Summary
Оценки по целому количеству почек нефрона важны клинически и экспериментально, так как существует обратная связь между числом нефрона и повышенной опасностью почечных и сердечно-сосудистых заболеваний. При этом демонстрируется использование метода кислотного мацерации, который обеспечивает быструю и надежную оценку всего количества почек нефррона.
Abstract
Облечение нефрона относится к общему количеству нефронов, с которыми рождается человек, поскольку нефрогенез у человека завершается 36 неделями гестации, и после родов не образуются новые нефроны. Число нефрона относится к общему количеству нефраонов, измеряемых в любой момент после родов. Как генетические, так и экологические факторы влияют на одаренность нефрона и их количество. Понимание того, как конкретные гены или факторы, влияющие на процесс нефрогенеза и потери нефрон или кончины важно, как лиц с меньшим облечения нефрона или числа, как полагают, на более высокий риск развития почечной или сердечно-сосудистых заболеваний. Понимание того, как воздействие на окружающую среду в течение жизни человека влияет на число нефрон также будет иметь жизненно важное значение в определении будущего риска заболевания. Таким образом, способность оценивать быстро и надежно количество всей почки нефрона является базовым экспериментальным требованием для лучшего понимания механизмов, способствующих или способствующих нефрологенезу или потере нефрона. Здесь мы описываем метод кислотного мацерации для оценки количества почек нефррона, основанного на процедуре, описанной Дамадкой, Шавайри и Брикер, с небольшими изменениями. Метод кислотного мацерации обеспечивает быструю и надежную оценку числа нефрона (оцениваемых путем подсчета клубочков), которые находятся в пределах 5% от тех, которые определяются с использованием более продвинутых, хотя и дорогостоящих, методов, таких как магнитно-резонансная томография. Кроме того, метод кислотного мацерации является отличным методом высокой пропускной способности для оценки номера нефрона в большом количестве образцов или экспериментальных условиях.
Introduction
Нефрон является как основной структурной, так и функциональной единицей почки1. Структурно нефрон состоит из клубочек (капилляров и додокитов), расположенных в пределах боуменовой капсулы и почечной трубочки, состоящей из проксимальной трубочки, петли Хенле и дистальной трубочки, которая прекращается в собирающий проток. Функционально, роль нефрона заключается в фильтрации и реабсорбции воды и электролитов и секреции отходов. В целом, нефрогенез завершается в 36 недель гестации у людей и вскоре после рождения в нескольких видах, таких как мышь и крыса2. Облечение нефрона относится к общему количеству нефронов, с которыми рождается индивидуум, в то время как число нефрона составляет общее количество нефронов, измеряемых в любое время после рождения3. Термин «нефрон» и номер клубочковой часто используются как взаимозаменяемые. Поскольку существует только один клубочек на нефрон, оценка клубочков числа является важным суррогатом для оценки числа нефрон.
Оценка фонда нефрона и числа нефрона представляет клинический интерес, поскольку исследования продемонстрировали связь между одаренностью нефрона и сокращениями нефрона с увеличением заболеваемости сердечно-сосудистыми заболеваниями4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. Основываясь на результатах в почках при вскрытии, Бреннер заметил, что гипертензивные особи представлены с меньшим общим числом нефронов, чем нормотенсивные особи16. Таким образом, Бреннер предположил, что существует обратная зависимость между числом нефрона и риском развития гипертонии в дальнейшей жизни. Бреннер также предположил, что сокращение числа нефрона компенсируется нефронами, которые остались. Для того чтобы поддерживать нормальный тариф фильтрации в почках, остаточные нефроны компенсируют путем увеличивать их клубочковой поверхностную OBLASTь (гипертрофия клубочковой), таким образом работая для того чтобы уменьшить любое неблагоприятное влияние потери нефрона на функции почек4 ,16.
Хотя защитные в краткосрочной перспективе, клубочковой гипертрофия, в долгосрочной перспективе, приводит к увеличению натрия и жидкости удержания, увеличение объема внеклеточного жидкости, и увеличение артериального давления, что приводит к порочный круг дальнейшего увеличения клубочковой капилляра давление, клубочковой гиперфильтрации, и нефрон рубцов (склероз) и травмы4,16.
Получение оценок или отсчетов нефрона предлагают несколько экспериментальных преимуществ: 1) он предоставляет информацию о процессе нефрогенеза, которые затем могут быть связаны с конкретными генами или факторами в эмбрионе или матери и плода окружающей среды, и 2) существует Ассоциация номера нефрона с сердечно-сосудистыми заболеваниями, и, таким образом, существует вероятность того, что оценки числа нефрона могут быть использованы для прогнозирования будущих сердечно-сосудистых рисков2,17,18, в 19 , 20 , 21 год , 22. в дополнение к окружающей среде матери и плода, некоторые заболевания оказывают непосредственное влияние на число нефрона и функции почек, включая атеросклероз, диабет, гипертонию и даже нормальное старение2,9, 10,11,12,22,23. Таким образом, оценка числа ненефрона в целом почки имеет важное значение для понимания как генетических, так и экологических факторов, влияющих на нефрогенез (например, облечение нефрон) и числа нефрона в течение жизни человека и результирующий эффект на функции почек и сердечно-сосудистой системы.
В настоящее время существует несколько методов определения и количественной оценки числа нефрон, каждый из которых имеет свои преимущества и ограничения24,25,26,27,28 ,29,30. Изощренные методы для определения целого ряда почек нефрона включают стереологических методов, таких как метод дезсектора/фракционитор, и магнитно-резонансная томография25,26. Часто считается золотым стандартом для определения всей почечной число нефрон, диссектор/фракционитор метод является дорогостоящим и трудоемким. Недавние достижения и совершенствование магнитно-резонансной томографии и обработки предоставили инструменты для подсчета каждого нефрона индивидуально. Однако магнитно-резонансная томография является не только трудоемкой, но и чрезвычайно дорогостоящей. Кроме того, метод дезсектора/фракционирующих и магнитно-резонансной томографии требует наличия передовых технических знаний, что ограничивает использование таких методов в большинстве исследовательских лабораторий.
Большинство методов определения количества нефрона делают подсчет или оценку на основе идентификации клубочков, поскольку они легко идентифицируемые структурно. В данной статье описан и продемонстрирован27метод кислотного мацерации для расчета числа нефрона в целом почках. Метод кислотного мацерации быстр, надежен и значительно дешевле, чем другие методы, такие как метод дезсектора/фракционификатора и магнитно-резонансная томография. Кроме того, метод кислотного мацерации обеспечивает высоковоспроизводимые оценки числа нефрона, которые, как сообщалось, находятся в диапазоне тех, которые определяются с помощью магнитно-резонансной томографии26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Материалы и реагенты, перечисленные ниже, предназначены для определения целой почки нефрона в одной мыши, то есть две почки. Модификации для применения метода кислотного мацерации для крыс отождествляется со звездочками. Все экспериментальные протоколы соответствовали национальным институтам здравоохранения руководство по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены институционального ухода за животными и Комитета по использованию в университете штата Миссисипи медицинский центр.
1. почечная изоляция процедура
- Взвешивание мыши (или других видов) и усыпить его с изофлуран (5%-8%) передозировки или пентобарбатал (150 мг/кг интраперитонеальная инъекции).
- Как только мышь усыпляют, откройте ее брюшную полость, используя тонкие хирургические ножницы вдоль средней линии.
- Осторожно поднимите кишечник и репродуктивную жировой ткани на правую сторону брюшной полости. По грубой рассечения, изолировать левую почку. Используя тонкие хирургические ножницы, вырезать левую почечную артерию и Вену и аккуратно удалить левую почку, поместив почки в надлежащим образом помечены (мышь номер/идентификатор) весят лодку, содержащую фосфорно-буферизованные физиологический раствор (PBS).
- Повторите процедуру для правой почки.
- Извлекайте каждую почку от своего соответственно взвесьте шлюпку и положите ее на хирургическую марлю предварительно смоченную с PBS.
- Оставляя почки на хирургическую марлю, быстро удалить любые приверженец не-почечной ткани (например, perirenal жировой или надпочечников), а затем удаление почечной капсулы. Взвешивайте каждую почку индивидуально, фиксировав вес левой и правой почки отдельно в лабораторном блокноте.
2. процедуры гомогенизации, инкубации и напряжения
- После того, как каждая почка взвешивается, слейте каждый вес лодки PBS и поместите почки обратно в надлежащим образом помечены весят лодку. Использование чистого лезвия бритвы, вырезать почки пополам, продольно. Поместите каждую почку наполовину вниз и разрезать каждую половину на 2-мм или более мелкие кусочки.
- С помощью той же бритвы, тщательно собирать и размещать нарезанные кусочки почки в помечены 15 мл конической трубки (мышь номер/идентификатор; слева против правой почки).
- Повторите процедуру для противоположной почки, используя новое лезвие бритвы. Поместите нарезанную почку в отдельно обозначенный 15-мл коническую трубку.
- В хорошо проветриваемом вытяжной вытяжке, добавьте 5 мл 6 м соляного (совместимого) кислоты в каждую 15-мл конической трубки.
- Замените крышку на коническую трубку, мягко агитировать почки/совместимого смеси, и поместить 15-мл конической трубки в предварительно разогретой водяной бане на 37 ° c для 90 мин (* 120 мин для крыс почек).
- Кратко агитируйте каждую 15-мл трубку каждые 15 минут во время инкубации, чтобы гарантировать, что все ткани подвергается совместимого кислоты.
- Вставить 18-G иглы в шприц 5-мл (* 10-мл шприца для крыс) и осторожно снимите плунжера шприца. Поместите шприц в 50-мл конической трубки (трубка #1) в вытяжной капюшон.
- Удалите почку/совместимого раствора от водяной бане и вылейте раствор ткани в открытый конец шприца и установите 15-мл конической трубки в сторону в стойке пробирки. Осторожно замените поршень и медленно нажмите поршень, чтобы выдавде раствор через иглу и в трубку #1.
- Вымойте 15-мл конической трубки с 5 мл раствора PBS. Водоворот PBS в 15-мл конической трубки, с тем чтобы раствориться любой оставшейся ткани почек.
- Опять же, осторожно удалите поршень из 5-мл шприца, содержащего 18-G иглы и залить содержимое из 15-мл конической трубки в открытый конец шприца. Осторожно замените поршень и промойте шприц, осторожно нажав на поршень, в трубку #1. Повторите этот процесс 2x (выполняется 3x в общей сложности).
- Вставьте 21-G иглы в новый 5-мл шприца (* 10-мл шприца для крыс) и осторожно снимите плунжера шприца. Поместите шприц с иглой 21-G, прикрепленной к новой 50-мл конической трубки (трубка #2).
- Вылейте содержимое из трубки #1 в открытый конец шприца, содержащего иглу 21 г. Осторожно вставьте поршень и промойте шприц, осторожно нажав на шприц поршень и размещение экструдированного раствора в трубку #2.
- Вымойте трубку #1 с 5 мл раствора PBS. Водоворот PBS в трубке #1 таким образом, чтобы раствориться любой оставшейся ткани почек.
- Опять же, осторожно удалите поршень из 5-мл шприца, содержащего 18-G иглы и залить содержимое трубки #1 в открытый конец шприца. Осторожно замените поршень и промойте шприц, осторожно нажав на поршень, выдав раствор в трубку #2. Повторите этот процесс 2x (выполняется 3x в общей сложности).
- Довести общий объем трубки #2 до 50 мл, добавив дополнительные PBS, до 50 мл линии на трубке #2.
- Инкубировать трубку #2 содержащие раствор ткани почки в трубку стойки на плите рокер в холодильник установлен на 4 °C ночь (минимум 8-10 h).
3. Подсчет клубочков и экстраполяция номера нефрона
- Удалите трубку #2 из холодильника и ресуспензируем ткань, мягко переворавая трубку несколько раз для того, чтобы создать однородное решение. Мы рекомендуем считать клубочков в течение 5 d после обработки.
- Тщательно Алиготе 500 мкл раствора почки в один колодец 12-хорошо пластины. Повторите это 2x, помещая каждого Алиготе в отдельный колодец, так что есть три скважины почечного раствора на почку, для анализа в трех экземплярах.
- Добавьте 500 мкл PBS к каждому из трех скважин, содержащих раствор почки, для разведения 1:1.
- Использование перевернутого микроскопа, подсчитать количество клубочков per хорошо. Подсчет помогает с помощью сетки из 16 отдельных разделов, размещенных на дне каждого хорошо. Подсчитывайте количество клубочков в каждом разделе сетки, а затем суммированные подсчет в сетке, чтобы получить общее количество клубочков per хорошо. Клубочков легко узнаваемы по их сферической структуре. Дополнительные идентификаторы включали красноватый оттенок из-за заполненных кровью капилляров, а также пред-или пост-артериол, которые остаются прикрепленными к телу отдельных клубочков (рис. 1).
- Добавьте общее количество клубочков подсчитанных в каждый из 3 скважин и после этого разделите их 3 для среднего числа клубочков в 500 мкл разрешения почки. Если дисперсия в среднем количестве клубочков на скважины превышает 10%, повторите процедуру подсчета нефрона, уделяя пристальное внимание однородной природе раствора почек. Умножьте число клубочков подсчитанных в также времена 100 для среднего числа клубочков в почку. Общий номер нефрона может быть выражен в почках или, с использованием веса почки, на мг или г ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ниже приведены репрезентативные оценки по целому количеству почек нефрона от установленной модели мыши гипертонии и генетической модели крыс возрастных хронических заболеваний почек. Ключевые идентификационные характеристики клубочков, такие как сферическая структура с прикрепленными пред-или постартериолярными или трубчатыми структурами, выделены для тех, кто новичок в методе кислотного мацерации (рис. 1).
В первом экспериментальном примере общие номера нефрона были определены у мышей (мужчины C57BL/6, 6-недельного возраста), проникнуты транспортным средством (физиологическим раствором) или ангиотензин II в течение 14 дней. В мышах с настоянной машиной, число нефрона составляло 12 411 ± 248 нефронов на почку, определялась методом кислотного мацерации (рис. 2). Эти оценки согласуются с диапазонов целом почечная нефрон число зарегистрированных ранее у мышей (Таблица 1). Ангиотензин увеличил предсердной давление примерно на 40 мм гектограмм после 14 дней вливания и был связан со значительным уменьшением числа нефрона (9 122 ± 193 нефронов на почку) почти 26% (рис. 2). Эти данные свидетельствуют о том, что вливание ангиотензина II не только ассоциируется с гипертонией, но и значительное снижение числа нефрона связано с потерей нефрона из-за склероза или клубочковой травм.
В ходе второго экспериментального примера были подтверждены предыдущие результаты работы нефррона в генетической модели крыс почечного генеза, гетерогенной модели, выведенной из запаса односторонней почечной генеза (СЗПВ) крысы. Модель СЗРА проявляет неполное фенотипы по дефектам почек и мочевыводящих путей, при этом некоторые животные рождаются нормальными (с двумя почками) и другими рожденными с одной почкой. У крыс, родившихся с двумя почками (мужской hA-Control; 12-недельного возраста), оценки нефрона с использованием метода кислотного мацерации были 27 288 ± 336 нефронов на почку (рис. 3). В отличие от них, у крыс, родившихся с одиночной почкой (мужские hA-одиночные; 4 недели возраста), по оценкам, количество нефрона значительно ниже на 24 594 ± 883 нефронов на почку (рис. 3). Оценки числа нефрона, достигнутые в этих образцах, также соответствуют диапазонам, ранее сообщенных в крысе (Таблица 1). Заметим, что эти данные согласуются с предыдущими выводами, в которых hA-одиночные крысы были найдены на выставку снизился нефрон облечение или чисел (по сравнению с одной контрольной почки), скорее всего, отражает основные генетические факторы, связанные с рождаться с одной почкой31.
Рисунок 1 : Ключевые идентификаторы клубочков для подсчета и оценки номера всего почечного нефрона. Клубочков легко узнаваемы по их сферической структуре, как указано стрелками. Дополнительные идентификаторы включают красноватый оттенок из-за заполненных кровью капилляров, а также пред-или пост-артериол (или канальцев), которые могут оставаться прикрепленными к телу отдельных клубочков после обработки (как тот, идентифицирован в нижней части этого микрографа). Также присутствуют на этом изображении остатки трубочек и кровеносных сосудов. Увеличение = 10X; Шкала бар = 100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2 : Нефрон рассчитывает на мышей. (A) представительный образ клубочков из одной мыши почки покрытием в 22,1-мм плоским дном хорошо 12-хорошо культуры пластины, как видно с помощью перевернутого микроскопа. Клубочков и почечные канальцы видны при умеренной плотности при разбавленной фактором два (0,5 мл почечного раствора плюс 0,5 мл 1x PBS). (B) эффект 14-дневного транспортного средства или ангиотензина II инфузии на номер нефрона в мужских C57Bl/6 мышей, как оценивается клубочковой подсчета. Настой ангиотензина II в 1 000 нг/кг/мин (через осмотический мининасос) ассоциировался с артериальной гипертензией и ознаменовался уменьшением числа нефрона по сравнению с нефррон-номером у мышей, проникнуты транспортным средством. Нефрон номера в автомобиле проникнуты мышей согласуются с ранее сообщенных оценок числа нефрон у мышей (Таблица 1). Транспортное средство: n = 3, ангиотензин II: n = 3, *p < 0,05. Бары ошибки = SE. увеличение = 4X; Шкала бар = 250 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3 : Нефрон рассчитывает на крыс. (А) представительное изображение клубочков из одной крысы с почкой в 22,1-мм плоско-дном хорошо 12-хорошо культуры пластины, как видно с помощью перевернутого микроскопа. Клубочков и почечные канальцы видны на значительно более высокой плотности по сравнению с этим в мышь. B) количественное определение числа нефронов на крысах СЗР и сзра-с свидетельствует о том, что число нефронов меньше в СЗРА-с по сравнению с крысами Сзра-с и согласуется с предыдущими выводами этой модели31. СЗРА-с, крысы, родившиеся с двумя почками: n = 3; ЗСРА-с, крысы, родившиеся с одиночной почкой: n = 3,* p < 0. Бары ошибки = SE. увеличение = 4X; Шкала бар = 250 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
| Видов | Число нефрона на почку | Ссылки |
| Мыши | 9000-21000 | 18-22, 28 |
| Крыса | 13000-27000 | 31, 33 года |
| Овец | 200000-800000 | 23, 29, 34 |
| Свинья | 1600000-4600000 | 32, 35 лет |
| Человека | 500 000-2000000 | 8-15 |
Таблица 1: сообщающие диапазоны числа нефрона в нескольких видах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При хорошей экспериментальной технике метод кислотного мацерации идеален для оценки количества нефрона в целой почке. Хотя почка растворяется в кислоте, клубочков остаются в значительной степени нетронутыми и легко поддаются идентификации, что делает подсчет индивидуальных клубочков относительно легким и понятным. Метод кислотного мацерации особенно выгоден по нескольким причинам. Во-первых, метод кислотного мацерации является быстрым и удобным методом, который требует относительно мало с точки зрения расхода и физических усилий. Все реагенты и расходные материалы, необходимые для выполнения метода кислотного мацерации, легко доступны в большинстве базовых лабораторий, единственным основным требованием является доступ к перевернутому микроскопу для клубочковой подсчета. С точки зрения расхода, предполагается, что метод кислотного мацерации стоит всего пару сотен долларов на одного животного, что не много по сравнению с затратами, связанными с другими методами полного подсчета почек клубочковой, таких как магнитно-резонансная томография, которые могут варьироваться в тысячи долларов за животное времени сканирования и технических знаний.
Во-вторых, метод кислотного мацерации включает в себя значительно меньше времени обработки тканей по сравнению с другими методами в целом почечной нефрон, таких как дезсектор/фракционитор метод24. От начала до конца, метод кислотного мацерации требует менее 24 часов общего времени, из которых менее чем 1-2 часов тратится на обработку почек, а затем подсчет индивидуальных клубочков в экспериментальных животных. В противоположность этому метод дезсектора/фракционирования трудоёмкий, требующий, по оценкам, 15 часов работы (4-6 часов секционирования, 2-3 часов окрашивания и 4-5 часов подсчета времени) на почку, не включая 48-72 часов, необходимых для обработки почек в GL йкол метакрилы24. Из-за преимуществ стоимости и времени, метод кислотного мацерации особенно полезен в исследованиях, в которых оценки всего номера почки нефрона должны быть сделаны в большом количестве животных с или без генетических или фармакологических вмешательств. Как затраты, так и время, связанные с методом дезсектора/фракционирующих методов и магнитно-резонансной томографии, считались основным ограничивающим фактором в их внедрении в большинстве исследовательских лабораторий.
Наконец, метод кислотного мацерации обеспечивает оценку целого числа почек нефрон, которые сопоставимы с мерами с использованием более сложных методов, таких как магнитно-резонансная томография26. Например, использование катионного ферритина-маркировки клубочков и трехмерной обработки изображений для подсчета каждого нефрона в одной почке от крысы Спрэг-даули, магнитно-резонансная томография дала в среднем 34 000 индивидуальных клубочков per почки26. В non-catiонических ферритине-маркированные почки, магнитно-резонансная томография дала подсчитывает 2 000 нефрон-как структуры из-за подсчитывать non-клубочковой зоны почки с магнитными сигналами подобной величины и формы как ферритина-маркированные клубочков. Когда эти артефакты вычитаются из графов определяется катионических ферритина-помечены почек, эффективное число клубочков определяется, с помощью магнитно-резонансной томографии, ближе к 32 000 нефронов на почки26. В этом таком же изучении, эксперименты по валидации принесли средние клубочковой подсчитывает 31 000 в почку используя метод кислоты мацерация26. Таким образом, метод кислотного мацерации производит оценки номера целого почки нефрона, которые находятся в пределах < 5% от тех, которые определяются с использованием состоянии-оф-искусство методы, такие как магнитно-резонансной томографии.
Хотя есть несколько ключевых преимуществ, связанных с методом кислоты мацерации, следователи также должны быть осведомлены о ограничениях, связанных с этим методом. Одно из ограничений касается использования всей почки. Поскольку вся почка растворяется и однородна, информация о пространственном распределении клубочков внутри коры почки не может быть определена. Если знание внутриземного распределения клубочковой объема имеет важное значение, то использование магнитно-резонансной томографии будет лучше подходит метод.
По сравнению с другими методами использование метода кислотного мацерации, как представляется, слегка занижают общее число нефрона. Меньшие оценки скорее всего обусловлены, в частности, растворением небольшого процента клубочков в кислоте или во время мацерации почки. Кроме того, при старении или заболевании происходит потеря функциональных нефронов, которые, хотя и не способствуют формированию мочи, могут быть более чувствительны к кислотным мацерации и могут быть уничтожены во время обработки, что способствует снижению оценок общего нефрона Номер. Таким образом, уход должен использоваться при сборе и обработке почек, чтобы не оставлять почечную ткань в естественных условиях при рубке почки, или в шприцах при экструдинге образцов тканей. Однако в целом Недооценка общего числа нефрона из-за переработки тканей представляется относительно небольшой.
Поскольку подсчет клубочков с использованием метода кислотного мацерации является субъективным, занижение числа нефрона может также отражать предвзятость наблюдателя, которое может быть легко преодолено путем измерений, выполняемых двумя отдельными исследователями, ослепленными информацию о экспериментальных животных или состоянии. Если существует значительная озабоченность относительно того, что представляет собой клубочек, альтернативный подход будет включать вливая экспериментальных животных с оксидом железа до эвтаназии. Когда проникнуты внутривенно, оксид железа войдет и станет пойманным в ловушку в клубочек; Таким образом, обработанное клубочков должно запятнать темный черный, позволяющ для более большой идентификации клубочков подсчитывая30.
Метод кислотного мацерации оценивает целый ряд почек нефрона на основе измерения малых образцов (3 х 0,5 мл или 1,5 мл) в отличие от измерений всего раствора почки (50 мл). Метод кислотного мацерации очень воспроизводимых в природе, и клубочков рассчитывает в образцах одной почки и в экспериментальных группах оказались весьма последовательными. Кроме того, репрезентативные результаты, сообщенных в настоящем исследовании от дикого типа C57Bl/6 мышей и крыс, родившихся с одной почкой (рис. 2 и 3), сильно согласуются с предыдущими выводами, а также с диапазонами, о которых сообщалось ранее (Таблица 1 )5,31. При желании можно было бы легко произвести дополнительные измерения, чтобы лучше оценить общую численность нефрона на почку.
В то время как метод кислотного мацерации обеспечивает надежные и воспроизводимые оценки числа нефрона, этот метод не рекомендуется для получения измерений клубочковой объема, так как воздействие кислоты, скорее всего, производит изменения в объеме клубочков. Поскольку определение клубочковой тома имеет важное значение при определении всей площади почек клубочковой поверхности, рекомендуется, чтобы такие измерения были сделаны с использованием гистологических и стереологических методов24,25. В частности, стереологических методов, которые делают использование гликоль метакрилпоздней вставлять почки для того, чтобы ограничить отек тканей и расширение и, таким образом, поддерживать клубочковой геометрию как можно ближе к этому в естественныхусловиях.
Наконец, еще одним ограничением метода кислоты мацерации, и тот, который является общим для других методов оценки нефрон число, является то, что никакой информации о клубочковой функции (например, клубочковой фильтрации) может быть установлена от клубочков раз Обработаны. Таким образом, в то время как индивидуальные клубочков могут быть подсчитаны, его функциональный статус (формирование мочи или не-моча-формирование) не может быть определена с помощью метода кислоты мацерации. Аналогичным образом, нет продольной информации может быть установлена с помощью метода кислоты мацерации в отдельных мышей. Вместо этого, отдельные группы животных в различные временные точки должны получить представление об изменениях числа нефрона на протяжении жизни животного или пред-или постгенетическое или Фармакологическое вмешательство.
Таким образом, метод кислотного мацерации является недорогой, высокой пропускной способностью, и эффективный метод для оценки целого числа почечной нефрон. Метод мацерации кислоты обеспечивает высокую степень воспроизводимости, о чем свидетельствуют приведенные здесь два примера, а также те, о которых сообщалось ранее, используя этот метод18,19,20,21 , 22 -ое , 28. Хотя использование кислоты мацерации метод был описан для использования в мышь (и крысы), кислота мацерация метод также может быть масштабируется для использования в крупных видов, таких как собака и свинья27,32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана в части национальными институтами здоровья, национальное сердце, Лунг, и институт крови (R01HL107632).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
- Hall, J. E., Guyton, A. C. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 13th, Elsevier. Philadelphia, PA. (2016).
- Wang, X., Garrett, M. R. Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models. Physiological Genomics. 49 (3), 180-192 (2017).
- Didion, S. P. A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension. Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).
- Brenner, B. M. Nephron adaptation to renal injury or ablation. American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).
- Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension. Hypertension. 68, A052 (2016).
- Luyckx, V. A., Brenner, B. M. The clinical importance of nephron mass. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (6), 898-910 (2010).
- Mackenzie, H. S., Brenner, B. M. Fewer nephrons at birth: a missing link in the etiology of essential hypertension? American Journal of Kidney Diseases. 26 (1), 91-98 (1995).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes with the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Denic, A., et al. The substantial loss of nephrons in healthy human kidneys with aging. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 313-320 (2016).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 101-108 (2003).
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Hoy, W. E., et al. Distribution of volumes of individual glomeruli in kidneys at autopsy: association with age, nephron number, birth weight and body mass index. Clinical Nephrology. 74 (Suppl 1), S105-S122 (2010).
- Hughson, M. D., et al. Hypertension, glomerular hypertrophy and nephrosclerosis: the effect of race. Nephrology Dialysis Transplantation. 29 (7), 1399-1409 (2014).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2010).
- Brenner, B. M., Garcia, D. L., Anderson, S. Glomeruli and blood pressure. Less of one, more of the other? American Journal of Hypertension. 1 (4 Pt 1), 335-347 (1988).
- Clark, A. T., Bertram, J. F.
- Benz, K., et al. Early glomerular alterations in genetically determined low nephron number. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (2), F521-F530 (2011).
- Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
- Sims-Lucas, S., Caruana, G., Dowling, J., Kett, M. M., Bertram, J. F. Augmented and accelerated nephrogenesis in TGF-beta2 heterozygous mutant mice. Pediatric Research. 63 (6), 607-612 (2008).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Stelloh, C., et al. Prematurity in mice leads to reduction in nephron number, hypertension and proteinuria. Translational Research. 159 (2), 80-89 (2012).
- Galinsky, R., et al. Effect of intra-amniotic lipopolysaccharide on nephron number in preterm fetal sheep. American Journal of Physiology Renal Physiology. 301 (2), F280-F285 (2011).
- Bertam, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29 (4), 575-580 (2014).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Damadian, R. V., Shawayri, E., Bricker, N. S. On the existence of non-urine forming nephrons in the diseased kidney of the dog. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 65, 26-39 (1965).
- Bonvalet, J. P., et al. Number of glomeruli in normal and hypertrophied kidneys of mice and guinea-pigs. The Journal of Physiology. 269 (3), 627-641 (1977).
- Bains, R. K., Sibbons, P. D., Murray, R. D., Howard, C. V., Van Velzen, D. Stereological estimation of the absolute number of glomeruli in the kidneys of lambs. Research in Veterinary Science. 60 (2), 122-125 (1996).
- Assmann, K. J., van Son, J. P., Koene, R. A. Improved method for the isolation of mouse glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 944-946 (1991).
- Wang, X., et al. Nephron deficiency and predisposition to renal injury in a novel one-kidney genetic model. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1634-1646 (2015).
- Lodrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Fassi, A., et al. Progressive glomerular injury in the MWF rat is predicted by inborn nephron deficit. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (8), 1399-1406 (1998).
- Wintour, E. M., et al. Reduced nephron number in adult sheep, hypertensive as a result of prenatal glucocorticoid treatment. The Journal of Physiology. 549 (Pt 3), 929-935 (2003).
- Van Vuuren, S. H., et al. Compensatory growth of congenital solitary kidneys in pigs reflects increased nephron numbers rather than hypertrophy. PLoS One. 7 (11), e49735 (2012).
