في درجة الحرارة غير متساهلة كما الخلل الإنهاء. في إشارة لوحظ، ومع ذلك، يمكن أن يعزى إلى البلمرة الاختزال انتشارا التي بدأت النسخ من مكان ما قرب نهاية 3 'من الجين كما هو مبين في الشكل 2B. لتثبت بشكل قاطع دور Rna14 في الإنهاء، أجرينا TRO BrUTP حبلا محددة في rna14-1متحولة وإسوي البرية نوع السلالة عند 37 درجة مئوية. كنا نتوقع أنه في نوع السلالة البرية، سوف تكون مقيدة في إشارة TRO بين مناطق المروج وفاصل كما هو مبين في الشكل 1A. في متحولة rna14-1، ومع ذلك، فإن البلمرة قراءة من خلال الإشارة الحمل وسوف يتم الكشف عن إشارة TRO وراء نهاية 3 'من الجين كما هو مبين في الشكل 1B و 2A.
لفترة وجيزة، ونحن نمت متحولة rna14-1 وإسوي خلاياه نوع البرية عند 25 درجة مئوية إلى مرحلة منتصف السجل ومن ثم تحول الخلايا إلى 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. على المدى فحص أجري النسخ لدمج BrUTP إلى رنا الوليد توليفها من قبل البلمرة RNA الاختزال بنشاط كما هو موضح أعلاه. وصفت BrUTP كان RNA النقي وعكس كتب باستخدام بادئات C، D، E، F، G و هو مبين في الشكل 3A. [كدنا] المقابلة كان PCR تضخيم باليود نانوغرام التمهيدي أزواج قبل الميلاد، دينار بحريني، BE، BF، وحرس الحدود ومجزأة على المواد الهلامية الاغاروز (الشكل 3B). ويرد الكمي من المواد الهلامية في الشكل 3C. وجود منتجات PCR تضخيمها من أزواج التمهيدي BE، BF، وحرس الحدود في متحولة rna14-1 يعكس إنهاء قراءة من خلال النمط الظاهري (الشكل 3B، لين 11-13، والشكل 3C، المناطق E، F و G). في خلايا نوع البرية، ومع ذلك، فإن إشارة TRO كان محدودا حتى العنصر فاصل (الشكل 3B، الممرات 2 و 3؛ والشكل 3C، مناطق C و D). لم يكن هناك أي إشارة TRO اكتشافها خارج المنطقة فاصل (الشكل 3B، لين 4-6، والشكل 3C، المناطق E، F و G). وبالتالي، فإننا يمكن أن الكشف عن النصوص التي بدأها المروج الوليدة أن تقرأ من خلال إشارة الإنهاء في متحولة ولكن ليس في خلايا نوع البرية، مما يؤكد أن Rna14 عامل إنهاء.
المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 1: النسخ على تشغيل (TRO) الفحص يكتشف وجود النشطة Transcriptionally RNA البلمرة في مناطق مختلفة من الجينات. (أ) عندما إنهاء أمر طبيعي، وليس هناك أي إشارة البلمرة خارج المنطقة فاصل. (ب) عند إنهاء معيب، والبلمرة غير قادر على قراءة إشارة الإنهاء ويمكن الكشف عن ما وراء نهاية 3 'من الجين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ستراند محددة TRO الفحص. وTRO فحص حبلا محددة يمكن الكشف عن إذا وجود البلمرة نشط transcriptionally وراء نهاية 3 'ركان الجين هو عيب إنهاء حقيقي بسبب البلمرة، بدأت المروج القراءة من خلال إشارة الإنهاء (A)، أو هو مجرد الكتابة انتشارا الاختزال البلمرة في اتجاه ومعنى (B)، أو هو مكافحة الشعور ncRNA الكتابة البلمرة بدء من 'نهاية 3 (C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): Rna14 هو عامل إنهاء كما يقرأ البلمرة من خلال الإشارة إنهاء في المسخ rna14-1. (A) تصوير تخطيطي من الجينات ASC1 تبين موقف التمهيدي B إلى الأمام وخمسة بادئات العكسي، C، D، E، F، G، وتستخدم لتخليق [كدنا] من الحمض النووي الريبي وصفت BrUTP-تنقيته. (ب) [كدنا مصنوعة من الاشعال عكس C، D، E، F كان وG PCR تضخيمها باستخدام بادئات أزواج قبل الميلاد، دينار بحريني، BE، BF وBG على التوالي. (ج) التحليل الكمي للبيانات TRO هو مبين في (ب) أعلاه في النوع البري والخلايا rna14-1 عند 37 درجة مئوية. وقد استخدم 5 S RNA مثل السيطرة التطبيع. أشرطة الخطأ تمثل وحدة واحدة كاملة من الانحراف المعياري استنادا إلى ما لا يقل عن ثلاث محاكمات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تعديل بروتوكول TRO-حبلا المحددة المستخدمة هنا من البروتوكول المستخدم لاللائحة العامة للمنظمة تسلسل (العالمية تدار على التسلسل) تحليل في خلايا الثدييات 12. نحن تعديل بنجاح بروتوكول لدراسة النسخ الوليدة في مهدها الخميرة. لتحليل تحديدا الخلل إنهاء النسخ، ونحن تعديل بروتوكول إضافي من خلال التخلص من الخطوة RNA التحلل. وهذا ما سمح لنا للكشف على وجه التحديد طول النصوص الوليدة الكاملة التي بدأت من موقع بداية النسخ بالقرب من منطقة المروج.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول الذي يجب أن يتم تنفيذ بمنتهى الحذر للحصول على نتيجة ذات مغزى. أولا، يجب أن يتم تنفيذ بروتوكول مع خلايا الخميرة تنمو باطراد. الخلايا في مرحلة سجل (A 600 ~ 0،8-1،0) تعطي أفضل النتائج حيث أن معظم الخلايا في هذه المرحلة تنمو بنشاط وتظهر النسخ قوي. الثانية، RNA العزلة الواحديجب أن يتم تنفيذ الجيش الشعبي في أسرع وقت ممكن في درجة حرارة تتراوح بين 2-4 درجة مئوية. ثالثا، قبل تنقية تقارب من BR-UMP صفت RNA، يجب إزالة الفردية BrUTP من إعداد الحمض النووي الريبي. كنا مجموعة RNA للتخلص من BrUTP من إعداد الحمض النووي الريبي المنقى. رابعا، استخدام الناسخ العكسي القوي هو أمر حاسم لإنجاز الناجح للبروتوكول.
بروتوكول TRO-حبلا المحددة المستخدمة هنا مزاياه أكثر من تقنية لطخة الشمالية في الكشف عن الخلل إنهاء كما هو أكثر حساسية وأسرع ويسلك دقة أعلى. هذا البروتوكول هو أيضا أفضل من بروتوكول TRO التقليدي كما أنه يمكن التمييز بين النصوص شعور من النصوص مكافحة الشعور وإذا هي نتيجة المرصودة بسبب المروج بادر-النسخ أو النسخ الشاذة بدءا من المروج منطقة المصب. بروتوكول TRO-حبلا محدد له بعض القيود. ومن أكثر شاقة وتستغرق وقتا طويلا من ثابت الواحدأكل تقنيات الكشف مرنا. ويتطلب ذلك عدد كبير من الخلايا. ولذلك، فإن تحليل النسخ من الجينات الاختزال منخفضة قد يكون مشكلة.
لقد استخدمت بنجاح هذه التقنية لدراسة الخلل إنهاء في دورة النسخ RNA البلمرة الثاني في مهدها الخميرة 2. ويمكن تمديد هذا النهج لدراسة إنهاء النسخ التي كتبها RNA البلمرة الأول وRNA البلمرة الثالث في الخميرة أيضا. مع بعض التعديلات المناسبة، ويمكن أيضا أن تطبق النهج لدراسة الخلل إنهاء النسخ في حقيقيات النوى أعلى. وعموما، فإن تقنية غير مكلفة نسبيا ومفيد للغاية وتتطلب معدات القياسية المستخدمة في مختبر البيولوجيا الجزيئية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
References
- Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
- Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription. Sci Rep. 5, 12586 (2015).
- Richard, P., Manley, J. L. Transcription termination by nuclear RNA polymerases. Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).
- Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).
- Porrua, O., Libri, D. Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).
- Jacquier, A. The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs. Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).
- Xu, Z., et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).
- Neil, H., et al. Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).
- Clark, M. B., et al.
- Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast. Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).
- El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C). Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
