Summary
Idrettsutøvere absorberer flere hundre milde traumatiske hjerneskade (mTBI) / hjernerystelse hvert år; Imidlertid er konsekvensen av disse på hjernen dårlig forstått. Derfor, en dyremodell av enkelt og repeterende mTBI som konsekvent replikerer klinisk relevante symptomer, gir midler for å fremme studiet av mTBI og hjernerystelse.
Abstract
Mild traumatisk hjerneskade (mTBI) kan resultere i akutt tap av hjernefunksjon, inkludert en periode med forvirring, et bevissthetstap (LOC), fokale nevrologiske underskudd og til og med amnesi. Idrettsutøvere som deltar i kontaktsporter har stor risiko for eksponering for store antall mTBIs. Med hensyn til nivået av skade hos en idrettsutøver, er en mTBI definert som en mild skade som ikke forårsaker grove patologiske forandringer, men forårsaker kortsiktige nevrologiske underskudd som spontant løses. Til tross for tidligere forsøk på å modellere mTBI hos mus og rotter, har mange rapportert brutto bivirkninger, inkludert kranietbrudd, intracerebral blødning, aksonal skade og nevonal celledød. Her beskriver vi vår svært reproducerbare dyremodell for mTBI som gjengir klinisk relevante symptomer. Denne modellen bruker en skreddersydd pneumatisk støtfanger for å levere trau med lukkede hoder. Denne innvirkning er gjort under presise hastighets- og deformasjonsparametere,Skape en pålitelig og reproduserbar modell for å undersøke mekanismene som bidrar til effekter av enkelt eller repeterende hjernerystelse mTBI.
Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI) er definert som en hodeskader opprettholdt av en ekstern fysisk kraft, noe som resulterer i forstyrrelse av normal hjernefunksjon. Det representerer en betydelig sosioøkonomisk og folkehelsen byrde, med Senter for sykdomskontroll og forebygging 2015 rapport til kongressen anslår at 2,5 millioner amerikanere opprettholder en TBI hvert år. Dette påvirker ikke bare pasientens livskvalitet, men legger også en ekstremt høy økonomisk kostnad på samfunnet, for tiden estimert til 76,5 milliarder dollar årlig. Mengden av faktisk hjerneskader overført og akuttfase symptomologiene er det som definerer mild, moderat og alvorlig TBI.
Mild traumatisk hjerneskade (mTBI), også referert til som hjernerystelse, rapporterer over 70% av TBIs rapportert hvert år 1 . Det er mest vanlig blant idrettsutøvere som deltar i høyrisiko kontaktsporter, inkludert boksing og fotball 2 . I motsetning til moderatEller alvorlige former for TBI, er øyeblikkelig skade og symptomer forbundet med mTBI noen ganger ikke så uttalt 3 . I motsetning kan de langsiktige effektene av mTBI være like ødeleggende som de som er sett i moderate og alvorlige former. De som lider av repeterende mTBI har vist seg å utvikle kronisk traumatisk encefalopati (CTE), samt andre kognitive og degenerative sykdommer 4 . Derfor er det viktig å få en større forståelse av mekanismene som bidrar til de kortsiktige symptomene og den generelle langsiktige skaden som oppstår etter mTBI.
Hos mennesket fastslår definisjonen av hjernerystelse som definert av den fjerde internasjonale konferansen om hjernerystelse i sport (Zürich 2012) 5 at nivået av skade for idrettshjernsomhet er mildt, ikke forårsaker grove patologiske forandringer, men forårsaker kortsiktige nevrologiske underskudd Som er spontant løst. Faktisk en receNt studie undersøkte effekten av mTBI på kognitiv funksjonsnedsettelse hos videregående fotballspillere, ved hjelp av telemetrisystemer med hodeffekt. Denne studien viste hvor mange ganger spillerne opprettholdt hjelmpåvirkninger> 20 g i en sesong varierte fra en lav på 226 (gjennomsnittlig 4,7 per økning) til en høyde på 1855 (gjennomsnittlig 38,6 per økt) 6 . De fleste av disse effektene resulterte ikke i den kliniske diagnosen av hjernerystelse; Men tegn på funksjonelle forandringer i hjernefunksjonen kunne observeres ved bruk av fMRI 6 . Hjernen endrer seg fordi disse funksjonelle endringene er ukjente, og derfor er det et presserende behov for å ha en pålitelig og reproduserbar modell for å lette undersøkelsen av effektene av hjernerystelse og subkoncussive mTBI.
Til tross for tidligere forsøk på å modellere mTBI hos mus og rotter 7 , rapporterer mange bivirkninger. Spesielt er de fleste gnagermodeller begrenset i sin repeterende natur ved å bruke færre thEn fem mTBIs påvirkning, samt ha uønskede patologiske hendelser inkludert intracerebral blødning, kraniet frakturer, alvorlig aksonal skade, nevroncelle død og økt dødelighet 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Her beskriver vi en musemodell av mTBI som er nærmere den sanne definisjonen av hjernerystelse hos mennesker. Denne modellen rekapitulerer mange av symptomene som observeres i menneskelig mTBI, som den mekaniske kraften som resulterer i det forbigående tap av bevissthet uten åpen brutto hjernepatologi. Videre er det fordelaktig i det faktum at det kan benyttes både for enkeltvirkende og repeterende virkningsparadigmer over lange tidsperioder som tidligere rapportert 13 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Disse studiene ble utført i henhold til anbefalingene i veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr i National Institutes Health. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Georgetown University. Mus ble plassert i et temperaturkontrollert dyranlegg og ble holdt på en 12 h lys / 12 h mørk syklus. Mat og vann var tilgjengelige ad libitum .
1. Fremstilling av mTBI-apparatet
MERK: MTBI-apparatet inkluderer en datainnsamling (DAQ) boks for å kontrollere slagparametere, en høyhastighets pneumatisk støtfanger for å utføre påvirkningen, og en støpt gel fylt base for å senke hodet etter støt.
- Slå på trykkluft og start på høyhastighets pneumatisk støtfanger til en trykkinnstilling på 861,85 kPa.
- Kalibrere DAQ-kontrollsystemet til følgende parametere-stempelhastighet på 2,35 m / s, overflateoppholdstidE på 31,5 ms.
- Plasser den støpte, fyldte basen (komprimerbarhet 64 kPa / mm) slik at midterlinjen er vinkelrett med strekkstangen for slagspidsen.
2. mTBI Impaction
- Legg inn vekter av alle musene som skal brukes.
- Bedøve mus med 3% isofluran i oksygen i 120 s i et induksjonskammer.
- Overfør mus til mTBI apparat, fortsettende anestesi via en bøyelig, ikke-fast nese kjegle.
- Mens du er i nesekegle, plasser musen på hylsen slik at den flate overflaten av skallen presenteres vinkelrett på slagspissen.
- Legg teip over musekroppen for å lage en flat overflate og hold ørene vekk fra støtestedet.
- Senk polytetrafluoretylens slagspids for å justere med sagittal midtlinjen i midten av hodet. Bruktstikket som brukes er 10 mm i diameter og vil dekke området av hodebunnen fra like bak øynene til ørens midterlinje. Juster støtfangeren så det er juSt berører overflaten av musen hodet.
- Trekk inn støtfangstspissen og slå ned den nødvendige avbøyningsdybden (7.5 mm) manuelt.
- Arm DAQ-kontrollsystemet og trykk utløserknappen for å påvirke musens hode, enten en singular eller repeterende innvirkning. Repeterende virkninger leveres i rekkefølge uten forsinkelse mellom hver innvirkning.
- Umiddelbart etter den endelige virkningen, fjern musen fra anestesi og mTBI-apparatet og legg den i bakre stilling.
- Ved hjelp av en stoppeklokke måles latensen for retur av høyre refleks (liggende til tilbøyelig), for å bestemme tap av bevissthetstid, samt tid til ambulasjon (uhindret gange).
- Overvåk musen og ved utvinning til normal oppførsel, gå tilbake til sitt hjem bur.
- Sham-mus får identisk håndtering og anestesi, men får ingen innvirkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruken av denne nye mTBI-enheten muliggjør enkelt og repeterende milde hodeskader uten risiko for kranbrudd eller strukturelle hjerneskade. Modellen bruker en skreddersydd pneumatisk Teflon-støtningsenhet for å levere mekanisk energi-støt på lukket hode. Effekten er gjort under presise hastighets- og deformasjonsparametere, og skaper en pålitelig og reproducerbar modell for å undersøke mekanismene som bidrar til effekten av enkelt eller repetitiv hjernerystelse mTBI ( figur 1 ).
Tilstedeværelsen eller fraværet av LOC er et nyttig verktøy for gradering av hjernerystelse i dyremodeller. Returen av den rettende refleksjonstiden er en akutt nevrologisk vurdering av skade alvorlighetsgrad at vi brukte å kvantifisere LOC etter en enkelt og gjentatt mTBI (7,5 mm dybde, figur 2 ). Under prosedyren mottar mus totalt 3 min isofluran I oksygen, og dermed har alle mus inkludert shams en LOC-periode etter anestesi-tilbaketrekning. Single mTBI resulterer i signifikant økt LOC sammenlignet med sham-mus (36,4 ± 1,6 sv 64,2 ± 7,7 s, n = 5, ** p <0,01, figur 2A ). Dette korrelerte også med økte ambulasjonstider etter en enkelt mTBI (52,0 ± 4,5 sv 140,0 ± 21,1 s, n = 5, ** p <0,01, Figur 2B ). I gjentatte skadeparadismer (totalt 30 påvirkninger, 5 påvirkninger per dag i 6 dager) var det signifikant forhøyede LOC og ambulasjonstider på alle testdager (gjentatte målinger toveisanalyse av variansskadeseffekt F 1,14 = 22,92, P <0,0003). I løpet av hele studien var gjennomsnittlig LOC over 6 dager Sham: 35,5 ± 1,4 sv mTBI: 64,9 ± 1,7 s, n = 8, p <0,01, figur 2C og gjennomsnittlig ambulasjonstid Sham: 64,3 ± 3,3 sv mTBI: 160,8 ± 5,3 s, n = 8, p <0,01,Lass = "xfig"> Figur 2D. Iba1-farging for mikroglia / makrofager viste ingen forandring mellom sham og single mTBI-mus, men omfattende Iba1-immunreaktivitet i optisk kanal i gjentatte mTBI-mus ( figur 3 ). Repeterende mTBI-mus viste ingen tegn på betennelse i gråsaken i cortexen ( Figur 3 ) eller andre hjerneområder.
Figur 1 : Illustrativ representasjon av musemodellen til mTBI. ( A ) Oppsett av alle materialer som kreves for å utføre mTBI. ( B ) Mus plassert i isofluran-induksjonskammer i 2 minutter. ( C ) På mTBI-apparatet ble musen plassert i en ikke-fast nesekegle for å fortsette anestesi. ( D ) Forsiktig tape musen hodet for å lage en flat overflate og hold ører tilbake. ImpactoR senket ned for å bare berøre overflaten av hodet. ( E ) Impactor-spissen trekkes tilbake og den nødvendige avbøyningsdybden senkes ved hjelp av dreiebryteren (inset). MTBI utført ved å trykke utløserknappen. ( F ) Bevisstap, målt etter den tid som er tatt for tilbakebetaling av korrektionsrefleks (liggende til utsatt). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Enkelt og gjentatt mTBI øker transient tap av bevissthet og tilbake til ambasasjonstider. Mus som mottar en enkelt mTBI, har signifikant økt ( A ) tap av bevissthet (LOC) og ( B ) ambulasjonstider sammenlignet med sham-kontrollmus (n = 5 per gruppe, ** p <0,01). ( C - D ) Gjentatt mTBI (5 effekter per dag i 6 dager) øker daglig daglig LOC og ambulasjonstider sammenlignet med sham-mus (n = 8 per gruppe, * p <0,05, ** p <0,01, *** p < 0,001). Data uttrykt som gjennomsnitt ± SEM, analysert ved toveis gjentatte tiltak ANOVA med en Bonferroni post-hoc test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 : Gjenta mTBI Inducerer Microglia / Makrofager Aktivering i Optisk Trakt. ( A ) Iba1-farging i sham-mus avslører hvilende mikroglia / makrofager i cortexen (a1-a3) og begrenset farging i optisk kanal (a4-a6). ( B ) Mus som mottar en enkelt mTBI(7,5 mm) har lignende Iba1-fargeprofiler som skammus i både cortex (b1-b3) og optisk kanal (b4-b6), 24 h etterpåvirkning. ( C ) Gjentatte mTBI-mus (5 effekter per dag i 6 sammenhengende dager) viser en sterk inflammatorisk respons i optisk tarmkanal (c4-c6), men ikke i cortex (c1-c3), 24 timer etter siste innvirkning ). Forstørrede bilder som demonstrerer morfologien til Iba-1 positive mikroglia / makrofager i cortexen (a3, b3, c3) og optisk kanal (a6, b6, c6) av sham, enkelt og repetitive mTBI-mus. Skalestenger = 200 μm (A, B, C); 50 μm (a1-a5, b1-b5, c1-c5); 20 μm (a3, a6, b3, b6, c3, c6, forstørrede paneler). Bilder som representerer n = 6 per gruppe. Cortex (cx), optisk kanal (opt), mild traumatisk hjerneskade (mTBI). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I mennesker er mTBI preget av funksjonsnedsettelse i fravær av strukturelle skader. Dette kan oppstå med eller uten et bevissthet 1 . Eksponering for gjentatte hjernerystelser er for tiden tenkt å ligge til grunn for utviklingen og / eller utviklingen av nevrodegenerative sykdommer som CTE 4 . Det er godt dokumentert at CTE vanligvis finnes i bokser og fotballspillere, og selv om eksponering for gjentatte hjernerystelse (inkludert de som ikke fører til bevissthetstap) er kjent som et viktig element i utviklingen av CTE, vet vi ennå ikke hvorfor Mekanismene som gjentatt hjernerystelse forårsaker de forskjellige forandringene som skjer i hjernen.
En stor hindring for å forstå disse mekanismene er vanskeligheten med å utvikle modeller som nøyaktig rekapitulerer de viktigste symptomologiene som observeres hos personer som opprettholder en mTBI-effekt. Dette betyr akutt og kronisk biologisk patDet er vanskelig å undersøke hvilke hjerner som ligger bak hjernerystelse, og nye behandlinger kan ikke utvikles. Spesielt er eksisterende dyremodeller for gjentatt hjernerystelse svært alvorlige, ved bruk av kun 2-3 gjentatte påvirkninger som forårsaker omfattende neuronal celle tap, kranietbrudd og tap av hjernevev 8 , 10 , 11 , 12 . Denne omfanget av skade forekommer ikke etter gjentatt hjernerystelse hos mennesker, noe som viser behovet for en ny modell av enkelt og repeterende mildt hodepåvirkning.
Her beskriver vi en ny modell av mTBI, ved hjelp av en skreddersydd diffus skadeanordning som er spesielt utviklet for å overføre energi gjennom skallen og hjernen og bort fra musen. Gjennom både single impact og repetitive impact paradigms, gir modellen mulighet til å begynne å undersøke hvordan hjernerystelse bidrar til nevrologisk nedsettelse senere i livet. Den enkle hParadigmet rekapitulerer kjennetegn ved mild traumatisk hjerneskade observert hos mennesker, mens det repeterende paradigmet tillater undersøkelse av hvordan disse tilsynelatende milde skader bidrar til kronisk og vedvarende degenerasjon over tid. Enheten gir mulighet for repeterende mTBI-hodestøt uten risiko for kranbrudd eller strukturelle hjerneskade.
Som det er tilfellet med mange teknikker, er visse aspekter av denne protokollen viktige å merke seg for genereringen av nøyaktige og pålitelige resultater. Under kammerinduksjon og mTBI-skade er det viktig å opprettholde en konsistent narkose til hver mus. På grunn av det faktum at reting og ambasasjonstid er en nøkkelutfallsmåling av denne mTBI-prosedyren, bør forskerne sørge for at både mTBI-skader og svindyr blir utsatt for sammenlignbare nivåer av bedøvelse. Spesielt, under hele prosedyren, bør musene bare være under anestesi i 3 minutter totalt (2 min i innInduksjonskammer, 1 min med mTBI-nese-kjegleanordningen). Dette lavt nivå og varighet av anestesi er en stor fordel i forhold til mange andre mTBI-modeller, og gir konsistente rettende refleksrespons ganger (sham mus 20-40 s, mTBI mus 50-100 s). I tillegg, når du bruker gjentatt mTBI-paradigme, er det viktig å opprettholde en registrering av musekrefter hver dag i løpet av studien. Dette er for å sikre konsistent overvåking av stress og generell dyrevelferd gjennom hele tiden i mTBI-prosedyrene. Denne prosedyren resulterer ikke i at mus blir trukket eller isolert. Normal pleie, spising og drikking bør observeres innen den første timen etter prosedyren.
Etter skader er det ingen brutto morfologisk patologi i hjernevævet som skyldes enten enkelt- eller flere virkninger over en 1 ukers tidskurs . Etter en enkelt mTBI er den eneste cellereaktjonen observert en forbigående reduksjon i excitatoriske synapser; thEre er ingen betennelse, tap av grå eller hvit materie, aksonal skade eller celledød. Med 30 gjenta mTBI (5 per dag, over 6 dager) er det kronisk betennelse i optisk tarm, på lignende nivåer som tidligere kvantitert 1 . Kronisk hvitt stoffbetennelse har blitt observert mange år etter en enkelt mTBI 14 , og kronisk betennelse kan påvises hos levende utøvere med en historie med gjentatt mTBI 15 . Begrensningene i denne modellen er at den ikke kan brukes til å studere aksonskader utenfor optisk tarmkanal eller mekanismer for celledød, da disse er fraværende i vår modell. Også basert på våre tidligere publiserte data, fremkaller denne modellen ikke endringer i amyloid- eller tau-patologi ved 1 måned etter mTBI i en musemodell av Alzheimers sykdom 13 . Vi tror at denne mangelen på amyloid og tau-patologi er relatert til fraværet av aksonal patologi i vår modell. Vår modell gir en plattform for å undersøkeSpiste diskrete endringer i nevronnett, synaptisk integritet og sammensetning, og endringer i atferd etter gjentatte hjerneblåsninger. Basert på disse utfallene, produserer denne nye modellen klinisk relevant symptomologi på en kontrollert, streng og effektiv måte. Videre bruk av denne modellen vil tillate undersøkelse av mekanismene som ligger til grund for den akutte og kroniske patofysiologien av mTBI og hjernerystelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av R01 NS067417 fra National Institute for Neurological Disorders and Stroke (MPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powerlab 8SP data acquisition (DAQ) control box | (AD instruments) | ||
| VIP 3000 calibrated vaporizer | Matrx | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Oxygen | Commercially available | ||
| Compressed Air | Commercially available | ||
| Masking Tape | Commercially available | ||
| Stop Watch | Fisher Scientific | 02-261-840 | |
| C57 Bl/6 Mice | Jackson Laboratories | ||
| Digital Scale and weigh container | Fisher Scientific | 20031 | |
| anti-Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| HRP labelled secondary | Jackson Immunoresearch | 111-035-003 |
References
- McMahon, P., et al. Symptomatology and functional outcome in mild traumatic brain injury: results from the prospective TRACK-TBI study. J Neurotrauma. 31 (1), 26-33 (2014).
- Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The molecular pathophysiology of concussive brain injury. Clin Sports Med. 30 (1), 33-48 (2011).
- Blennow, K., Hardy, J., Zetterberg, H. The neuropathology and neurobiology of traumatic brain injury. Neuron. 76 (5), 886-899 (2012).
- Levin, H. S., Diaz-Arrastia, R. R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. Lancet Neurol. 14 (5), 506-517 (2015).
- McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport: the 4th International Conference on Concussion in Sport, Zurich, November 2012. J Athl Train. 48 (4), 554-575 (2012).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between pre-clinical research and clinical reality. J Neurochem. 129 (6), 916-931 (2014).
- Creed, J. A., et al. Concussive brain trauma in the mouse results in acute cognitive deficits and sustained impairment of axonal function. J Neurotrauma. 28 (4), 547-563 (2011).
- Hamberger, A., et al. Concussion in professional football: morphology of brain injuries in the NFL concussion model--part 16. Neurosurgery. 64 (6), 1174-1182 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. J Neurosci Methods. 203 (1), 41-49 (2012).
- Prins, M. L., et al. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Dev Neurosci. 32 (5-6), 510-518 (2010).
- Tang, Y. P., et al. A concussive-like brain injury model in mice (II): selective neuronal loss in the cortex and hippocampus. J Neurotrauma. 14 (11), 863-873 (1997).
- Winston, C. N., et al. Dendritic Spine Loss and Chronic White Matter Inflammation in a Mouse Model of Highly Repetitive Head Trauma. Am J Pathol. 186 (3), 552-567 (2016).
- Johnson, V. E., et al. Inflammation and white matter degeneration persist for years after a single traumatic brain injury. Brain. 136, Pt 1 28-42 (2013).
- Barrio, J. R., et al. In vivo characterization of chronic traumatic encephalopathy using [F-18]FDDNP PET brain imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 2039-2047 (2015).
