Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Forbedring af anvendelsen af høj molekylvægt Biotinylated Dextran Amin for Thalamocortical projektion sporing i rotter

Published: April 12, 2018 doi: 10.3791/55938
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer her, en raffineret protokol for at effektivt afsløre biotinylated dextran Amin (BDA) mærkning med en fluorescerende farvning metode gennem en gensidig neurale vej. Det er egnet til at analysere fine strukturen af BDA mærkning og adskille det fra andre neurale elementer under en Konfokal laser scanning mikroskop.

Abstract

Høj molekylvægt biotinylated dextran Amin (BDA) har været brugt som en yderst følsom neuroanatomical sporstof i mange årtier. Da kvaliteten af dens mærkning blev ramt af forskellige faktorer, her, leverer vi en raffineret protokol til anvendelsen af høj molekylvægt BDA for at studere optimal neurale mærkning i centralnervesystemet. Efter stereotactic injektion af BDA i ventrale posteromedial kerne (VPM) af thalamus i rotte gennem en delikat glas pipette, var BDA farves med fluorescerende streptavidin-Alexa (AF) 594 og counterstained med fluorescerende Nissl pletten AF500/525. På baggrund af grønne Nissl farvning, blev den røde BDA mærkning, herunder neuronal celle organer og cytoskeletale terminaler, mere tydeligt demonstreret i den somatosensoriske cortex. Desuden dobbelt fluorescerende farvning for BDA og calcium-bindende protein parvalbumin (PV) blev udført for at observere korrelationen mellem BDA mærkning og PV-positive interneurons i den kortikale mål, giver lejlighed til at studere den lokale neurale kredsløb og deres kemiske egenskaber. Således, denne raffineret metode er ikke kun egnet til at visualisere høj kvalitet neurale mærkning med høj molekylvægt BDA gennem gensidige nervebaner mellem thalamus og hjernebarken, men også vil tillade samtidige demonstration af andre neurale markører med fluorescerende histokemi eller immunochemistry.

Introduction

Høj molekylvægt BDA (10.000 molekylvægt), en meget følsom tracer, har været brugt til sporing nervebaner i det centrale nervesystem for over 20 år1. Selv om brugen af BDA er en fælles neurale tarmkanalen sporing teknik, kan kvaliteten af BDA mærkning blive påvirket i dyr af forskellige faktorer1,2,3. Vores seneste undersøgelse viste, at den optimale struktur af BDA mærkning er ikke kun forbundet med en ordentlig Post injektion overlevelsestid, men også korreleret med farvning metode4. Indtil nu, konventionelle begærlighed-biotin-peroxidase complex (ABC), streptavidin-fluorescein isothiocyanat og streptavidin-AF594 farvning metoder der er anvendt for at afsløre BDA mærkning i tidligere undersøgelser2,3, 4,5. I sammenligning, kan fluorescerende farvning for BDA let udføres.

For at udvide anvendelsen af høj molekylvægt BDA, blev en raffineret protokollen introduceret i den foreliggende undersøgelse. Efter injektion af BDA i VPM af thalamus i hjernen, rotte blev BDA mærkning afsløret ved den almindelige metode til standard ABC farvning samt ved dobbelt fluorescerende farvning, som blev gennemført for observere korrelation af BDA mærkning og grundlæggende neurale elementer eller interneurons i det kortikale mål med streptavidin-AF594 og fluorescerende Nissl histokemi eller PV-immunochemistry, henholdsvis. Gennem de gensidige nervebaner mellem VPM og primære somatosensoriske cortex (S1)6,7,8, vi har fokuseret vores observation på BDA mærkning i thalamocortical projiceres axoner og corticothalamic forventede celle svovldepositioner i S1. Ved denne proces, som vi forventes at levere en detaljeret protokol for at opnå den høje kvalitet af neurale mærkning med høj molekylvægt BDA, men også en raffineret protokol om kombinationen af fluorescerende BDA mærkning og andre fluorescerende neurale markører med histokemi eller immunochemistry. Denne tilgang er at foretrække at studere de lokale neurale kredsløb og deres kemiske egenskaber under en Konfokal laser scanning mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité på Kina kinesisk medicinsk Videnskabernes Akademi (referencenummer 20160014). Alle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med de nationale institutter sundhed Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Fire voksne mandlige rotter (vægt 250-280 g) blev brugt i denne undersøgelse. Alle dyr blev opstaldet i en 12 h lys/mørke cyklus med kontrolleret temperatur og luftfugtighed og gratis adgang til mad og vand. Instrumenter og materialer, der anvendes i den foreliggende undersøgelse blev vist i figur 1.  Før operationen, var alle instrumenter, såsom stereotaxisk ramme og glas pipette, renset, med 70% ethanol.

1. kirurgiske procedurer

  1. Bestemme den koordinere område af interesse i VPM ved hjælp af et stereotaxisk atlas9 (figur 2A).
  2. Forberede en 1 µL mikro-sprøjten udstyret med en glas mikropipette (med en spids diameter af ca 10-20 µm) (fig. 1 d) og teste det med flydende paraffin.
  3. Bedøver rotter med 7% Kloral hydrat (0,7 mL/100 g) af intraperitoneal injektion.
  4. Når dybe anæstesi er bekræftet med halen knivspids og pedal tilbagetrækning refleks, barbere toppen af dyrets hoved med en barbermaskine og krat operationsstedet 3 gange med 10% povidon-jod efterfulgt af 70% ethanol henholdsvis.
  5. Placere rotten i stereotaxisk enheden ved at placere stumpe øre barer i ørerne og placere den rotte øverste fortænder i munden indehaveren (figur 1E), og derefter anvende oftalmologiske salve på øjnene.
  6. Ren den hoved hud af operationsstedet igen med 70% ethanol. Brug steril kirurgiske handsker og håndklæder til at vedligeholde kirurgi under sterile forhold.
  7. Gøre en sagittal snit i huden med en skalpel langs den sagittal sutur (figur 1F).
  8. Skrab muskel og periosteum fra kraniet ved hjælp af steril bomuld tippes applikatorer hele kirurgi til at styre blødning (figur 1F).
  9. Ved hjælp af foruddefinerede koordinater fra en atlas (figur 2A), bestemme placering (-3.3 mm Bregma punkt, 2,6 mm højre midterlinjen) kraniotomi (figur 1 g).
  10. Udføre en kraniotomi ved hjælp af en burr boremaskine med lidt runde-tip (#106) (figur 1 H), og fortsætte med boring til omkring en 1 mm dybde inden for et par minutter indtil nå meninges (figur 1I).
  11. Punktafgifter dura mater bruger microforceps til at udsætte hjernebarken over injektionsstedet (figur 1I).
  12. Ændre flydende paraffin i mikro-sprøjten med 10% BDA (10.000 molekylvægt, i destilleret vand) løsning (figur 1J).
  13. Montere sprøjten ind i mikroinjektion apparatet og slutte med en mikro-pumpe (figur 1 K).
    Bemærk: Lydstyrken injiceres er afhængig af hastigheden af mikro-pumpe. Her blev den justeret til 30 nL/min (figur 1 L).
  14. Under et stereomikroskop, skal du indsætte et glas mikropipette manuelt med mikroinjektion apparater i VPM gennem hjernen på en dybde af 5,8 mm (figur 1 M) kortikale overflade.
  15. Pres-injicerer en 100 nL 10% BDA i VPM over en periode af 3 min (35 nL/min.) med en mikro-pumpe (figur 1 L, M).
  16. Holde pipetten på plads til en ekstra 5 min efter injektion, og derefter trække langsomt.
  17. Sutur såret med sterilt tråd (figur 1N). Følg dine lokale dyrs pleje Udvalget retningslinjer for præ- og post-kirurgisk analgesi.
  18. Placere rotten i en varm opsving område, indtil det kommer til bevidsthed og er fuldt tilbagebetalt.
  19. Vende den gendannede rotte tilbage til sit bur.

2. perfusions og sektioner

  1. Efter en overlevelsestid af typisk 10 dage, skal du injicere dyret med en overdosis af 10% urethan (2 mL/100 g) af intraperitoneal injektion til at fremkalde aktiv dødshjælp.
  2. Perfuse eksperimentel rotter i hood (figur 1O).
    1. Når ånde stopper, ved hjælp af saks og pincet, åbne brysthulen af rat at få adgang til hjertet. Indsæt et intravenøst kateter ind i venstre hjertekammer mod aorta, og derefter åbne i højre atrium.
    2. Første perfuse med 0,9% fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved fysiologisk temperatur (37 ° C) omkring 1-2 min indtil blodet ud af hjertet er klar, og derefter fortsætte med 250-300 mL 4% PARAFORMALDEHYD i 0,1 M fosfat-buffer (PB, pH 7,4).
  3. Incise hoved huden efter perfusion, åbne kraniet, og derefter dissekere ud rotte hjernen. Efter lave dissekeret hjernen i 4% PARAFORMALDEHYD i 2 timer ved stuetemperatur (26 ° C), derefter cryoprotect i 30% saccharose i 0,1 M PBS (pH 7,4) på 3 dage ved 4 ° C indtil hjernen er nedsænket i løsningen (figur 1 P).
  4. Når hjernen er nedsænket i løsningen, skal du opdele hjernen i tre blokke i den koronale retning på hjernen matricer (figur 1Q). Den centrale blok indeholder VPM og S1.
  5. Snit den centrale blok af hjernen på 40 µm på en indefrysning scenen glidende mikrotomen system i den koronale retning. Indsamle afsnittene velordnet i en 6-godt parabol med 0,1 M PBS (pH 7,4) (tal 1R, S).

3. standard ABC farvning

Bemærk: Gratis flydende sektioner fra hver tredje koronale del af hjernen blev brugt til at visualisere BDA mærkning med standard ABC procedure10.

  1. Skyl sektioner i 0,1 M PBS for ca 1 min.
  2. Inkuber sektioner i 1% ABC løsning i 0,1 M PB (pH 7,4) indeholdende 0,3% Triton X-100 i 1 time ved stuetemperatur.
  3. Vaske i afsnit tre gange i 50 mM Tris buffer (pH 7,4).
  4. Pletten sektioner i en oploesning indeholdende 0,02% 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) og 0,01% H2O2 i 50 mM Tris buffer for omkring 2-5 min ved stuetemperatur.
  5. Vaske i afsnit tre gange i 50 mM Tris buffer (pH 7,4).
  6. Montere sektionerne på objektglas ved hjælp af standard histokemiske metoder (figur 1T; Se Supplerende Video fil III, perfusion og sektioner).
  7. Tørre sektioner i luften natten over ved stuetemperatur.
  8. Dehydrere dele kort i en serie af alkohol (50%, 70%, 95%, 100%) løsninger. Dykke dias i hver løsning for omkring 15 s. Tillad ikke dias til at tørre ud mellem hvert trin.
  9. Fjern sektioner i xylen tre gange, ca 20 min.
  10. Sætte 2 eller 3 dråber af balsam på skiver derefter placere coverslips på sektionerne.

4. dobbelt fluorescerende farvning for BDA og basale neurale elementer i hjernebarken

Bemærk: derimod dobbelt fluorescerende farvning blev udført for observere korrelation af BDA mærkning og basale neurale elementer på den tilstødende dele til ovenstående bruges sammen med streptavidin-AF594 og counterstained med fluorescerende Nissl pletten AF500/525.

  1. Skyl sektioner i 0,1 M PBS for ca 1 min.
  2. Inkuber sektioner i en blandet opløsning af streptavidin-AF594 (1: 500) og AF500/525 grøn fluorescerende Nissl pletten (1:1, 000) i 0,1 M PBS (pH 7,4) indeholdende 0,3% Triton X-100 i 2 timer ved stuetemperatur.
  3. Vaske i afsnit tre gange i 0,1 M PB (pH 7,4).
  4. Montere sektionerne på objektglas ved hjælp af standard histokemiske metoder. Tørre sektioner i luften i ca 1 time.
  5. Anvende coverslips fluorescerende afsnittene med 50% glycerin i destilleret vand inden observation.

5. dobbelt fluorescerende farvning for BDA og Interneurons i hjernebarken

Bemærk: Dobbelt fluorescerende farvning blev gennemført for observere korrelationen mellem BDA mærkning og interneurons på de repræsentative afsnit i det kortikale mål med streptavidin-AF594 og PV-immunochemistry.

  1. Skyl de repræsentative afsnit i 0,1 M PBS (pH 7,4) for ca. 1 min.
  2. Inkuber sektioner i en blokerende løsning, der indeholder 3% normal ged serum og 0,3% Triton X-100 i 0,1 M PBS i 30 min.
  3. Overføre sektionerne i en opløsning af musen monoklonalt anti-PV IgG (1:1, 000) i 0,1 M PBS (pH 7,4) indeholdende 1% normal ged serum og 0,3% Triton X-100 for natten over ved 4 ° C.
  4. Den følgende dag, vaske i afsnit tre gange i 0,1 M PBS (pH 7,4).
  5. Udsætte dele til en blandet løsning af ged mouse-AF488 sekundær antistof (1: 500), streptavidin-AF594 (1: 500), og 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI, 1:40, 000) i 0,1 M PBS (pH 7,4) indeholdende 1% normal ged serum og 0,3% Triton X-100 for 1 h.
  6. Gentag trin 4.3 til 4.5.

6. observation

  1. Tage billeder af VPM, thalamocortical axoner og corticothalamic neuroner.
    1. Overholde de fluorescerende prøver med en Konfokal billedbehandlingssystem udstyret med mål linser (4 x, NA: 0,13; 10 x, NA: 0.40; og 40 x, NA: 0,95). Bruge excitations- og bølgelængder af 405 (blå), 488 (grøn) og 559 (rød) nm.
      Bemærk: Her Konfokal pinhole er 152 µm (4 x, 10 x) og 105 µm (40 x). Den rumlige opløsning af billedoptagelse er 1024 × 1024 pixel (4 x, 10 x) og 640 × 640 pixel (40 x).
    2. Tage 20 billeder i flere på hinanden følgende frames på 2 µm fra hver sektion på tykkelsen af 40 µm (Z-serien).
    3. Integrere billederne i et enkelt i-fokus billede med den Konfokal billedbehandling softwaresystem til tre-dimensionelle analyse som følger: Indstil start brændplanet → Indstil ende brændplanet → sæt trin størrelse → vælge dybde mønster → image capture → Z serie.
  2. Tage brightfield billeder af en lys mikroskop udstyret med en digital kamera (4 x, NA: 0,13; 10 x, NA: 0.40; og 40 x, NA: 0,95 linser). Bruge en eksponeringstid for 500 ms. brug et billedredigeringsprogram til at justere lysstyrken og kontrasten af billeder og til at tilføje etiketter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overlevelse af 10 dage post injektion af BDA i VPM var tilstrækkelig til fremstilling af intens neurale mærkning på de tilsvarende kortikale områder ipsilaterale til injektion side (figur 2). Både konventionelle ABC og fluorescerende farvning procedurer for BDA afslørede den lignende mønster af neurale mærkning på S1, herunder anterogradely mærket thalamocortical axoner og retrogradely mærket corticothalamic neuroner (figur 2 c, D ).

Anterogradely mærket axoner, de blev observeret fra lag 2 lag 6 med højere tæthed på lag 4 og den typiske type thalamocortical axoner blev observeret i området tønde (figur 2 c, D). I visningen højere forstørrelse præsenteret BDA mærkning klart på cytoskeletale trunk, grene, soeskende og små varicosities (figur 3A). Under mærket thalamocortical axoner skal vises, retrogradely mærket kortikale pyramideformet neuroner blev vist og deres celle organer fordelt på lag 5/6, men deres apikale dendritter udvidet til lag 2 (figur 2 c, D). BDA mærkning ikke kun præsenteret i de neuronale celle organer og dendritter, men også i dendritiske pigge, optræder som Golgi-lignende beslutning (figur 3B).

Derudover blev dobbelt fluorescerende farvning også udført for observere korrelationen mellem BDA mærkning og interneurons i det kortikale mål med streptavidin-AF594 og PV-immunochemistry. Omkring BDA mærkning i det kortikale mål, blev PV-positive neuroner distribueret fra lag 2 til lag 6 med høj koncentration i lag 4 (figur 4A). Der var ingen PV-positive neuroner til at være mærket med BDA, dog BDA-mærket cytoskeletale terminaler blev fundet i nærheden af overfladen af PV-positive celle organer og PV-positive cytoskeletale terminaler rundt om BDA-mærket kortikale pyramideformet neuroner (figur 4B, C ).

Figure 1
Figur 1. Fotografier af vigtige kirurgiske skridt og vigtigste instrumenter skal anvendes i dette eksperiment.
A: stereotaxisk enheden. B: dental boret. C: kirurgiske værktøjer (skalpel, microforceps og etc.) D: Micro-sprøjten udstyret med et glas mikropipette. E: placere den rotte hoved i stereotaxisk enheden. F: Rengør operationsstedet. G: bekræfte Bregma punktet. H: bore kraniet. Jeg: udsætte hjernebarken. Jørgensen: indlæse 10% BDA ind i mikro-sprøjten. K: Mount sprøjten ind i apparatet til mikro-injektion. L: justere hastigheden af mikro-pumpe. M: indsætter VPM glas mikropipette. Nielsen: sutur såret med sterilt tråd. O: Perfuse rotte i hætten. Pedersen: dissekere ud af hjernen. Q: opdele hjernen i tre blokke med hjernen matricer. Rasmussen: skære hjernen på en indefrysning fase glidende mikrotomen system. S: indsamle hjernen afsnittene velordnet i en 6-godt parabol. T: montere afsnittene på objektglas. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Injektionsstedet og typiske neurale mærkning med høj molekylvægt BDA i den somatosensoriske cortex.
A: injektionsstedet blev fastsat på et stereotaxisk atlas. B: repræsentative photomicrograph viser injektionsstedet af BDA (rød) i ventrale posteromedial kernen i thalamus (VPM) på baggrund af grønne Nissl farvning. C: Photomicrograph af fluorescerende BDA mærkning, herunder thalamocortical axoner i lag 4 og corticothalamic neuroner i lag 5/6. D: Photomicrograph af konventionelle BDA mærkning med en standard begærlighed-biotin-peroxidase procedure viser lignende mønster af neurale mærkning fluorescerende BDA mærkning. VPL, ventrale posterolateral kernen i thalamus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Høj kvalitet af neurale mærkning med høj molekylvægt BDA på baggrund af grønne Nissl farvning.
A: højere forstørrelse visning af anterogradely mærket cytoskeletale Dorne (rød) i detaljer. B: høj opløsning fotografier, der viser retrogradely mærket neuronal cellen kroppen, dendritter og dendritiske pigge (rød) i detaljer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Korrelation af BDA mærkning og calcium-bindende protein PV-positive interneurons i det kortikale mål.
A: distribution af BDA mærkning (rød) og PV-positive interneurons (grøn) i den somatosensoriske cortex. B: højere forstørrelse opfattelse af fordelingen af BDA-mærket axoner og PV-positive interneurons i lag 4. C: Højtopløseligt fotografi af BDA-mærket kortikale pyramideformet celler (rød) og PV-positive interneurons (grøn) i lag 5/6. Alle prøver blev counterstained med DAPI (blå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Video filer: De supplerende videoer kortvarigt vise den kirurgiske procedure, BDA indsprøjtning VPM, perfusion og skæring og resultater. I den video fil med navnet "IV. Repræsentant resultat", de tre-dimensionelle Konfokal laser scanning mikroskopi og analyse system resultater er vist. Høj opløsning animation viser retrogradely mærket neuronal cellen kroppen, dendritter og dendritiske pigge (rød) i detaljer. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

At vælge en ordentlig tracer er en kritisk trin til en vellykket neurale sporing eksperiment. I familien af BDA, høj molekylvægt BDA (10.000 molekylvægt) blev anbefalet til fortrinsvis transporteres gennem anterograd neurale vej i modsætning til lavmolekylære BDA (3.000 molekylvægt)2,3 , 11 , 12 , 13. dog mange undersøgelser også antydet, at høj molekylvægt BDA vil også kunne potentielt anvendes til retrograd pathway sporing parallelt med anterograd sporing1,2,3. Gennem de gensidige nervebaner mellem VPM og S1 forudsat vi yderligere beviser for at støtte tanken om, at høj Molekylær vægt BDA er egnet til tovejs-tarmkanalen sporing4. På samme måde i dette domæne, høj molekylvægt BDA blev også brugt i det visuelle og auditive system for behandlingen af de gensidige forbindelser mellem dorsale laterale geniculate kroppen og visuel cortex samt mediale geniculate krop og auditive cortex 3 , 14.

I neurale tracing eksperimentet er de andre vigtige overvejelser valget af farvning metode for de neurale mærkning. I de fleste af de tidligere undersøgelser, både konventionelle ABC protokol og fluorescerende streptavidin farvning metode har været brugt til at undersøge BDA mærkning og afslørede den tilsvarende morfologiske mønster1,2,3 , 4 , 5. her, fandt vi, at streptavidin-AF594 ikke var kun en passende valg for BDA mærkning, men også egnet til at kombinere med andre neurale markør, såsom fluorescerende Nissl og PV-antigen, giver en ny mulighed for observere korrelationen mellem BDA mærkning og andre neurale elementer. Selv om den konventionelle dobbelt-farvning metode til BDA og andre neurale markører blev også ofte udført med to-farve DAB procedure14,15, det er ikke egnet til at bruge en tre-dimensionelle analysesystem under en Konfokal laser scanning mikroskopi. Fra et teknisk synspunkt giver vores nuværende undersøgelse en værdifuld reference udpræget sammenligne mellem BDA mærkning og andre mærkning.

Neurale tarmkanalen sporing teknik blev oprindeligt anvendt til afslørende neuronal forbindelser mellem injektionsstedet og sit mål i nervesystem; forskere var imidlertid stadig i jagten på den ideelle struktur af neurale mærkning med en ordentlig tracer16,17. I modsætning til andre sporstoffer, såsom peberrodsperoxidase og subunit B af kolera toksin, producerer høj molekylvægt BDA den højere kvalitet af neurale mærkning for kvantificerer antallet af cytoskeletale Dorne og neuronal dendritter16,17 . Selv om den kvantitative analyse af BDA mærkning ikke blev gennemført i den nuværende undersøgelse, giver den højere kvalitet af neurale mærkning med BDA flere muligheder til nøje forstår de morfologiske karakteristika på mærket cytoskeletale Dorne og neuronal dendritter.

Svarende til anvendelsen af mange andre røbestoffer, en række vigtige spørgsmål skal overvejes til denne eksperimentelle procedure, herunder: koncentration og volumen af BDA anvendes til injektion, korrekte site af injektion, tip diameter glas pipette, kirurgiske proces, optimal overlevelsestid, perfusion, afsnit og observation under mikroskop. Det er direkte forbundet med kvaliteten af BDA mærkning hvad vi havde forventet. Ud over de kritiske trin nævnt ovenfor, er der tekniske begrænsninger, der kræver opmærksomhed, såsom afstanden fra webstedet injiceres til mærket målet, som er afhængig af model dyrearter anvendes i forsøg3, 5 , 18. i et ord, afhænger en vellykket sporing undersøgelse hvert skridt i hele forsøgsmetoden.

I den foreliggende undersøgelse, har vi givet en raffineret protokol for at vise, at de fluorescerende BDA farvning metode er en effektiv måde for at opnå den høje kvalitet af neurale mærkning, som samtidig kan kombineres med andre neurale markører ved hjælp af fluorescerende histokemi eller immunochemistry. Sammenligning af konventionelle BDA farvning med DAB-proceduren, kan vi lettere analysere finstrukturen af BDA mærkning og skelne den fra andre neurale elementer i sporing mål under en Konfokal laser scanning mikroskopi af den nuværende fluorescerende tilgang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (projekt kode nr. 81373557, nr. 81403327).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated dextran amine (BDA) Molecular Probes D1956 10,000 molecular weight
Streptavidin-Alexa Fluor 594 Molecular Probes S32356 Protect from light
500/525 green fluorescent Nissl stain Molecular Probes N21480 Protect from light
Brain stereotaxis instrument Narishige SR-50
Freezing microtome Thermo Microm International GmbH
Confocal imaging Olympus FV1200
system
Micro Drill Saeyang Microtech Marathon-N7
Sprague Dawley Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC Kit Vector Laboratories PK-4000
superfrost plus microscope slides Thermo #4951PLUS-001 25x75x1mm
Photoshop and Illustration Adobe CS5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
  2. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
  3. Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886 (2012).
  4. Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
  5. Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
  6. Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
  7. Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
  8. Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O'Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
  9. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. San Diego. (1998).
  10. Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
  11. Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
  12. Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
  13. Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. Neuroscience. 81, 773-802 (1997).
  14. DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
  15. Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
  16. Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).
  17. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
  18. Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).

Tags

Neurovidenskab spørgsmål 134 Biotinylated dextran Amin tracer neurale mærkning axon neuron somatosensoriske cortex
Forbedring af anvendelsen af høj molekylvægt Biotinylated Dextran Amin for Thalamocortical projektion sporing i rotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, D., Cui, J., Wang, J., Zhang,… More

Xu, D., Cui, J., Wang, J., Zhang, Z., She, C., Bai, W. Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat. J. Vis. Exp. (134), e55938, doi:10.3791/55938 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter