Summary
여기서는 자유롭게 움직이는 신생아 간질 강아지에게 뇌파 검사 (EEG)를 기록하고 그 절차, 특징 및 적용을 설명하기 위해 고안된 새로운 기술을 소개합니다. 이 방법으로 1 주일 이상 뇌파를 기록 할 수 있습니다.
Abstract
뇌파는 뇌의 전기적 활동을 탐지하는 유용한 방법입니다. 또한, 간질이나 신경 퇴행성 장애와 같은 다양한 신경 학적 상태에 널리 사용되는 진단 도구입니다. 그러나 신생아에서 뇌파 기록을 얻는 것은 전문적인 취급과주의가 필요하기 때문에 기술적으로 어렵습니다. 여기, 신생아 쥐 (P8-P15)에서 EEG를 기록하는 새로운 방법을 제시합니다. 우리는 컴퓨터 핀 궤적을 사용하여 간단하고 신뢰할 수있는 전극을 설계했습니다. 정상 및 간질 두뇌에 고품질의 뇌파 신호를 기록하기 위해 쥐 강아지의 두개골에 쉽게 이식 할 수 있습니다. 새끼들은 간질 발작을 유도하기 위해 신경독 카이 닉 애씨드 (KA)를 복강 내 (ip) 주사 하였다. 이 수술에서 시행되는 외과 적 이식은 신생아의 다른 뇌파 검사보다 저렴합니다. 이 방법을 사용하면 1 주일 이상 동안 고품질의 안정적인 뇌파 신호를 기록 할 수 있습니다. 또한,이 과정은 성인 ra에도 적용될 수 있습니다간질이나 다른 신경계 질환을 연구하기 위해 ts와 마우스를 사용합니다.
Introduction
정상적인 뇌 기능을 얻기 위해서는 뉴런 간의 지속적인 통신이 필요하다는 것이 잘 알려져 있습니다. interneuronal 의사 소통은 주로 하나의 뉴런에서 정보가 두 번째 뉴런으로 전달되는 시냅스에서 발생합니다. 이 시냅스 전달은 전기적 또는 화학적 시냅스의 두 가지 유형의 전용 구조 배열에 의해 조정됩니다. 전기 생리학 (Electrophysiology)은 전반적인 신체 기능과 행동을 제어하는 간세포 통신 과정에서 발생하는 전위를 포착하는 분야입니다. EEG는 많은 전기 생리 학적 기법 중에서 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다.
EEG는 내부 또는 외부 자극에 의해 생성 된 전기 신호의 변화를 감지하는 데 사용되는 기술입니다. 또한, 그것은 간질, 파킨슨 병 및 알츠하이머 병과 같은 다양한 신경 학적 증상의 임상 적 진단 및 결과 예측에 필수적인 검사입니다e뿐만 아니라 약리학 적 및 독성 학적 인자의 영향 3 . 일반적으로 간질 환자는 과다 흥분성과 뇌의 기능적 연결성을 손상시킵니다. 이들은 간질 간질 방전 (IEDs)으로 요약되며 예리하고 일시적인 스파이크의 형태로 EEG로 기록 될 수 있습니다. 날카로운 파도; 스파이크 - 웨이브 복합체; 또는 polyspikes 4 . 간질 뇌의 주요 특징은 발작을 일으키는 뇌 영역을 찾기 위해 두피 또는 뇌 실질에서 기록 할 수있는 간질 발작의 자연 발생입니다. 또한 뇌파는 알츠하이머 병 (AD)과 같은 신경 퇴행성 장애에 매우 중요한 영향을 미칩니다. 연구에 따르면 AD 환자의 변화된 뇌파 기록 및 진동 성 네트워크의 손상이 흔한 것으로 나타났습니다. 그러나 신경 퇴행성 질환에서의 네트워크 진동의 병태 생리에 관한 우리의 지식은놀랍게도 불완전하고 더 탐험해야 할 필요가있다.
이 프로토콜에서는 정상 뇌와 병리학 뇌 모두에서 전기 통신을 이해할 수 있도록 뇌파를 기록 할 수있는 간단한 전극을 설계했습니다. 이 방법의 외과 이식은 다른 가용 절차보다 저렴합니다 7 . 또한,이 방법은보다 긴 시간 프레임 ( 즉, 하루 2 ~ 4 시간) 동안 고품질의 안정적인 뇌파 신호를 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 우리는 더 자연스럽게 행동 할 수있는 더 가벼운 전극 (무게 약 26mg)을 사용했습니다. 이 방법은 전기 생리학 실험실에서 일반적으로 사용되는 증폭기 및 디지타이저가 필요한 신생아 쥐의 뇌파 연구에 널리 적용 할 수 있으며 추가 장치가 필요하지 않습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 보호, 수술 절차 및 기록 절차는 남 중국 사범 대학 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따랐습니다.
1. 전극 준비 (그림 1A-C)
참고 : 컴퓨터 핀 위치는 통신 장치의 신호 인터페이스의 일부로 뾰족한 접촉입니다. 암 커넥터에 플러그되는 수 커넥터가 구성됩니다.
- 조임 장치를 사용하여 남성 핀과 여성 핀을 컴퓨터 핀 위치 ( 그림 1A )에서 조심스럽게 분리합니다. 수컷과 암컷 핀을 함께 연결하여 전극을 만들고 시아 노 아크릴 레이트를 사용하여 강한 접착 본드를 만듭니다 ( 그림 1C ).
- 증류수가 들어있는 비이커에 전극을 넣고 10 분 동안 초음파 세척기에 놓습니다. 45 ° C에서 30 분 동안 건조 오븐으로 옮깁니다. 30 분 동안 자외선을 사용하여 전극을 소독하십시오.
2. 수술 절차 (그림 1D - F)
- 멸균 수술 도구 및 stereotaxic기구를 준비합니다. 공기와 함께 isoflurane 마취 (2.5 %)를 사용하여 신생아 쥐 강아지를 마취. 강아지가 깊이 anesthetized 때 1.0 %로 isoflurane의 복용량을 조정합니다. 적절한 마취 깊이를 보장하기 위해 수술 전에 꼬리 또는 발끝을 꼬집어 라.
- 정강이 장치의 귀 머리를 귀 운하에 넣고 약간 조입니다.
참고 : 신생아 두개골이 매우 부드럽기 때문에 귀 막대를 과도하게 조이지 마십시오. - 모든 장비에 70 % 에탄올을 뿌려 멸균 수술장을 유지하십시오. 메스를 사용하여 머리에 15mm 절개를하십시오. 집게를 사용하여 네 모퉁이의 정중선에서 두피를 조심스럽게 당겨냅니다. 절개를 활짝 열어두기 위해 피부 아래에 생리 식염수를 뿌려주십시오 ( 그림 1D ).
- 두개골에 bregma와 lambda 점을 찾아라.그들을 연필로 표시하십시오. 주사기 바늘 (26G)을 사용하여 전두엽 피질 (PFC)과 해마에 두 개의 구멍을 뚫습니다.
참고 : Preg는 bregma의 후방에서 + 1.8mm, 정중선에서 -0.5mm 떨어져 있으며 해마는 bregma의 앞쪽에서 -2.0mm, 정중선에서 +/- 0.5mm 떨어져 있습니다 ( 그림 1D 및 E ). 전극의 깊이는 뇌 손상을 최소화하기 위해 피질 표면 아래 2mm 이상 떨어져서는 안됩니다. - 집게를 사용하여 전극을 잡고 기준 전극과 기록 전극을 각각 PFC와 해마에 삽입하십시오. 가능한 감염을 피하기 위해 전극 주위에 에리스로 마이신 연고를 바르십시오. 시아 노 아크릴 레이트를 사용하여 전극을 고정하십시오.
- 접착 성 및 점성이있는 일관성을 유지하도록 치과 용 아크릴 시멘트를 준비하십시오. 전극과 두개골의 나머지 부분을 덮기 위해 치과 용 시멘트를 바릅니다.
참고 : 치과 용 시멘트를 바르기 전에 두개골을 완전히 말립니다. 전극을 보호하기 위해 5 % 피크 글루 산을 전극에 바릅니다.
참고 : 전체 절차는 멸균 상태를 유지하기 위해 바이오 안전성 후드에서 수행되어야합니다. - stereotaxic 프레임에서 동물을 제거하고 10 % 포도당 300 μL를 피하 주사. 가열 된 담요 위에 올려 놓으십시오. 동물이 따뜻하고 (37 ° C), 이동성이 있는지 ( 즉 완전히 회복되었는지) 확인하십시오. 수술 후 통증에 대해 부 프레 노르 핀 (0.05 mg / kg)을 복강 내 투여.
참고 : 충분한 의식 (정상적인 행동 및 움직임)이 회복 될 때까지 동물을 방치하지 마십시오. - 의식을 되찾은 후에는 댐을 가지고 강아지를 집으로 되돌려 보내십시오. 동물이 완전히 회복 될 때까지 이틀간 기다리십시오.
3. 뇌파 기록
- 완전 회복 후 강아지의 두개골에 이식 된 전극을 자체 케이지에있는 증폭기에 연결하십시오. 앰프를 아날로그 - 디지털 c에 연결하십시오.컨버터를 컴퓨터에 연결하십시오. 연결 라인은 얽히게하지 않도록 조심스럽게 다루어야합니다.
- 녹음을 위해 데이터 수집 장치에서 최소 10,000 Hz 샘플링 속도를 선택하십시오 (송신기의 대역폭은 1 - 100 Hz입니다). 데이터가 올바르게 샘플링되었는지 확인하십시오.
- 기준 기록을 얻은 후, 간질 발작을 유도하기 위해 카 이닌산 (KA) (2 mg / kg)을 복강 내에 복강 내 주사한다. KA 주입 후 15 분 동안 간질 방출을 관찰하고 기록하십시오. KA를 통한 경련 생산은 대개 물리적 인 것입니다.
참고 : 발작 발기 지속 시간은 약 15.2 ± 0.9 초, 발작 지속 시간은 약 62 ± 5 초입니다. 염소 수화물 (400 mg / kg)을 IP 주사하여 신생아 쥐에서 발작을 예방할 수 있습니다. - 디지털화 된 데이터를 저장하고 spike2와 같은 신호 처리 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하십시오. perf에 의해 신생아 EEG 신호의 여러 주파수 구성 요소의 출력 수준을 보여줍니다.파워 스펙트럼 분석을 오밍하는 것. 1에서 100 Hz (EEG 밴드)까지의 Root-Mean-Square 진폭을 찾아서 1 분 시간대의 전력을 계산하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
위와 같은 외과 수술이 적절하게 시행되면, 한 쥐의 신생아 강아지 뇌파 기록이 성공적으로 수행됩니다. KA 주입 10 분 후 규칙적인 행동 신호 패턴이 불규칙한 움직임과 긁힘, 떨림, 균형 감퇴의 형태로 나타났습니다. 그림 2는 대표적인 생 EEG 추적과 발작 발작, 발작 - 강장 및 발작 - 발톱 확장 된 추적을 보여줍니다. 재발 성 발작과 발작 뇌파 방전 패턴은 KA 주입 후 15-60 분 (30 ± 5.2 분, 평균 ± SEM)으로 시작되었다 ( 그림 2A 와 2B ). 그림 2D 와 2E 는 가장 일반적인 유형의 강박 성 간질 발작을 나타냅니다. 발기 부전 기간은 15.2 ± 0.9 초였다 ( 그림 2D ). 대표적인 결과는 강장 방전이 소뇌 파열 (clonic burst)이 뒤 따른다는 것을 보여 주었다 ( 그림 2B, 2D 및 2E).
e_content "fo : keep-together.within-page ="1 ">
그림 1 : 외과 용 임플란트 프로토콜의 예. ( A ) 작은 컴퓨터 핀들. ( B ) 암컷 핀 (왼쪽)과 수컷 핀 (오른쪽). 눈금 막대는 암컷 핀의 길이를 측정하는 데 사용됩니다. ( C ) 암수 핀을 연결했다. ( D ) 노출 된 두개골. No.1은 참조 사이트를 제공하고, No.2는 Bregma를, 3 및 4는 현재의 레코딩 사이트를, 그리고 5는 Lambda를 제공합니다. ( E ) 전극 주입. 1 번은 기준 전극을 나타내고, 3 번과 4 번은 기록 전극을 나타낸다. ( F ) 회복 된 쥐돈 (P9). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
d / 55489 / 55489fig2.jpg "/>
그림 2 : KA로 유발 된 신생아 발작. ( A ) KA (2 mg / kg, ip)를 주사 한 P10 쥐의 대표적인 뇌파 추적 결과 간질 발작이 반복적으로 나타났다. ( B ) A. ( C , D 및 E ) 상자에서 단일 클러스터 같은 간질 방전 확대보기 B 에서 상자에서 확장 된 일반적인 interictal, 발정 강장 및 발작 clonic 추적을. ( F ) 요약 된 데이터를 보여주는 KA 주입 전후의 평균 뇌파 지수 (1 분 시간대) (평균 ± 표준 편차). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 뇌파 기록 설정. 대표적인 트레이스 녹음은 쇼이다.자유롭게 움직이는 신생아 쥐돈에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기서는 자유롭게 움직이는 신생아 생쥐의 EEG를 유선 방법으로 획득하기위한 수술 및 기록 절차를보고합니다 ( 그림 3 ). P7-P12 쥐 강아지는 만삭 인간 신생아 10 , 11 에 해당하는 발육기 연령에 있다고 제안되었습니다. 이 연령 그룹의 쥐 새끼들과 작업 할 때 고품질의 뇌파 기록 데이터를 얻는 것은 기술적으로 어렵습니다. 또한 특별한 취급과 세심한 관리가 필요합니다. 8 .
신생아 쥐 에서 생체 내 뇌파 기록을 조사한 이전의 연구는 P12 이상의 동물에서 유성 녹음 용액을 사용하여 수행되었지만 이러한 접근법은 비용이 많이 든다. 간단한 전극을 사용함으로써 우리는 고밀도 뇌파를 제공하면서도 실험 비용을 $ 1로 줄이는 전극을 만들 수있었습니다 ( 그림 1 ).녹음. 수술의 복잡성에 따라이 방법의 수술 적 착상은 최소 10 분이 소요될 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 전극의 이식입니다. 조심스럽게해야합니다. 전극과 두개골의 접촉을 일정하게 유지하려면 다음 단계를 고려해야합니다. 첫째, 해골에서 전극을 떼어 낼 수 있기 때문에 멸균 된 면봉으로 해골의 조직 파편을 제거하십시오. 둘째, 시아 노 아크릴 레이트를 사용하여 전극을 두개골에 부착하십시오. 셋째, 치과 용 시멘트의 적절한 점도를 유지하십시오. 두 레이어에 치과 용 시멘트를 적용하는 것이 좋습니다. 첫 번째 레이어는 두 번째 레이어가 첫 번째 레이어의 모서리를 덮기 위해 약간 콧물이어야하는 동안 두개골을 덮기 위해 조금 조밀해야합니다. 치과 용 시멘트를 피펫 팁으로 천천히 가볍게 두드려 강한 접착 본드를 만듭니다. 너무 물기가 있으면 전기장 아래에 절연 층이 생길 수 있습니다.ode, 너무 치밀한 경우, 치과 용 시멘트는 자체 무게로 인해 두개골에서 쉽게 떨어집니다. 생존을 위해 수술 전반에 걸쳐 강아지의 체온을 37 ° C로 유지하는 것도 중요합니다.
성장하는 새끼가 두개골에서 치과 용 시멘트와 전극을 제거 할 수 있기 때문에이 절차의 적용은 P8과 P15의 연령대 사이에있는 신생아 쥐에게 뇌파를 기록하는 것으로 국한됩니다. 추가 응용 프로그램의 측면에서,이 방법은 또한 사소한 수정 후 성숙한 쥐와 생쥐의 전기 활동을 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 상승 된 플러스 미로와 같은 다양한 행동 실험에 사용하기에 적합합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 아무런 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 자연 과학 재단 (31171355)과 광동 자연 과학 재단 (S2011010003403, 2014A030313440)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
- Pereda, A. E. Electrical synapses and their functional interactions with chemical synapses. Nat Rev Neurosci. 15 (4), 250-263 (2014).
- Chorev, E., Epsztein, J., Houweling, A. R., Lee, A. K., Brecht, M. Electrophysiological recordings from behaving animals--going beyond spikes. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 513-519 (2009).
- Freeborn, D. L., McDaniel, K. L., Moser, V. C., Herr, D. W. Use of electroencephalography (EEG) to assess CNS changes produced by pesticides with different modes of action: effects of permethrin, deltamethrin, fipronil, imidacloprid, carbaryl, and triadimefon. Toxicol Appl Pharmacol. 282 (2), 184-194 (2015).
- Werhahn, K. J., Hartl, E., Hamann, K., Breimhorst, M., Noachtar, S. Latency of interictal epileptiform discharges in long-term EEG recordings in epilepsy patients. Seizure. 29, 20-25 (2015).
- Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A.
- Nimmrich, V., Draguhn, A., Axmacher, N. Neuronal Network Oscillations in Neurodegenerative Diseases. Neuromolecular Med. 17 (3), 270-284 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System. J Vis Exp. (101), e52554 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
- Dzhala, V. I., et al. NKCC1 transporter facilitates seizures in the developing brain. Nat Med. 11 (11), 1205-1213 (2005).
- Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr Res. 65 (1), 62-66 (2009).
- Savard, A., et al. Involvement of neuronal IL-1beta in acquired brain lesions in a rat model of neonatal encephalopathy. J Neuroinflammation. 10, 110 (2013).
- Cuaycong, M., et al. A novel approach to the study of hypoxia-ischemia-induced clinical and subclinical seizures in the neonatal rat. Dev Neurosci. 33 (3-4), 241-250 (2011).
