Summary
对整个肾肾的估计在临床和实验上都很重要, 因为肾周数与肾脏和心血管疾病的风险增加之间存在反比关系。在此, 说明了酸浸渍法的应用, 该方法为整个肾肾数目提供了快速可靠的估计。
Abstract
肾禀赋是指一个人出生时的肾总数, 因为人类的肾生成在怀孕36周后完成, 出生后没有形成新的肾。肾数是指出生后任何时间测量的肾总数。遗传和环境因素都影响肾的禀赋和数量。了解特定的基因或因素如何影响肾生成和肾功能丧失或死亡的过程很重要, 因为肾天赋或数量较低的个体被认为患肾脏或心血管疾病的风险较高。了解一个人一生中的环境接触如何影响肾数, 对于确定未来的疾病风险也至关重要。因此, 快速可靠地评估整个肾肾数目的能力是一个基本的实验要求, 以更好地了解有助于或促进肾生成或肾肾丢失的机制。在这里, 我们描述了酸浸渍方法的整个肾肾数的估计基础上的程序描述的达马迪安, 沙韦里和布里克, 稍作修改。酸浸渍方法提供了快速和可靠的估计肾数 (评估计数肾小球), 是5% 的那些确定使用更先进的, 虽然昂贵的方法, 如磁共振成像。此外, 酸浸渍法是一种很好的高通量方法, 用于评估大量样品或实验条件下的肾数。
Introduction
肾既是肾脏的基本结构单位, 也是肾1的功能单位。在结构上, 肾由位于鲍曼胶囊内的肾小球 (毛细血管和足细胞) 和肾小管组成, 由近端小管、亨勒的环状和终止到收集管道中的远端小管组成。在功能上, 肾的作用是过滤和再吸收水和电解质以及废物的分泌。一般来说, 肾生成是在人类怀孕36周时完成的, 在出生后不久就在老鼠和老鼠2等几个物种中完成.肾禀赋是指一个人出生时的肾总数, 而肾数是出生后任何时候测量的肾的总数 3.肾素数和肾小球数这一术语经常互换使用。由于每个肾只有一个肾小球, 肾小球数的评估是估计肾数目的重要替代因素。
对肾育和肾数的评估具有临床意义, 因为研究表明, 肾原禀赋与心血管疾病发病率增加的肾数减少之间存在联系 , 6,7,8,9,10, 11, 12,13,14,15. 根据尸体解剖时的肾脏调查结果, brenner 观察到, 高血压个体的肾总数低于正常人16。因此, 布伦纳假设, 肾数与以后患高血压的风险之间存在反比关系。布伦纳还推测, 肾数的减少是由剩下的肾补偿的。为了保持肾脏的正常过滤速率, 残留的肾通过增加肾小球表面积 (肾小球肥大) 来补偿, 从而减轻肾功能丧失的 任何不利影响4,16。
虽然在短期的保护, 肾小球肥大, 在长期, 导致钠和液体的保留增加, 细胞外液体体积增加, 并增加动脉血压, 导致恶性循环的进一步增加肾小球毛细血管压力、肾小球超滤、肾小球疤痕 (硬化症) 和损伤4,16。
获取肾数的估计或计数提供了几个实验优势: 1) 它提供了有关肾生成过程的信息, 然后可以与胚胎或母婴环境中的特定基因或因素联系在一起; 2)有一个与心血管疾病的联系, 因此, 有可能是肾数的估计可以用来预测未来的心血管风险2,17, 18,19,20,21,22. 除了母婴环境外, 还有几种疾病直接影响肾数目和肾功能, 包括动脉粥样硬化、糖尿病、高血压, 甚至正常衰老2, 9, 10、11、12、22、23。因此, 对整个肾肾肾数的评估对于了解影响肾生成 (即肾后代禀赋) 的遗传和环境因素以及一个人一生中的肾数及其产生的影响都很重要对肾功能和心血管健康的影响。
目前, 有几种方法可用于确定和量化肾数, 每种方法都有其各自的优点和局限性 24、25、26、27、28 ,29,30。确定整个肾肾肾数的复杂方法包括立体方法, 如分解分门器方法和磁共振成像25,26。通常被认为是确定整个肾肾数的黄金标准, 分解器法既昂贵又耗时。最近在磁共振成像和处理方面的进展和改进为单独计算每一个肾提供了工具。然而, 磁共振成像不仅耗时, 而且极其昂贵。此外, 部门分动仪方法和磁共振成像都需要先进的技术专长, 从而限制了大多数研究实验室使用这种方法。
大多数确定肾素数量的方法都是根据肾小球的识别来计算或估计的, 因为它们在结构上很容易被识别。本文介绍并论证了测定全肾肾数目的酸浸渍方法.酸浸渍法快速、可靠, 比其他方法、分解分馏塔法、磁共振成像法、方法便宜得多。此外, 酸浸渍法提供了高度可重复的估计肾数, 据报告, 这些肾数在使用磁共振成像26确定的范围内。
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Protocol
下面列出的用品和试剂是用来测定一只老鼠的整个肾肾号码, 即两个肾脏。用星号表示了对大鼠使用酸浸渍法的改进。所有实验规程都符合国家实验室动物护理和使用健康研究所的规定, 并得到了密西西比大学医学中心动物护理和使用机构委员会的批准。
1. 肾隔离程序
- 称重小鼠 (或其他物种) 并使用异氟醚对其进行安乐死 (5%-8%)过量或戊巴比妥 (150 mg/kg 腹腔内注射)。
- 一旦老鼠被安乐死, 用精细的手术剪刀沿着中线打开它的腹腔。
- 小心地将肠道和生殖脂肪抬到腹腔的右侧。通过严重解剖, 隔离左肾。使用精细的手术剪刀, 切断左肾动脉和静脉, 并小心地取出左肾, 把肾脏适当标记 (小鼠数字标识符) 称重船含有磷缓冲盐水 (PBS)。
- 对正确的肾脏重复该过程。
- 将每个肾脏从其各自的称重船中取出, 并将其放置在用 PBS 预先润湿的外科纱布上。
- 将肾脏留在手术纱布上, 迅速切除任何粘附的非肾脏组织 (如肾周脂肪或肾上腺), 然后取出肾胶囊。分别称重每个肾脏, 在实验室笔记本中分别记录左、右肾的重量。
2. 均质化、孵化和培训程序
- 一旦每个肾脏被称重, 将 PBS 的每艘称重船排出, 并将肾脏放回贴有适当标签的称重船中。使用干净的剃须刀片, 将肾脏切成两半, 纵向。将每个肾脏的一半朝下, 并将每半切割成2毫米或更小的碎片。
- 使用相同的剃须刀片, 仔细收集切碎的肾块, 并将其放入标记为15毫升的锥形管 (小鼠数字标识符; 左肾与右肾)。
- 对相反的肾脏重复这个过程, 使用新的剃须刀片。将切碎的肾脏放入单独标记的15-mL 锥形管中。
- 在通风良好的烟罩中, 在每个15-mL 锥形管中加入5毫升6M 盐酸 (HCl)。
- 将盖更换为锥形管, 轻轻搅拌肾阴间混合物, 并将15-mL 锥形管放入37°c 设置的预热水浴中 90分钟 (* 大鼠肾脏 120分钟)。
- 在孵育过程中每隔15分钟对每个15毫升管进行一次简单搅拌, 以确保所有组织都暴露在 HCl 酸中。
- 将18-G 针头插入5-mL 注射器 (* 10 毫升大鼠注射器), 并小心取出注射器柱塞。将注射器放入50毫升锥形管 (管 #1) 的烟罩中。
- 从水浴中取出肾/hcl 溶液, 将组织溶液倒入注射器的开口端, 并将15毫升锥形管放在试管架上。小心更换柱塞, 慢慢推动柱塞, 以便通过针头挤出溶液并进入管 #1。
- 用5毫升的 PBS 溶液清洗15-mL 锥形管。在15-mL 锥形管中旋转 PBS, 以溶解任何剩余的肾脏组织。
- 再次, 小心地从包含18-G 针的5毫升注射器上取出柱塞, 并将装药从15-mL 锥形管中倒入注射器的开口端。小心地更换柱塞, 然后轻轻推入柱塞, 进入管 #1, 冲洗注射器。重复此过程 2倍 (总共执行 3倍)。
- 将 21 g 针插入新的5-mL 注射器 (* 10 毫升大鼠注射器), 并小心取出注射器柱塞。将注射器与 21 g 针连接到一个新的50毫升锥形管 (管 #2)。
- 将 #1 的管中的内容物倒进含有 21 g 针头的注射器的开口端。小心插入柱塞并冲洗注射器, 轻轻按下注射器柱塞, 将挤出的溶液放入管中 #2。
- 用5毫升的 PBS 溶液清洗管 #1。在管 #1 中旋转 PBS, 以溶解任何剩余的肾脏组织。
- 再次, 小心地从含有18-G 针头的5毫升注射器上取出柱塞, 然后将内装物从管中 #1 倒进注射器的开口端。小心地更换柱塞, 然后通过轻轻推倒柱塞冲洗注射器, 将溶液挤出到管中 #2。重复此过程 2倍 (总共执行 3倍)。
- 通过添加额外的 PBS, 使管道 #2 的总体积达到50毫升, 最高可达管 #2 上的50毫升线。
- 将 #2 的输卵管, 将肾脏组织溶液放在冰箱内的摇杆上, 在 4°C (至少8-10 小时) 的摇杆上。
3. 肾小球计数和肾素数外推
- 从冰箱中取出管 #2, 并通过多次轻轻倒置管, 重新悬浮颗粒组织, 以创建一个均匀的溶液。我们建议在加工后在5d 范围内计数肾小球。
- 小心地将500μl 的肾脏溶液放入12孔板的单井中。重复这个 2倍, 把每个放在一个单独的井里, 这样每个肾就有三口井的肾脏溶液, 进行一式两份分析。
- 在含有肾脏溶液的三口井中, 每口都加入500μl 的 PBS, 进行1:1 稀释。
- 使用倒置显微镜, 计算每口井的肾小球数。计数是通过使用放置在每口井底部的16个单独部分的网格来帮助进行计数的。计算每个网格部分的肾小球数, 然后对每个网格的计数进行求和, 以获得每口井的肾小球总数。肾小球很容易通过其球状结构来识别。其他识别资料包括由于充血毛细血管而产生的红色, 以及仍然附着在个别肾小球体上的前或动脉后 (图 1)。
- 添加三个井中每一口井的肾小球总数, 然后将每500μl 的肾溶液的肾小球平均数除以三个。如果每口井肾小球平均数量的方差大于 10%, 请重复肾计数程序, 密切关注肾脏溶液的均匀性。将每井计算的肾小球数乘以 100, 以计算每个肾肾小球的平均数量。肾总数可以表示每个肾脏或, 使用肾脏重量, 每毫克或克的组织。
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Representative Results
以下是来自高血压的既定小鼠模型和与年龄有关的慢性肾病的遗传大鼠模型的全肾肾数的代表性估计。肾小球的关键识别特征, 如有或没有附着在动脉前或动脉后或管状结构的球形结构, 突出显示了那些新的酸浸渍方法 (图 1)。
在第一个实验例子中, 在注入车辆 (盐水) 或血管紧张素 II 的小鼠 (雄性 c57bl6, 6周) 中, 确定了总肾数, 为期14天。在车载小鼠中, 用酸浸渍法测定的每个肾肾的肾数为 12 411±248.这些估计数与以前在小鼠中报告的整个肾肾尼数的范围一致 (表 1)。血管紧张素在输注14天后增加了约40毫米汞柱的心房压力, 并与肾数目 (每个肾 9, 122±193个肾) 显著减少近26% 有关 (图 2)。这些数据表明, 血管紧张素 II. 输液不仅与高血压有关, 而且, 肾数目的显著减少与硬化症或肾小球损伤引起的肾丢失有关。
在第二个实验实例中, 证实了先前在肾发育遗传大鼠模型中的肾数, 即单侧肾发育 (HS形式) 大鼠的异质种群衍生模型。HSLA 模型显示肾脏和泌尿道缺陷的不完全穿透表型, 一些动物出生正常 (有两个肾脏), 另一些动物出生时只有一个肾。在出生时有两个肾脏 (男性 Ha-storntrol; 12周) 的大鼠中, 使用酸浸渍法的肾数目估计为每个肾脏 27, 288±336个肾 (图 3)。相反, 在出生时拥有单肾 (雄性 hA-Solitary; 4周) 的老鼠中, 每肾 24 594 ±883个肾的估计数明显较低 (图 3)。对这些样本中的肾数的估计数也与大鼠以前报告的范围一致 (表 1)。请注意, 这些数据与先前的发现一致, 在这些研究中, ha-独身大鼠的肾功能减少, 或数量 (与一个对照肾脏相比) 最有可能反映与出生相关的潜在遗传因素与一个单独肾脏31。
图 1: 肾小球的关键标识符, 用于计算和评估整个肾肾的数量.正如箭头所表明的那样, 肾小球很容易通过其球状结构来识别。其他标识符包括由于充满血液的毛细血管而产生的红色, 以及在处理后可能仍附着在单个肾小球体上的前或动脉后 (或小管) (如在这一底部确定的区域静脉)显微镜)。这张图片中还有小管和血管的残余。放大倍率 = 10倍;刻度栏 = 100μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 在老鼠身上数肾.(A) 用倒置显微镜观察到, 在12井培养板的22.1 毫米平底井中, 单个小鼠肾的肾小球的代表性图像。肾小球和肾小管在中等密度时被两个因子 (0.5 mL 的肾脏溶液加 0.5 mL 的 1x PBS) 稀释。(B) 经肾小球计数评估, 14天的车辆或血管紧张素 ii. 输注对雄性 C57Bl/6 小鼠肾数目的影响。血管紧张素 II. 输注在 1, 000 ngggp/min (通过渗透小泵) 与高血压有关, 与注入车辆的小鼠的肾数目相比, 肾数目明显减少。在车载小鼠中, 肾素数量与先前报告的小鼠肾素数量估计一致 (表 1)。车辆: n = 3, 血管紧张素 ii.: n = 3,* p < 0.05。错误条 = SE. 放大倍率 = 4X;刻度栏 = 250 微米. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 3: 在老鼠身上数钱.(A) 用倒置显微镜观察到, 在12井培养板22.1 毫米平底井中, 单个大鼠肾脏的肾小球的代表性图像。与小鼠相比, 肾小球和肾小管的密度要高得多。(B) 对 hsra-控制和 hsra-s 大鼠的肾素数进行了量化, 表明 hsra-s 大鼠的肾素数低于 HSRA-C 大鼠, 与本模式31中以前的调查结果一致。HSRA-C, 出生时的老鼠有两个肾: n = 3;HSR7-S, 出生时的老鼠, 肾孤独: n = 3,* p & lt;0.05。错误条 = SE. 放大倍率 = 4X;刻度栏 = 250 微米. 请点击此处查看此图的较大版本.
| 物种 | 每肾的肾龙号码 | 参考 |
| 鼠标 | 9000-21000 | 18-22, 28 |
| 大 鼠 | 13, 000-27, 000 | 31, 33 |
| 羊 | 20000-800 000 | 23, 29, 34 |
| 猪 | 16000-4600000 | 32, 35 |
| 人类 | 500 000-2000 000 | 8-15 |
表 1: 若干物种中报告的肾数目范围。
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Discussion
酸浸渍法具有良好的实验技术, 是评价全肾肾数目的理想方法。虽然肾脏溶解在酸中, 肾小球在很大程度上保持完整, 很容易识别, 使单个肾小球的计数相对容易和直接。酸浸渍技术特别有利, 原因有几个。首先, 酸浸渍法是一种快速方便的方法, 在费用和体力方面所需的工作量相对较小。执行酸浸渍方法所需的所有试剂和消耗品在大多数基本实验室都很容易获得, 唯一的主要要求是获得倒置显微镜进行肾小球计数。在费用方面, 据估计, 酸浸渍方法每只动物只需几百美元, 与磁共振成像等与其他肾小球计数方法相关的费用相比, 成本并不高,每只动物扫描时间和技术专长可达数千美元。
其次, 与其他全肾肾肾数方法 (如分门组法24) 相比, 酸浸渍法的组织处理时间明显较少。从开始到结束, 酸浸渍方法需要不到24小时的总时间, 其中少于1-2小时的时间用于处理肾脏, 然后计算每个实验动物的个别肾小球。相反, 分解器方法是劳动密集型的, 需要对肾脏进行约15小时的分娩 (4-6小时的切片、2-3小时的染色和4-5小时的计数时间), 不包括处理 gl 中肾脏所需的 labor-intensive。甲基丙烯酸乙酯24。由于成本和时间的优点, 酸浸渍法特别有用的研究, 其中整个肾肾的数量估计需要在大量的动物有或没有遗传或药理干预。在大多数研究实验室中, 分解分动仪法和磁共振成像所涉及的成本和时间都被认为是一个主要的限制因素。
最后, 酸浸渍法提供了整个肾肾肾数的估计, 可与使用更复杂的方法 (如磁共振成像26)的测量结果相媲美。例如, 利用阳离子铁素肾小球标记和三维图像处理来计算 Sprague-Dawley 大鼠单个肾脏中的每一个肾, 磁共振成像的平均计数为每只 34, 000 人个体肾小球肾脏26。在非阳离子铁蛋白标记肾脏中, 磁共振成像产生了 2, 000个肾样结构的计数, 原因是计算了肾脏的非肾小球区域, 其磁信号的大小和形状与铁蛋白标记的肾小球相似。当这些伪影从阳离子铁蛋白标记肾脏确定的计数中减去时, 利用磁共振成像技术确定的肾小球的有效数量接近每个肾脏 32, 000个肾.在同一项研究中, 验证实验使用酸浸渍法26得出了每个肾平均肾肾 31, 000 的肾小球计数。因此, 酸浸渍法产生的整个肾肾的估计数 < 5% 的那些确定使用最先进的技术, 如磁共振成像。
虽然酸浸渍法有几个关键的优点, 但研究者也应该意识到与这种方法相关的局限性。其中一个限制涉及整个肾脏的使用。由于整个肾脏的溶解和同质化, 有关肾皮质内肾小球的空间分布的信息无法确定。如果知道肾小球体积的肾内分布很重要, 那么使用磁共振成像将是一个更合适的方法。
与其他方法相比, 酸浸渍法的使用似乎略微低估了总的肾数。较小的估计可能是由于在酸中或在肾脏浸渍过程中溶解一小部分肾小球造成的。此外, 随着年龄的增长或疾病, 功能肾的损失, 这虽然不有助于尿液的形成, 可能对酸浸渍更敏感, 并可能在加工过程中销毁, 从而导致对总肾的估计较低数量。因此, 在采集和处理肾脏时, 应注意, 以免在切割肾脏时将任何肾脏组织留在体内, 或在挤出组织样本时留在注射器中。然而, 总体而言, 由于组织加工而低估的肾总数似乎相对较少。
由于使用酸浸渍法计算肾小球是主观的, 对肾素数量的低估也可能反映观察者的偏差, 这很容易通过两个不同的调查人员的测量来克服。有关实验动物或条件的信息。如果对什么是肾小球有重大的关注, 另一种方法是在安乐死之前给实验动物注入氧化铁。当静脉注射时, 氧化铁会进入并被困在肾小球中;因此, 加工后的肾小球应染黑黑色, 以便在计数30时更容易识别肾小球。
酸浸渍法根据对小样本 (3 x 0.5 mL 或 1.5 mL) 的测量来估计整个肾肾的数量, 而不是对肾脏的整个溶液 (50 毫升) 的测量。酸浸渍法在本质上是高度可重复的, 单肾样品内和实验组内的肾小球计数被发现是高度一致的。此外, 本研究报告的野生型 c57bl过来的有代表性的小鼠和出生时只有一个肾的老鼠 (图 2和3) 与以前的研究结果以及以前报告的范围非常一致 (表 1)。)5,31。如果需要, 可以很容易地进行额外的测量, 以更好地估计每个肾脏的肾总数。
虽然酸浸渍技术提供了可靠和可重复的估计肾的数量, 这种方法不建议用于获得肾小球体积的测量, 因为暴露于酸很可能会产生肾小球体积的变化。由于肾小球体积的测定对确定整个肾小球表面积很重要, 因此建议采用组织学和立体学方法24、25 进行这种测量。特别是, 利用甲基丙烯酸乙二醇酯嵌入肾脏的立体方法, 以限制组织肿胀和扩张, 从而保持肾小球几何尽可能接近于在体内。
最后, 酸浸渍技术的另一个局限性, 也是其他评估肾素数的方法所常见的限制, 是一次无法从肾小球中确定有关肾小球功能的信息 (如肾小球滤过率)处理。因此, 虽然单个肾小球可以计算在内, 但其功能状态 (尿酸形成或非尿酸形成) 不能使用酸浸渍法确定。同样, 在单个小鼠身上也无法确定纵向信息。相反, 需要在不同的时间点对不同时间点的单独动物群体进行深入了解, 即动物寿命或遗传前或遗传或药理干预中肾素数量的变化。
总之, 酸浸渍法是一种低成本、高通量、高效的全肾肾数估计方法。酸浸渍方法提供了高度的重现性, 这里介绍的两个例子以及以前报告使用这种方法的例子 18,19,20,21就证明了这一点。,22,28. 虽然描述了在小鼠 (和大鼠) 中使用酸浸渍法的情况, 但酸浸渍法也可以扩大用于较大物种, 如狗和猪27,32。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院、国家心脏、肺和血液研究所 (R01HL107632) 的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
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