Asit maserasyon yöntemini kullanarak tüm böbrek netron numarasının tahmini
Summary
Bütün böbrek netron sayısının tahminleri klinik ve deneysel olarak önemli olup, ne, sayısı ile böbrek ve kardiyovasküler hastalık riski arasında ters bir ilişki olduğu için. Burada, tüm böbrek netron sayısının hızlı ve güvenilir tahminlerini sağlayan asit maserasyon yönteminin kullanımı gösterilmiştir.
Abstract
Nephron bağış bir bireyin doğduğu toplam nefron sayısını ifade eder, insanlarda nefrogenit gebelik 36 hafta tarafından tamamlanmış ve yeni nefron Doğum sonrası oluşturulur. Netron numarası, Doğum sonrası zaman içinde herhangi bir noktada ölçülen nefron toplam sayısını ifade eder. Hem genetik hem de çevresel faktörler hem netron bağış hem de sayıyı etkiler. Daha düşük netron tedavisi veya sayısına sahip bireyler böbrek veya kardiyovasküler hastalık gelişimi açısından daha yüksek bir risk altında olduğu düşünülmektedir gibi belirli genler veya faktörlerin nefrogenik ve netron kaybı veya ölümü sürecini nasıl etkilediğini anlamak önemlidir. Bir kişinin ömür boyu boyunca çevresel pozlarının netron numarasını nasıl etkilediğini anlamak, gelecekteki hastalık riskinin belirlenmesinde de hayati önem taşır. Böylece, tüm böbrek netron numarasını hızlı ve güvenilir bir şekilde değerlendirmek yeteneği, nefrogenit veya netron kaybına katkı sağlayan veya teşvik eden mekanizmaları daha iyi anlamak için temel bir deneysel gerekliliktir. Burada, Damadian, Shawayri ve Bricker tarafından açıklanan prosedüre göre tüm böbrek netron numarasının tahmin edilmesi için asit maserasyon yöntemini tarif ediyoruz, hafif modifikasyonlar ile. Asit maserasyon yöntemi, daha gelişmiş, pahalı olsa da, manyetik rezonans görüntüleme gibi yöntemler kullanılarak Belirlenenlerin% 5 ‘ i içinde olan netron sayısının hızlı ve güvenilir tahminler (glomeruli sayma tarafından değerlendirilir) sağlar. Dahası, asit maserasyon yöntemi çok sayıda numune veya deneysel koşullarda ne, sayısını değerlendirmek için mükemmel bir yüksek verimlilik yöntemidir.
Introduction
Netron hem temel yapısal hem de böbrek1‘ in fonksiyonel birimidir. Yapısal olarak, netron Bowman kapsülü içinde bulunan glomerülden (kapiller ve podositler) ve böbrek tübülü oluşur, proksimal tübül oluşan, Henle döngü, ve toplama kanalına sona erer distal tubüs. Fonksiyonel olarak, netron rolü su ve elektrolit filtrasyon ve reemilimi ve atıkların salgılanmasını olduğunu. Genel olarak, nefrogenis tamamlanan 36 gebelik hafta insanlarda ve kısa bir süre sonra fare ve sıçan2gibi çeşitli türler doğumdan sonra. Nefron bağış, bir bireyin doğduğu toplam nefron sayısını ifade eder, zira netron sayısı her zaman Doğum sonrası3olarak ölçülen nefron toplam sayısıdır. Netron numarası ve glomerüler sayı terimi sıklıkla birbirinin yerine kullanılır. Çünkü netron başına sadece bir glomerülden vardır, glomerül numarasının değerlendirilmesi ne, sayısı tahmin için önemli bir vekil olduğunu.
Netron bağış ve netron sayısının değerlendirilmesi, klinik ilginin değerlendirilmesinin netron bağış ve azalmış netron numaraları arasında bir ilişki gösterdiği gibi kardiyovasküler hastalığın daha fazla görülme sıklığı4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. otopsi sırasında böbreklerdeki bulgulara dayanarak, Brenner hipertansif bireylerin normotensif bireyler16daha düşük toplam nefron sayısı ile sunulan görüldü. Böylece, Brenner ne, sayısı ve daha sonra yaşam içinde hipertansiyon gelişimi riski arasında ters bir ilişki olduğunu hipotez. Brenner aynı zamanda, netron sayısında bir azalma olan nöfrisi tarafından telafi edildiğini hipotez. Böbrek normal filtrasyon hızını korumak için, kalıntı nefron onların glomerüler yüzey alanını artırarak telafi (glomerüler hipertrofisi), böylece Renal fonksiyon netron kaybı herhangi bir olumsuz etkisini azaltmak için çalışıyor4 ,16.
Kısa vadede koruyucu iken, glomerüler hipertrofisi, uzun vadede, artan sodyum ve sıvı tutma yol açar, artan ekstrellüler sıvı hacmi, ve arter kan basıncında artar, daha fazla artan bir kısır döngüye yol glomerüler kapiller basıncı, glomerüler Hiperfiltrasyon ve netron skarlık (skleroz) ve yaralanma4,16.
Tahminlerin veya netron numarasının sayılarının alınması, birkaç deneysel avantaj sunar: 1) nefrogenit süreci ile ilgili bilgi sağlar, bu da embriyo veya maternal-fetal ortamda belirli genler veya faktörlerle bağlantılı olabilir ve 2) kalp-damar hastalığı olan bir ne, sayısı ilişkisi vardır ve böylece, ne, sayısının tahminlerinin gelecekteki kardiyovasküler riski tahmin etmek için kullanılabileceği potansiyeli vardır2,17,18, 19 , 20 tane , 21 , 22. maternal-fetal çevreye ek olarak, çeşitli hastalıklar doğrudan netron numarası ve böbrek fonksiyonunu etkiler, ateroskleroz dahil, diyabet, hipertansiyon, ve hatta normal yaşlanma2,9, 10,11,12,22,23. Bu nedenle, tüm böbrek netron sayısının değerlendirilmesi, bir kişinin hayatı boyunca nefrogeninin (i.e.netron Endowment) ve netron numarasını etkileyen genetik ve çevresel faktörleri ve ortaya çıkan etkileri anlamak önemlidir böbrek fonksiyonu ve kardiyovasküler sağlık üzerinde.
Şu anda, her biri kendi avantajları ve sınırlamaları24,25,26,27,28 olan netron numarasının belirlenmesi ve ölçülmesine yönelik çeşitli yöntemler mevcuttur ,29,30. Tüm böbrek netron sayısını belirlemek için sofistike Yöntemler, disloji/fraksiyoncu yöntemi ve manyetik rezonans görüntüleme25,26gibi stereolojik yöntemler içerir. Genellikle tüm böbrek ne, sayısını belirlemek için altın standardı olarak kabul, disasyon/fraksiyoncu yöntemi hem pahalı hem de zaman alıcı. Manyetik rezonans görüntüleme ve işlemede son gelişmeler ve iyileştirme, her netron bireysel olarak saymak için Araçlar sağladı. Ancak, manyetik rezonans görüntüleme sadece zaman alıcı değil, aynı zamanda son derece pahalıdır. Buna ek olarak, hem disasyon/fraksiyoncu yöntemi hem de manyetik rezonans görüntüleme, gelişmiş teknik uzmanlık gerektirir, böylece araştırma laboratuvarlarının çoğunda bu tür yöntemlerin kullanımını kısıtlamaktadır.
Ne, sayısının belirlenmesinde çoğu Yöntem, glomerüllerin tanımlanmasını temel alarak sayar veya tahminler yapar, böylece yapısal olarak kolayca tanımlanabilir. Bu yazıda tüm böbreklerde ne, sayısını tahmin etmek için asit maserasyon yöntemi tarif edilir ve27‘ dir. Asit maserasyon yöntemi hızlı, güvenilir ve diğer yöntemlerden daha az pahalıdır, örneğin disik/fraksiyoncu yöntemi ve manyetik rezonans görüntüleme gibi. Dahası, asit maserasyon yöntemi, manyetik rezonans görüntüleme26kullanılarak belirlenen aralıktaki içinde olduğu bildirilmiştir netron numarasının son derece tekrarlanabilir tahminler sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
İyi deneysel teknikle, asit maserasyon yöntemi tüm böbreklerde netron numarasını tahmin etmek için idealdir. Böbrek asit içinde çözünmüş olsa da, glomerül büyük ölçüde bozulmamış kalır ve kolayca tanımlanabilir, bireysel glomerül sayımı nispeten kolay ve basit hale. Asit maserasyon tekniği özellikle çeşitli nedenlerle avantajlıdır. İlk olarak, asit maserasyon yöntemi gider ve fiziksel çaba açısından nispeten az gerektiren hızlı ve kullanışlı bir yöntemdir. Asit maserasyon yön…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (R01HL107632) tarafından kısmen destekleniyordu.
Materials
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
- Hall, J. E., Guyton, A. C. . Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , (2016).
- Wang, X., Garrett, M. R. Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models. Physiological Genomics. 49 (3), 180-192 (2017).
- Didion, S. P. A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension. Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).
- Brenner, B. M. Nephron adaptation to renal injury or ablation. American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).
- Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension. Hypertension. 68, A052 (2016).
- Luyckx, V. A., Brenner, B. M. The clinical importance of nephron mass. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (6), 898-910 (2010).
- Mackenzie, H. S., Brenner, B. M. Fewer nephrons at birth: a missing link in the etiology of essential hypertension?. American Journal of Kidney Diseases. 26 (1), 91-98 (1995).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes with the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Denic, A., et al. The substantial loss of nephrons in healthy human kidneys with aging. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 313-320 (2016).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 101-108 (2003).
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Hoy, W. E., et al. Distribution of volumes of individual glomeruli in kidneys at autopsy: association with age, nephron number, birth weight and body mass index. Clinical Nephrology. 74 (Suppl 1), S105-S122 (2010).
- Hughson, M. D., et al. Hypertension, glomerular hypertrophy and nephrosclerosis: the effect of race. Nephrology Dialysis Transplantation. 29 (7), 1399-1409 (2014).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2010).
- Brenner, B. M., Garcia, D. L., Anderson, S. Glomeruli and blood pressure. Less of one, more of the other?. American Journal of Hypertension. 1 (4 Pt 1), 335-347 (1988).
- Clark, A. T., Bertram, J. F. Molecular regulation of nephron endowment. American Journal of Physiology. 276 (4 Pt 2), F485-F497 (1999).
- Benz, K., et al. Early glomerular alterations in genetically determined low nephron number. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (2), F521-F530 (2011).
- Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
- Sims-Lucas, S., Caruana, G., Dowling, J., Kett, M. M., Bertram, J. F. Augmented and accelerated nephrogenesis in TGF-beta2 heterozygous mutant mice. Pediatric Research. 63 (6), 607-612 (2008).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Stelloh, C., et al. Prematurity in mice leads to reduction in nephron number, hypertension and proteinuria. Translational Research. 159 (2), 80-89 (2012).
- Galinsky, R., et al. Effect of intra-amniotic lipopolysaccharide on nephron number in preterm fetal sheep. American Journal of Physiology Renal Physiology. 301 (2), F280-F285 (2011).
- Bertam, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29 (4), 575-580 (2014).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Damadian, R. V., Shawayri, E., Bricker, N. S. On the existence of non-urine forming nephrons in the diseased kidney of the dog. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 65, 26-39 (1965).
- Bonvalet, J. P., et al. Number of glomeruli in normal and hypertrophied kidneys of mice and guinea-pigs. The Journal of Physiology. 269 (3), 627-641 (1977).
- Bains, R. K., Sibbons, P. D., Murray, R. D., Howard, C. V., Van Velzen, D. Stereological estimation of the absolute number of glomeruli in the kidneys of lambs. Research in Veterinary Science. 60 (2), 122-125 (1996).
- Assmann, K. J., van Son, J. P., Koene, R. A. Improved method for the isolation of mouse glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 944-946 (1991).
- Wang, X., et al. Nephron deficiency and predisposition to renal injury in a novel one-kidney genetic model. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1634-1646 (2015).
- Lodrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Fassi, A., et al. Progressive glomerular injury in the MWF rat is predicted by inborn nephron deficit. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (8), 1399-1406 (1998).
- Wintour, E. M., et al. Reduced nephron number in adult sheep, hypertensive as a result of prenatal glucocorticoid treatment. The Journal of Physiology. 549 (Pt 3), 929-935 (2003).
- Van Vuuren, S. H., et al. Compensatory growth of congenital solitary kidneys in pigs reflects increased nephron numbers rather than hypertrophy. PLoS One. 7 (11), e49735 (2012).
