Summary
As estimativas do número inteiro do nephron do rim são importantes clìnica e experimentalmente, porque há uma associação inversa entre o número do nephron e um risco aumentado de doença renal e cardiovascular. Nisto, o uso do método ácido da maceração, que fornece estimativas rápidas e de confiança do número inteiro do nephron do rim, é demonstrado.
Abstract
O investidura de nephron refere o número total de néfrons um indivíduo é carregado com, porque o nefrogênese nos seres humanos é terminado por 36 semanas da gestação e nenhum néfrons novo é dado forma ao borne-nascimento. O número de néfron refere-se ao número total de néfrons medidos em qualquer momento pós-parto. Tanto os fatores genéticos quanto os ambientais influenciam tanto a investidura de néfron quanto o número. Entender como genes ou fatores específicos influenciam o processo de nefrogênese e perda ou morte de néfron é importante, já que indivíduos com menor investidura ou número de néfron são pensados para estarem em maior risco de desenvolver doenças renais ou cardiovasculares. Compreender como as exposições ambientais no decorrer da vida de uma pessoa afeta o número de néfron também será vital para determinar o risco de doença futuro. Assim, a capacidade de avaliar o número de néfron de rim inteiro de forma rápida e confiável é um requisito experimental básico para compreender melhor os mecanismos que contribuem para ou promovem a nefrogênese ou perda de néfron. Aqui, nós descrevemos o método ácido da maceração para a estimativa do número inteiro do nephron do rim baseado no procedimento descrito por Damadian, por Shawayri, e por Bricker, com modificações ligeiras. O método de maceração ácida fornece estimativas rápidas e confiáveis do número de néfron (conforme avaliado pela contagem de glomérulos) que estão dentro de 5% daqueles determinados usando métodos mais avançados, embora caros, como a ressonância magnética. Além disso, o método de maceração ácida é um excelente método de alta taxa de transferência para avaliar o número de néfron em grandes quantidades de amostras ou condições experimentais.
Introduction
O nephron é a unidade estrutural básica e funcional do rim1. Estruturalmente, o nephron consiste no glomérulo (capilares e podocytes) situados dentro da cápsula de Bowman e do túbulo renal, consistindo no túbulo proximal, no laço de Henle, e no túbulo longe do ponto de origem que termina no duto de coleta. Funcionalmente, o papel do nephron é a filtração e a reabsorção de água e eletrólitos e a secreção de resíduos. Em geral, a nefrogênese é concluída em 36 semanas de gestação em seres humanos e logo após o nascimento em várias espécies, como o rato e o rato2. A investidura de nephron refere-se ao número total de néfrons que um indivíduo nasce com, enquanto o número de néfron é o número total de néfrons medidos a qualquer momento pós-parto3. O termo número de néfron e número glomerular são freqüentemente usados alternadamente. Porque há somente um glomérulo por o nephron, a avaliação do número dos glomérulos é um substituto importante para estimar o número do nephron.
A avaliação da investidura de néfron e do número de néfron é de interesse clínico, pois estudos demonstraram uma associação entre a investidura de néfron e os números de nefrons reduzidos com uma incidência aumentada de doença cardiovascular4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. com base nos achados em rins na autópsia, Brenner observou que os hipertensos apresentavam um número total menor de néfrons do que indivíduos normotensos16. Assim, Brenner hipótese que há uma relação inversa entre o número do nephron e o risco de desenvolver a hipertensão mais tarde na vida. Brenner igualmente supor que uma redução no número do nephron estêve compensada para pelos néfrons que remanesceu. A fim de manter a taxa de filtração normal no rim, os nefrons residuais compensam aumentando sua área de superfície glomerular (hipertrofia glomerular), assim trabalhando para mitigar todo o efeito adverso da perda do nephron na função renal4 ,16.
Enquanto protetora no curto prazo, a hipertrofia glomerular, a longo prazo, leva ao aumento da retenção de sódio e fluidos, aumento do volume do fluido extracelular, e aumentos na pressão arterial, levando a um ciclo vicioso de aumentos adicionais em pressão capilar glomerular, hiperfiltração glomerular e cicatriz de néfron (esclerose) e lesão4,16.
A obtenção de estimativas ou contagens de número de néfron oferecem algumas vantagens experimentais: 1) fornece informações sobre o processo de nefrogênese, que pode então ser ligada a genes ou fatores específicos no embrião ou no ambiente materno-fetal, e 2) Há uma associação do número de nephron com doença cardiovascular e, assim, há o potencial que as estimativas do número do nephron poderiam ser usadas para prever o risco cardiovascular futuro2,17,18, 19 anos de , 20 anos de , 21 anos de , 22. além do ambiente materno-fetal, várias doenças impactam diretamente o número de néfron e a função renal, incluindo aterosclerose, diabetes, hipertensão, e até mesmo o envelhecimento normal2,9, 10,11,12,22,23. Assim, a avaliação do número de nephron do rim inteiro é importante compreender ambos os fatores genéticos e ambientais que afetam o nefrogênese (istoé, o Endowment do nephron) e o número do nephron sobre o curso da vida de uma pessoa e os efeitos resultantes sobre a função renal e a saúde cardiovascular.
Atualmente, existem vários métodos disponíveis para a determinação e quantificação do número de nefrons, cada um com suas próprias vantagens e limitações24,25,26,27,28 ,29,30. Métodos sofisticados para determinar o número de nefrons renais inteiros incluem métodos estereológicos, como o método do dissector/fraccionador, e a ressonância magnética25,26. Considerado frequentemente o ouro-padrão para determinar o número inteiro do nephron do rim, o método do dissector/fractionator é caro e demorado. Os avanços e a melhoria recentes na imagem latente e no processamento de ressonância magnética forneceram as ferramentas para contar cada um e cada nephron individualmente. Entretanto, a imagem latente de ressonância magnética é não somente demorada mas igualmente extremamente cara. Além disso, tanto o método do dissector/fraccionador como a ressonância magnética requerem conhecimentos técnicos avançados, limitando assim o uso de tais métodos na maioria dos laboratórios de pesquisa.
A maioria de métodos de determinar o número do nephron fazem contagens ou estimativas baseadas na identificação dos glomérulos, porque são prontamente identificáveis estruturalmente. Neste papel, o método ácido da maceração para estimar o número do nephron no rim inteiro é descrito e demonstrado27. O método ácido da maceração é rápido, de confiança, e significativamente menos caro do que outros métodos, tais como o método do dissector/fractionator e a imagem latente de ressonância magnética. Além disso, o método ácido da maceração fornece estimativas altamente repetíveis do número do nephron que foram relatados para estar dentro da escala daquelas determinadas usando a imagem latente de ressonância magnética26.
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Protocol
Suprimentos e reagentes listados abaixo são para a determinação de todo o número de nefrons renais em um rato, ou seja, dois rins. As modificações para o uso do método ácido da maceração para o rato são identificadas com asteriscos. Todos os protocolos experimentais conformados com o guia nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais do centro médico da Universidade do Mississippi.
1. procedimento de isolamento renal
- Pesar o rato (ou outras espécies) e eutanizar-lo com um isoflurano (5%-8%) dose excessiva ou pentobarbital (150 mg/kg de injeção intraperitoneal).
- Uma vez que o rato é eutanasiado, abra sua cavidade abdominal usando tesouras cirúrgicas finas ao longo da linha média.
- Levante cuidadosamente os intestinos e a adiposo reprodutiva para o lado direito da cavidade abdominal. Por dissecção bruta, isole o rim esquerdo. Usando tesouras cirúrgicas finas, corte a artéria e a veia renais esquerdas e remova com cuidado o rim esquerdo, coloc o rim em um barco apropriadamente etiquetado (número/identificador do rato) que contem o Saline do fósforo-tamponado (PBS).
- Repita o procedimento para o rim direito.
- Retire cada rim de seu respectivo barco de pesagem e coloque-o sobre uma gaze cirúrgica pré-umedecida com PBS.
- Deixando o rim na gaze cirúrgica, remova rapidamente todo o tecido não-renal aderente (tal como o adiposo perirrenal ou a glândula ad-renal) seguido pela remoção da cápsula renal. Pesar cada rim individualmente, registrando o peso do rim esquerdo e direito separadamente em um caderno de laboratório.
2. homogeneização, incubação, e straining procedimentos
- Uma vez que cada rim é pesado, escorra cada barco de pesagem de PBS e coloque os rins de volta no barco de pesagem apropriadamente rotulado. Usando uma lâmina de barbear limpa, corte o rim ao meio, longitudinalmente. Coloque cada metade do rim virada para baixo e corte cada metade em pedaços de 2 mm ou menores.
- Usando o mesmo Razorblade, cuidadosamente recolher e colocar os pedaços de rim picado em um rotulado 15-mL tubo cônico (número do mouse/identificador; esquerda versus rim direito).
- Repita o procedimento para o rim oposto, usando uma lâmina de barbear nova. Coloque o rim picado em um tubo cônico de 15 mL rotulado separadamente.
- Em uma capa de fumaça bem ventilada, adicione 5 mL de ácido clorídrico (HCl) de 6 M a cada tubo cônico de 15 mL.
- Substitua a tampa ao tubo cônico, agitar suavemente a mistura rim/HCl, e coloque o tubo cônico de 15 mL em um banho de água pré-aquecido fixado em 37 ° c por 90 min (* 120 min para rins de rato).
- Agitar brevemente cada tubo de 15 mL a cada 15 min durante a incubação, a fim de garantir que todo o tecido é exposto ao ácido HCl.
- Insira uma agulha de 18 G numa seringa de 5 mL (* seringa de 10 mL para rato) e Retire cuidadosamente o êmbolo da seringa. Coloque a seringa num tubo cônico de 50 mL (tubo #1) numa capa de fumos.
- Retire a solução de rim/HCl do banho de água e despeje a solução de tecido na extremidade aberta da seringa e defina o tubo cônico de 15 mL de lado em um rack de tubo de ensaio. Substitua cuidadosamente o êmbolo e empurre lentamente o êmbolo de modo a expulsar a solução através da agulha e no tubo #1.
- Lave o tubo cônico de 15 mL com 5 mL de solução de PBS. Gire o PBS no tubo cônico de 15 mL para solubilizar qualquer tecido renal remanescente.
- Novamente, Retire cuidadosamente o êmbolo da seringa de 5 mL que contém a agulha de 18 G e despeje o conteúdo do tubo cônico de 15 mL na extremidade aberta da seringa. Substitua cuidadosamente o êmbolo e lave a seringa empurrando suavemente para baixo no êmbolo, no tubo #1. Repita este processo 2x (executado 3x no total).
- Insira uma agulha de 21 G numa nova seringa de 5 mL (* seringa de 10 mL para rato) e Retire cuidadosamente o êmbolo da seringa. Coloque a seringa com a agulha de 21 G presa num novo tubo cônico de 50 mL (tubo #2).
- Despeje o conteúdo do tubo #1 na extremidade aberta da seringa contendo a agulha de 21 G. Insira cuidadosamente o êmbolo e lave a seringa empurrando suavemente o êmbolo da seringa e colocando a solução extrudada no tubo #2.
- #1 de tubo de lavagem com 5 mL de solução de PBS. Gire o PBS no tubo #1 de forma a solubilizar qualquer tecido renal remanescente.
- Novamente, Retire cuidadosamente o êmbolo da seringa de 5 mL que contém a agulha de 18 G e despeje o conteúdo do tubo #1 na extremidade aberta da seringa. Substitua cuidadosamente o êmbolo e lave a seringa empurrando suavemente para baixo no êmbolo, expulsando a solução para o tubo #2. Repita este processo 2x (executado 3x no total).
- Traga o volume total do tubo #2 até 50 mL adicionando PBS adicional, até a linha 50-mL no tubo #2.
- Incubar #2 tubo contendo a solução de tecido renal em uma cremalheira do tubo em uma placa de balancim em um refrigerador ajustado em 4 ° c durante a noite (mínimo 8-10 h).
3. contagem de glomérulos e extrapolação do número de Nefrons
- Retire a #2 do tubo da geladeira e ressuspender o tecido peletizado, invertendo suavemente o tubo várias vezes, a fim de criar uma solução homogênea. Recomendamos a contagem de glomérulos dentro de 5 d após o processamento.
- Alíquota com cuidado 500 μl da solução do rim em um único poço de uma placa de 12 poços. Repita este 2x, colocando cada alíquota em um poço separado de modo que existam três poços de solução renal por rim, para análise em triplicado.
- Adicionar 500 μL de PBS a cada um dos três poços contendo a solução de rim, para uma diluição de 1:1.
- Usando um microscópio invertido, conte o número de glomérulos por poço. A contagem é auxiliada usando uma grade de 16 seções separadas colocadas na parte inferior de cada poço. Conte o número de glomérulos por cada seção em grade e, em seguida, somar a contagem por grade para obter o número total de glomérulos por poço. Os glomérulos são prontamente identificáveis por sua estrutura esférica. Identificadores adicionais incluíram um matiz avermelhado devido a capilares cheios de sangue, bem como pré ou pós-arteríolas que permanecem presas ao corpo de glomérulos individuais (Figura 1).
- Adicionar o número total de glomérulos contados por cada um dos três poços e, em seguida, dividi-los por três para o número médio de glomérulos por 500 μL de solução renal. Se a variância no número médio de glomérulos por poço for superior a 10%, repita o procedimento de contagem de nefrons, prestando muita atenção à natureza homogênea da solução renal. Multiplicar o número de glomérulos contados por bem vezes 100 para o número médio de glomérulos por rim. O número total de néfron pode ser expresso por rim ou, usando peso renal, por mg ou g de tecido.
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Representative Results
Estão abaixo as estimativas representativas do número inteiro do nephron do rim de um modelo estabelecido do rato da hipertensão e de um modelo genético do rato da doença de rim crônica idade-relacionada. As principais características de identificação dos glomérulos, como uma estrutura esférica com ou sem estruturas anexadas pré ou pós-arteriolar ou Tubular, são destacadas para aqueles que são novos no método de maceração ácida (Figura 1).
No primeiro exemplo experimental, os números totais de néfron foram determinados em camundongos (masculino C57BL/6, 6 semanas de idade) infundidos com veículo (soro fisiológico) ou angiotensina II por 14 dias. Em camundongos com infusão de veículo, o número de néfron foi de 12.411 ± 248 néfrons por rim, conforme determinado pelo método de maceração ácida (Figura 2). Estas estimativas são consistentes com as escalas do número inteiro do nephron do rim relatados previamente nos ratos (tabela 1). A pressão atrial aumentada da angiotensina por aproximadamente 40 mmHg após 14 dias da infusão e foi associada com uma redução significativa no número do nephron (9.122 ± 193 néfrons por o rim) de quase 26% (Figura 2). Esses dados sugerem que a infusão de angiotensina II não está associada apenas à hipertensão, mas também uma redução significativa do número de néfron está associada à perda de nefrons devido à esclerose ou lesão glomerular.
No segundo exemplo experimental, os resultados precedentes do número do nephron em um modelo genético do rato da agenesia renal, o modelo Stock-derivado heterogêneo do rato unilateral da agenesia renal (HSRA), foram confirmados. O modelo HSRA exibe fenótipos de penetrância incompleta para defeitos do rim e do trato urinário, com alguns animais nascendo normais (com dois rins) e outros nascidos com um rim. Em ratos nascidos com dois rins (hA-controle masculino; 12 semanas de idade), estimativas de número de néfron utilizando o método de maceração ácida foram 27.288 ± 336 néfrons por rim (Figura 3). Em contrapartida, em ratos nascidos com um rim solitário (masculino hA-solitário; 4 semanas de idade), as estimativas do número de néfron foram significativamente menores em 24.594 ± 883 néfrons por rim (Figura 3). As estimativas de número de néfron alcançadas nessas amostras também são consistentes com faixas previamente relatadas no rato (tabela 1). Note-se que estes dados são consistentes com achados prévios em que ratos hA-solitários foram encontrados para expor a investidura de néfron diminuída ou números (em comparação com um rim controle) mais provável reflexo dos fatores genéticos subjacentes associados com o nascimento com um único rim31.
Figura 1 : Identificadores chaves dos glomérulos para contar e avaliar o número inteiro do nephron do rim. Os glomérulos são prontamente identificáveis por sua estrutura esférica, como indicado pelas setas. Identificadores adicionais incluem uma tonalidade avermelhada devido a capilares cheios de sangue, bem como pré ou pós-arteríolas (ou túbulos) que podem permanecer ligados ao corpo de glomérulos individuais após o processamento (como aquele identificado na parte inferior deste Micrografia). Também presente nesta imagem são remanescentes de túbulos e vasos sanguíneos. Ampliação = 10X; barra de escala = 100 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Nephron que conta nos ratos. (A) imagem representativa de glomérulos de um único rim de rato banhado em um poço de fundo plano de 22,1 mm de uma placa de cultura de 12 poços, como visto usando um microscópio invertido. Glomérulos e túbulos renais são observados em densidade moderada quando diluído por um fator de dois (0,5 mL de solução renal mais 0,5 mL de 1X PBS). (B) efeito de um veículo de 14 dias ou infusão de angiotensina II sobre o número de néfron em camundongos machos C57Bl/6 avaliados por contagem glomerular. A infusão de angiotensina II em 1.000 ng/kg/min (via osmótica minipump) associou-se à hipertensão e marcou uma redução no número de néfron em comparação com o número de nefrons em camundongos infundidos com veículo. Os números de nephron em ratos veículo-infundidos são consistentes com as estimativas previamente relatadas do número do nephron nos ratos (tabela 1). Veículo: n = 3, angiotensina II: n = 3, *p < 0, 5. Barras de erro = SE. ampliação = 4X; barra de escala = 250 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Nephron contando em ratos. (A) imagem representativa de glomérulos de um único rim de rato banhado em um poço de fundo plano de 22,1 mm de uma placa de cultura de 12 poços, como visto usando um microscópio invertido. Glomérulos e túbulos renais são observados em uma densidade significativamente maior em comparação com o que no rato. (B) a quantificação do número de nefrons nos ratos Hsra-Control e Hsra-s revela que o número de néfron é menor em Hsra-s em comparação aos ratos Hsra-C e consistente com achados prévios neste modelo31. HSRA-C, ratos nascidos com dois rins: n = 3; HSRA-S, ratos nascidos com um rim solitário: n = 3,* p < 0,05. Barras de erro = SE. ampliação = 4X; barra de escala = 250 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Espécie | Número de nefrons por rim | Referência |
| Mouse | 9000-21000 | 18-22, 28 |
| Rato | 13000-27.000 | 31, 33 |
| Ovelhas | 200000-800.000 | 23, 29, 34 |
| Porco | 1600000-4600000 | 32, 35 |
| Humano | 500000-2.000.000 | 8-15 |
Tabela 1: faixas relatadas de número de néfron em várias espécies.
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Discussion
Com boa técnica experimental, o método de maceração ácida é ideal para estimar o número de néfron em rim inteiro. Embora o rim seja dissolvido em ácido, os glomérulos permanecem em grande parte intactos e são prontamente identificáveis, tornando a contagem de glomérulos individuais relativamente fáceis e diretas. A técnica de maceração ácida é particularmente vantajosa por várias razões. Primeiro, o método de maceração ácida é um método rápido e conveniente que requer relativamente pouco em termos de despesa e esforço físico. Todos os reagentes e consumíveis necessários para executar o método de maceração ácida estão prontamente disponíveis na maioria dos laboratórios básicos, sendo o único requisito principal o acesso a um microscópio invertido para contagem glomerular. Em termos de despesa, estima-se que o método de maceração ácida custa apenas um par de centenas de dólares por animal, o que não é muito quando comparado com os custos associados a outros métodos de contagem glomerular renal total, como a ressonância magnética, que pode variar em milhares de dólares por animal de tempo de digitalização e perícia técnica.
Em segundo lugar, o método de maceração ácida envolve significativamente menos tempo de processamento de tecido em comparação com outros métodos de número de néfron de rim inteiro, como o método dissector/fraccionador24. Do início ao fim, o método de maceração ácida requer menos de 24 horas de tempo total, dos quais menos de 1-2 horas é gasto processando rins e, em seguida, contando os glomérulos individuais por animal experimental. Em contrapartida, o método do dissector/fraccionador é trabalhoso, exigindo uma estimativa de 15 horas de trabalho (4-6 horas de corte, 2-3 horas de coloração e 4-5 horas de tempo de contagem) por rim, não incluindo as 48-72 horas necessárias para processar os rins em GL metacrilato de ycol24. Por causa das vantagens do custo e do tempo, o método ácido da maceração é especial útil nos estudos onde as estimativas do número inteiro do nephron do rim precisam de ser feitas em grandes números dos animais com ou sem intervenções genéticas ou farmacológicas. O custo e o tempo envolvidos com o método do dissector/fraccionador e a imagem latente de ressonância magnética foram considerados um fator limitante principal em sua adopção em a maioria de laboratórios de pesquisa.
Finalmente, o método ácido da maceração fornece estimativas do número inteiro do nephron do rim que são comparáveis às medidas que usam métodos mais sofisticados tais como a imagem latente de ressonância magnética26. Por exemplo, usando a ferritina catiônica-rotulagem de glomérulos e processamento de imagem tridimensional para contar cada nephron em um único rim do rato de Sprague-Dawley, a imagem latente de ressonância magnética rendeu em contagens médias de 34.000 glomérulos individuais por rim26. Em rins não-catiônicos ferritina-etiquetados, a imagem latente de ressonância magnética rendeu contagens de 2.000 nephron-como estruturas devido à contagem de regiões não-glomerular do rim com sinais magnéticos da magnitude e da forma similares como glomérulos Ferritin-etiquetados. Quando esses artefatos são subtraída das contagens determinadas por rins catiônicos ferritina-rotulados, o número efetivo de glomérulos determinados, usando ressonância magnética, está mais próximo de 32.000 néfrons por rim26. Neste mesmo estudo, experimentos de validação produziram contagens glomerulares médias de 31.000 por rim usando o método de maceração ácida26. Assim, o método ácido da maceração produz estimativas do número inteiro do nephron do rim que estão dentro de < 5% daqueles determinados usando técnicas do estado---arte tais como a imagem latente de ressonância magnética.
Embora existam várias vantagens importantes associadas ao método de maceração ácida, os investigadores também devem estar cientes das limitações associadas a este método. Uma limitação relaciona-se ao uso do rim inteiro. Como todo o rim é dissolvido e homogeneizado, informações sobre a distribuição espacial de glomérulos dentro do córtex renal não podem ser determinadas. Se conhecer a distribuição intrarrenal do volume glomerular é importante, então o uso de ressonância magnética seria um método melhor adequado.
Comparado a outros métodos, o uso do método ácido da maceração parece subestimar ligeiramente o número total do nephron. As estimativas menores são provavelmente devidas, em parte, à dissolução de uma pequena percentagem de glomérulos no ácido ou durante a maceração do rim. Além disso, com o envelhecimento ou a doença, há uma perda de néfrons funcionais, que, embora não contribuindo para a formação de urina, pode ser mais sensível à maceração ácida e pode ser destruída durante o processamento, contribuindo assim para menores estimativas de néfron total Número. Assim, o cuidado deve ser usado na coleta e processamento de rins de modo a não deixar nenhum tecido renal in vivo ao cortar o rim, ou nas seringas quando extrusão de amostras de tecido. No geral, no entanto, a subestimação do número total de néfron devido ao processamento tecidual parece ser relativamente pequena.
Como a contagem de glomérulos usando o método de maceração ácida é subjetiva, a subestimação do número de néfron também pode ser reflexiva de viés observador, que pode ser facilmente superada por medições sendo realizadas por dois investigadores separados cegos para informações relativas a animais ou condições experimentais. Se houver uma preocupação significativa quanto ao que constitui um glomérulo, uma abordagem alternativa envolveria a infusão de animais experimentais com óxido de ferro antes da eutanásia. Quando infundido intravenosamente, o óxido de ferro entrará e ficará preso no glomérulo; assim, os glomérulos processados devem manchar o preto escuro, permitindo uma maior identificação dos glomérulos ao contar30.
O método ácido da maceração estima o número inteiro do nephron do rim baseado na medida de amostras pequenas (3 x 0,5 mL ou 1,5 mL) ao contrário das medidas da solução inteira do rim (50 mL). O método de maceração ácida é altamente reprodutível na natureza, e contagens de glomérulos dentro de amostras de um único rim e dentro de grupos experimentais são encontrados para ser altamente consistentes. Além disso, os resultados representativos relatados no presente estudo de camundongos selvagens do tipo C57Bl/6 e ratos nascidos com um único rim (Figura 2 e 3) são altamente consistentes com achados prévios, bem como com faixas previamente relatadas (tabela 1 )5,31. Se desejado, as medidas adicionais podiam facilmente ser feitas para estimar melhor o número total do nephron por o rim.
Enquanto a técnica de maceração ácida fornece estimativas confiáveis e repetíveis do número de néfron, este método não é recomendado para a obtenção de medidas de volume glomerular, pois a exposição ao ácido mais provável produz alterações no volume de glomérulos. Como a determinação do volume glomerular é importante na determinação da área de superfície glomerular do rim inteiro, recomenda-se que tais medidas sejam feitas usando métodos histológicos e estereológicos24,25. Particularmente, os métodos estereológicos que fazem uso de glicol metacrilato incorporar rins, a fim de limitar o inchaço do tecido e expansão e, assim, manter a geometria glomerular o mais próximo possível para que in vivo.
Finalmente, outra limitação da técnica de maceração ácida, e que é comum a outros métodos de avaliação do número de néfron, é que nenhuma informação sobre a função glomerular (como a taxa de filtração glomerular) pode ser verificada a partir de glomérulos uma vez Processados. Assim, enquanto os glomérulos individuais podem ser contados, o seu estado funcional (formação de urina ou não-formação de urina) não pode ser determinado utilizando o método de maceração ácida. Similarmente, nenhuma informação longitudinal pode ser verificada usando o método ácido da maceração em ratos individuais. Em vez disso, grupos separados de animais em vários pontos temporais são necessários para obter informações sobre as alterações no número de néfron sobre a vida útil de um animal ou intervenção pré-ou pós-genética ou farmacológica.
Em resumo, o método de maceração ácida é um método de baixo custo, alta taxa de transferência e eficiente para estimar o número de néfron de rim inteiro. O método de maceração ácida proporciona um alto grau de reprodutibilidade como evidenciado pelos dois exemplos aqui apresentados, bem como por aqueles previamente relatados utilizando este método18,19,20,21 , 22 anos de , 28. quando o uso do método ácido da maceração foi descrito para o uso no rato (e no rato), o método ácido da maceração pode igualmente ser escalado para o uso nas espécies maiores, tais como o cão e o porco27,32.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte pelos institutos nacionais de saúde, Instituto Nacional do coração, pulmão e sangue (R01HL107632).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
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