Summary
הערכות של מספר כליות נפרורון מלאה הם חשובים קלינית וניסויים, כפי שיש האגודה ההופכית בין מספר נפרורון וסיכון משופר של מחלות כליות וכלי דם. להלן, השימוש בשיטת החומצה המקורית, המספקת הערכות מהירות ואמינות של מספר כליות מלאה של הכליה, מומחש.
Abstract
הקרן לנפרורון מתייחסת למספר הכולל של הנליות שאדם נולד עם, כנפרוגנזה בבני אדם מסתיימת ב-36 שבועות של הריון, ואין הנפרות חדשות נוצרות לאחר הלידה. מספר נפרורון מתייחס למספר הכולל של הנליות שנמדדות בכל נקודה בזמן שלאחר הלידה. שני הגורמים הגנטיים והסביבתיים משפיעים הן על הקרן והן על המספר. הבנת האופן שבו גנים או גורמים ספציפיים להשפיע על תהליך של נפרורופגנזה ו נפרורון אובדן או מוות הוא חשוב כמו אנשים עם הקרן לנפרורון נמוך או מספר נחשבים להיות בסיכון גבוה יותר לפתח מחלות כליות או קרדיו. הבנת האופן בו חשיפות סביבתיות במהלך חייו של אדם משפיעים גם על מספר הנפרורון חיוני בקביעת הסיכון למחלות עתידיות. כך, את היכולת להעריך את מספר כליות נפרון שלם במהירות ובאמינות היא דרישה ניסיונית בסיסית כדי להבין טוב יותר מנגנונים התורמים או לקדם הפסד נפרוגנזה או נפרורון. כאן, אנו מתארים את שיטת החומצה להערכת מספר כליות נפרון שלם על בסיס ההליך המתואר על ידי דדדיאן, שאוורי, ו בריקר, עם שינויים קלים. שיטת החומציות מספקת הערכות מהירות ואמינות של מספר נפרורון (כפי שמוערך על ידי ספירת פקולי) הנמצאות בטווח של 5% מאלה שנקבעו באמצעות שיטות מתקדמות יותר, אם כי יקרות, כגון דימות תהודה מגנטית. יתרה מזאת, שיטת החומציות היא שיטת תפוקה גבוהה מעולה להערכת מספר נפרורון במספר רב של דגימות או תנאים ניסיוניים.
Introduction
הנפרון הוא גם המבנה הבסיסי והיחידה הפונקציונלית של הכליה1. מבנית, הנפרורון מורכב הפקעית (נימים ופודוקציטים) ממוקם בתוך הקפסולה של באומן וכדורית כליות, המורכב של הכדורית האבותית, לולאה של הנלה, ואת הכליה המרוחק שמסיים את תעלת האיסוף. מבחינה פונקציונלית, תפקידה של הנפרורון הוא סינון וספיגה חוזרת של מים ואלקטרוליטים והפרשת פסולת. באופן כללי, כליירוגנזה הושלמה ב 36 שבועות של הריון בבני אדם וזמן קצר לאחר הלידה במספר מינים כגון העכבר והחולדה2. הקרן לנפרורון מתייחסת למספר הכולל של הנליות שאדם נולד בו, ואילו מספר הנפרורון הוא המספר הכולל של הנליות שנמדדו בכל עת שלאחר לידה3. המונח מספר נפרורון ומספר פקריפיות משמשים לעתים קרובות לסירוגין. כי יש רק חד-עין אחד לנפרורון, הערכה של מספר גלואראולי הוא תחליף חשוב להערכת מספר נפרורון.
הערכה של מספר נפרורון ו נפרורון הוא העניין הקליני כמו מחקרים הוכיחו קשר בין הקרן הנרון לבין מספרים נפרורון מופחת עם שכיחות מוגברת של מחלות לב וכלי דם4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. מבוסס על ממצאים בכליות בנתיחה שלאחר המוות, ברנר ציין כי יתר לחץ דם שהוצגו עם מספר כולל נמוך יותר של הנליות מאשר normotensive אנשים16. לפיכך, ברנר שיערו שיש קשר הפוך בין מספר נפרורון והסיכון לפתח לחץ דם מאוחר יותר בחיים. ברנר שיערו גם שירידה במספר הנפרון הייתה מפוצה על ידי הנליות שנותרו. על מנת לשמור על שיעור הסינון הרגיל בכליה, שיורית לפצות מפצה על ידי הגדלת השטח שלהם לפני הפקיית העין (היפרפרופילציה), ובכך לעבוד כדי להמתיק כל השפעה שלילית של הפסד נפרורון על תפקוד הכליה4 ,בן 16
בעוד המגן בטווח הקצר, היפרפרהפרפרס, בטווח הארוך, מוביל הגדלת נתרן ונוזלים מוגברת, נפח נוזלים מוגבר, ומגדיל את לחץ הדם העורקי, המוביל למחזור קסמים של עליות נוספות ב לחץ נימי-דם, היפרסינון, וצלקות נפרון (טרשת נפוצה) ופציעה4,16.
קבלת הערכות או ספירות של מספר נפרורון להציע כמה יתרונות ניסיוניים: 1) הוא מספק מידע לגבי תהליך של נפרוגנזה, אשר יכול להיות מקושר לגנים או גורמים ספציפיים בסביבה או העובר האימהי-העוברי, ו 2) יש אסוציאציה של מספר נפרורון עם מחלות לב וכלי דם, ולכן יש פוטנציאל כי האומדנים של מספר נפרורון יכול לשמש כדי לחזות את הסיכון וכלי דם עתידיים2,17,18, מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , 22. בנוסף לסביבה אימהית-עוברית, מחלות שונות משפיעות ישירות מספר נפרורון ותפקוד הכליות, כולל טרשת עורקים, סוכרת, יתר לחץ דם, ואפילו הזדקנות נורמלית2,9, . עשר,11,12,22,23 לפיכך, הערכה של מספר כליות מלאה הכליה חשוב להבין הן את הגורמים הגנטיים והסביבתיים המשפיעים על כליירוגנזה (כלומר, הקרן הנפרון) ומספר נפרורון במהלך חייו של אדם וההשפעות הנובעות על תפקוד הכליות ובריאות לב וכלי דם.
כיום, ישנן מספר שיטות זמין לקביעת וכימות של מספר נפרורון, כל אחד עם יתרונות ומגבלות משלו24,25,26,27,28 ,29,30. שיטות מתוחכמות לקביעת כליה כולה מספר נפרורון כוללות שיטות סטריאולוגיות, כגון שיטת הניתוח/שבירה, ודימות תהודה מגנטית25,26. לעתים קרובות נחשב בתקן הזהב לקביעת מספר כליות נפרון שלם, שיטת הניתוח/שבירה היא יקרה וגוזלת זמן. ההתקדמות והשיפור האחרונים בדימות תהודה מגנטית ובעיבוד סיפקו את הכלים לספירת כל הנפרון בנפרד. עם זאת, דימות תהודה מגנטית הוא לא רק זמן רב אלא גם יקר מאוד. בנוסף, גם השיטה הבתר-שבירה והדמיה מגנטית מחייבת מומחיות טכנית מתקדמת, ובכך מגבילה את השימוש בשיטות שכאלה ברוב מעבדות המחקר.
רוב השיטות של קביעת מספר נפרון לעשות ספירות או הערכות המבוססות על זיהוי של פקולי, כפי שהם בקלות לזיהוי מבנית. במאמר זה, את שיטת החומצה להערכת מספר נפרורון בכליה כולה מתוארת והפגינו27. שיטת החומצה היא מהירה, אמינה, ומשמעותית פחות יקר משיטות אחרות, כגון שיטת הניתוח/השבר והדמיה של תהודה מגנטית. יתר על כן, שיטת ההאטה של החומצה מספקת הערכות לשחזור מאוד של מספר נפרורון שדווחו להיות בטווח של אלה שנקבעו באמצעות דימות תהודה מגנטית26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אספקה וריאגנטים המפורטים להלן לקביעת הכליה כולה מספר נפרורון בעכבר אחד, כלומר, שתי כליות. שינויים לשימוש בשיטת החומצה לחולדה מזוהים עם כוכביות. כל הפרוטוקולים הניסיוניים תאמו את המכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים במרכז הרפואי של אוניברסיטת מיסיסיפי.
1. נוהל בידוד כליה
- שוקלים את העכבר (או מינים אחרים) והמתת אותו באמצעות isofלוריאן (5%-8%) מנת יתר או פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג הזרקת הצפק).
- לאחר העכבר מורדמים, פתח את חלל הבטן שלו באמצעות מספריים כירורגי משובח לאורך קו האמצע.
- הרימו בזהירות את המעיים ואדיפוז הרבייה לצד הימני של חלל הבטן. , באמצעות ניתוח מגעיל. תבודדי את הכליה השמאלית בעזרת מספריים כירורגיים משובחים, חותכים את עורק הכליה השמאלי ואת הווריד ומסירים בזהירות את הכליה השמאלית, וממקמת את הכליה בתווית כראוי (מספר/מזהה העכבר) שוקלים סירה המכילה מתמיסת זרחן באגירה (PBS).
- חזור על ההליך של הכליה הנכונה.
- להסיר כל כליה מהסירה שוקלים בהתאמה ולמקם אותו על גזה כירורגית הרטיב מראש עם PBS.
- השארת הכליה על גזה כירורגית, להסיר במהירות כל רקמה שאינה כליות חסיד (כגון perirenal האדיפוז או בלוטת יותרת הכליה) ואחריו הסרת כמוסת הכליה. שוקלים כל כליה בנפרד, הקלטת את המשקל של הכליה השמאלית והימנית בנפרד במחברת מעבדה.
2. הומוגון, דגירה והליכי מאמץ
- לאחר כל כליה הוא שוקל, לנקז כל הסירה שוקלים של PBS ולמקם את הכליות בחזרה לתוך הסירה בעלת תווית כראוי שוקל. , משתמש בסכין גילוח נקייה. חותכת את הכליה לחצי, לאורכו מניחים כל כליה חצי פונה למטה וחותכים כל חצי לחתיכות 2-mm או קטן.
- באמצעות סכין גילוח זהה, בזהירות לאסוף ולמקם את חתיכות כליה קצוצים לתוך שפופרת מסומן 15-mL חרוט ( מספר העכבר/מזהה; שמאל לעומת הכליה הימנית).
- חזור על ההליך עבור הכליה הנגדית, באמצעות להב תער חדש. הניחו את הכליה הקצוצה בשפופרת חרוט בעלת תווית של 15 מ ל בנפרד.
- ב מאוורר היטב המאוורר, להוסיף 5 מ ל 6 מ ' חומצה הידרוכלורית (HCl) 15-mL כל 1-מ"ל צינור חרוט.
- החליפו את המכסה לצינור החרוט, הכשלו בעדינות את תערובת הכליות/HCl, והניחו את צינור ה-15-mL לאמבט מים מחומם מראש ב-37 ° c עבור 90 דקות (* 120 דקות לכליות חולדה).
- בקצרה מתפרעים כל 15-mL צינור כל 15 דקות במהלך הדגירה כדי להבטיח כי כל הרקמה נחשפת חומצה HCl.
- הכנס מחט של 18 גרם לתוך מזרק של 5 מ ל (* 10-mL מזרק לחולדה) והסר בזהירות את המזרק. הניחו את המזרק בשפופרת חרוט ב50-mL (צינור1) בתוך מכסה המנוע.
- הסר את הפתרון כליה/HCl מאמבט המים ושפוך את פתרון הרקמה לקצה הפתוח של המזרק והגדר את הצינורית החרוטית של 15 מ"ל בתוך מתלה מבחנה. בזהירות להחליף את הבוכנה ולדחוף לאט את הבוכנה כדי להפוך את הפתרון דרך המחט לתוך הצינור1.
- שטפו את צינור ה-15 מ"ל עם 5 מ ל של פתרון PBS. מערבולת הPBS ב-15-mL שפופרת חרוט כדי לפתרון כל רקמת הכליה הנותרת.
- שוב, להסיר בזהירות את הבוכנה ממזרק 5-mL המכיל את המחט 18-G ולשפוך את התוכן מצינור ה-15-mL החרוט לקצה הפתוח של המזרק. החלף בזהירות את הבוכנה ורוקן את המזרק על-ידי דחיפת בעדינות על הבוכנה, לתוך צינור1. חזור על התהליך 2x (שבוצע בסכום כולל של 3 x).
- הכנס מחט 21-G לתוך מזרק חדש 5-mL (* 10-mL מזרק לחולדה) ולהסיר בזהירות את המזרק מזרק. מניחים את המזרק עם מחט 21-G המצורפת לשפופרת 50-mL חדשה (צינור2).
- יוצקים את התוכן מהצינור1 לקצה הפתוח של המזרק המכיל את המחט 21-G. הכנס בזהירות את הבוכנה ורוקן את המזרק על-ידי דחיפת בעדינות על המזרק והצבת הפתרון המובלטת לתוך2 הצינור.
- שטוף צינור1 עם 5 מ ל של פתרון PBS. מערבולת הPBS ב1 שפופרת כדי לפתרון כל רקמת הכליה הנותרת.
- שוב, בזהירות להסיר את הבוכנה ממזרק 5-mL המכיל את המחט 18-G ויוצקים את התוכן מצינור1 לקצה הפתוח של המזרק. בזהירות להחליף את הבוכנה ולשטוף את המזרק על ידי דוחף בעדינות למטה על הבוכנה, הבלטת ממד הפתרון לתוך צינור2. חזור על התהליך 2x (שבוצע בסכום כולל של 3 x).
- הביאו את נפח הצינור הכולל2 עד 50 mL על ידי הוספת PBS נוספים, עד לקו 50-mL ב2 הצינור.
- שפופרת דגירה2 המכיל את הפתרון רקמת הכליה במדף הצינור על צלחת נדנדה במקרר להגדיר ב 4 ° צ' לילה (מינימום 8-10 h).
3. ספירה לפקולי ולחילוץ מספר הנפרורון
- הסירו2 הצינור מהמקרר והשהה מחדש את רקמת הפלטד על ידי היפוך עדין של הצינורית מספר פעמים כדי ליצור פתרון הומוגנית. אנו ממליצים לספור בתוך 5 d לאחר העיבוד.
- בזהירות סדרת מחלקים 500 μl של פתרון הכליה לתוך באר אחת של 12-היטב צלחת. חזור על 2x זה, הצבת כל סדרת מחלקים לתוך באר נפרדת, כך שיש שלוש בארות של פתרון כליות לכל כליה, לניתוח בטרילקאט.
- הוסף 500 μL של PBS לכל אחת משלוש הבארות המכילות את פתרון הכליה, עבור דילול 1:1.
- באמצעות מיקרוסקופ הפוך, לספור את מספר הגלואראולי לטובה. הספירה מסייעת באמצעות רשת של 16 סעיפים נפרדים הממוקמים בתחתית כל באר. לספור את מספר הגלואראולי לכל מקטע הרשת ולאחר מכן לסכם את הספירה למטה כדי לקבל את המספר הכולל של גלואראולי לחלוטין. לפקאולי ניתן לזהות בקלות. על ידי המבנה הכדורי שלהם מזהים נוספים כללו גוון אדמדם בגלל נימים ממולאים בדם, כמו גם טרום-או לאחר-העורקים הנותרים מחוברים לגוף של פקולי בודדים (איור 1).
- הוסף את המספר הכולל של גלואראולי שנספר לכל אחת משלוש הבארות ולאחר מכן תחלק אותם בשלושה עבור המספר הממוצע של הפקולי לכל 500 μL של פתרון כליות. אם השונות במספר הממוצע של הפקולי לבאר גדולה מ-10%, חזרו על ההליך לספירת הנפרורון, והקשיבו היטב לאופי האחיד של פתרון הכליה. הכפל את מספר הפקולי שנספר בכל פעם 100 למספר הממוצע של הפקעות לכל כליה. מספר הנפרון הכולל ניתן לביטוי לכל כליה או באמצעות משקל כליות, לכל מ ג או g של רקמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
להלן האומדנים מייצגים של מספר כליות נפרורון שלם ממודל עכבר מבוסס של יתר לחץ דם ומודל חולדה גנטית של מחלת כליות כרונית הקשורה לגיל. מפתח מאפיינים מזהים של גלואראולי, כגון מבנה כדורית עם או בלי מחוברים pre-או post-arteriolar או מבנים הכרישים, מסומנים עבור אלה חדש השיטה חומצה (איור 1).
בדוגמה הניסיונית הראשונה, מספרי הנפרון הכולל נקבעו בעכברים (זכר C57BL/6, 6 שבועות של גיל) מוחדרת לכלי רכב (תמיסת מלח) או אנגיוטנסין II במשך 14 ימים. בכלי רכב-בעלי מורה, מספר נפרורון היה 12,411 ± 248 נפרוליות לכל כליה כפי שנקבע באמצעות שיטת החומצה (איור 2). הערכות אלה מתאימות עם טווחים של מספר כליות נפרורון שלם שדווחו בעבר עכברים (שולחן 1). אנגיוטנסין הגביר את הלחץ על ידי כ 40 mmHg בעקבות 14 ימים של אינפוזיה היה קשור הפחתה משמעותית במספר נפרורון (9,122 ± 193 הנליות לכל כליה) של כמעט 26% (איור 2). נתונים אלה מראים כי העירוי אנגיוטנסין II הוא לא רק קשור ליתר לחץ דם אלא, גם, הפחתה משמעותית במספר הנפרורון קשורה לאובדן הפסד עקב טרשת נפוצה או פציעה בלתי מזוהה.
בדוגמא הניסיונית השנייה, הממצאים הקודמים של מספר נפרורון במודל חולדה גנטי של אגנזיס כליות, המודל ההטרוגנית הנגזר של מאגר כליות חד צדדי (HSRA סרה), אושרו. מודל הסרה מציג פנוטיפים בעלי חדירה לפגמים בכליות ובדרכי השתן, עם בעלי חיים שנולדו נורמליים (עם שתי כליות) ואחרים נולדים עם כליה אחת. בחולדות שנולדו עם שתי כליות (זכר ה-Control; 12 שבועות של גיל), הערכות של מספר נפרורון באמצעות שיטת החומצה המקדיר היו 27,288 ± 336 נפרוליות לכל כליה (איור 3). לעומת זאת, בחולדות שנולדו עם כליה בודדה (זכר הבידוד; 4 שבועות של גיל) האומדנים של מספר נפרורון נמצאו נמוך באופן משמעותי ב 24,594 ± 883 הנליות לכל כליה (איור 3). הערכות של מספר נפרורון הושג בדגימות אלה גם עקבי עם טווחים שדווחו בעבר בחולדה (שולחן 1). שימו לב כי נתונים אלה עקביים עם הממצאים הקודמים שבהם נמצאו חולדות הבידוד להפגין מראה מופחת של הקרן או מספרים (לעומת כליה בקרה אחת) כנראה המשקף את הגורמים הגנטיים הבסיסיים הקשורים ללידה עם כליה אחת31
איור 1 : מזהי מפתח של פקולי לספירה והערכה של מספר כליות נפרון שלם. פקאולי ניתן לזהות בקלות על ידי המבנה הכדורי שלהם, כפי שמצוין על ידי החיצים. מזהים נוספים כוללים גוון אדמדם בשל נימים ממולאים בדם, כמו גם טרום או לאחר-העורקים (או tubules) שעשויים להישאר מחוברים לגוף של בודדים פקולי לאחר העיבוד (כמו אחד מזוהה בתחתית זה מיקרו-גרף). בתמונה זו יש גם שרידים של טובולים ושל כלי דם. הגדלה = 10X; סרגל בקנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : כנפרון סופר בעכברים. (א) דמות מייצגת של פקולי כליה של עכבר אחד מצופה היטב התחתית 22.1-mm של לוחית 12-היטב התרבות, כפי שנראה באמצעות מיקרוסקופ הפוך. פקאולי ו tubules כליות נראים בצפיפות מתונה כאשר מדולל על ידי גורם של שניים (0.5 mL של פתרון כליות בתוספת 0.5 mL של 1x PBS). (ב) ההשפעה של הרכב 14 ימים או אנגיוטנסין II העירוי על מספר נפרורון ב זכר C57Bl/6 עכברים כפי שמוערך על ידי ספירה של פקפיות. העירוי אנגיוטנסין II ב 1,000 ng/kg/min (דרך אוסמוטי minipump שאבת) היה קשור ליתר לחץ דם ומסומן ירידה במספר נפרורון לעומת מספר הנרון בעכברים המוחדרת רכב. מספרי נפרורון בעכברים בעלי הרכב הם עקביים עם הערכות שדווחו בעבר על מספר נפרורון בעכברים (שולחן 1). רכב: n = 3, אנגיוטנסין II: n = 3, *p < 0.05. קווי שגיאה = SE. הגדלה = 4X; סרגל בקנה מידה = 250 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : נפרון סופר בחולדות. (א) דמות מייצגת של פקולי כליות חולדה אחת מצופה היטב בתחתית 22.1-mm של לוחית של 12-היטב תרבות, כפי שנראה באמצעות מיקרוסקופ הפוך. פקאולי ו tubules כליות נראים בצפיפות גבוהה באופן משמעותי לעומת זה בעכבר. (ב) הכמת של מספר הנפרורון בהסרה-בקרה ועכברים מגלה כי מספר הנרון נמוך יותר ב-hsra סרה-s בהשוואה לעכברי HSRA סרה-C ועקבי עם ממצאים קודמים בדגם31זה. HSRA-C, חולדות שנולדו עם שתי כליות: n = 3; HSRA סרה-S, חולדות נולד עם כליה בודדה: n = 3,* p < 0.05. קווי שגיאה = SE. הגדלה = 4X; סרגל בקנה מידה = 250 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ינים | מספר נפרורון לכליות | פניה |
| עכבר | 9000-21000 | 18-22, 28 |
| עכברוש | 13000-27000 | 31, 33 |
| כבשים | 200,000-800,000 | 23, 29, 34 |
| חזיר | 1,600,000-4,600,000 | 32, 35 |
| אדם | 500,000-2,000,000 | 8-15 |
שולחן 1: מדווחים על טווחים של מספר נפרורון במספר מינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עם הטכניקה הניסיונית טובה, שיטת החומצה המקורית אידיאלית להערכת מספר נפרון בכליה שלמה. למרות הכליה היא מומס חומצה, פקולי להישאר במידה רבה והוא מזהה בקלות, מה שהופך את הספירה של פקולי בודדים יחסית קל ופשוט. טכניקת החומצה היא יתרון במיוחד מכמה סיבות. ראשית, שיטת החומציות היא שיטה מהירה ונוחה הדורשת מעט יחסית מבחינת הוצאות ומאמץ גופני. כל ריאגנטים ומתכלים הנדרשים לבצע את שיטת החומצה המתכלה זמינים ביותר במעבדות הבסיסיות ביותר, הדרישה העיקרית היחידה להיות גישה מיקרוסקופ הפוך לספירה הפוכה. במונחים של הוצאות, ההערכה היא כי שיטת החומצה המקחית עולה רק כמה מאות דולרים לכל בעל חיים, וזה לא הרבה בהשוואה לעלויות הקשורות לשיטות אחרות של ספירת כליות מלאה, כגון דימות תהודה מגנטית, אשר יכול לנוע לתוך אלפי דולרים לכל בעל חיים של סריקת זמן ומומחיות טכנית.
שנית, שיטת החומצה כרוכה באופן משמעותי פחות לעיבוד רקמות בהשוואה לשיטות אחרות של מספר נפרורון כליות כגון הניתוח/שיטת השבר24. מתחילתו ועד סופו, שיטת החומציות מחייב פחות מ -24 שעות של זמן כולל, שבהן פחות מ-1-2 שעות מבוזבז על עיבוד הכליות ולאחר מכן סופרת את הפקולי היחידה לכל בעל חיים ניסיוני. לעומת זאת, השיטה הבתר-שבירה היא אינטנסיבית לעבודה, הדורשת מוערך של 15 שעות עבודה (4-6 שעות של הפצה, 2-3 שעות של כתמים, ו 4-5 שעות של ספירה) לכל כליה, לא כולל 48-72 שעות הדרושים כדי לעבד את הכליות ב gl . אל מ מתילאקריב24 בגלל היתרונות של עלות וזמן, שיטת החומציות החומצה היא שימושית במיוחד במחקרים שבהם האומדנים של מספר כליות כליה שלמה צריך להתבצע במספר גדול של בעלי חיים עם או בלי התערבויות גנטיות או תרופתי. העלות והזמן המעורבים בשיטת הניתוח והבדיקה המגנטית והדמיה מגנטית נחשבו לגורם מגביל משמעותי באימוץ שלהם ברוב מעבדות המחקר.
בסופו של דבר, שיטת החומציות מספקת הערכות של מספר נפרורון שלם הדומות לאמצעים באמצעות שיטות מתוחכמות יותר כגון דימות תהודה מגנטית26. לדוגמה, באמצעות שימוש בתוספת ferritin-תיוג של פקולי ועיבוד תלת מימדי התמונה לספור כל נפרורון בכליה אחת מן החולדה הג-דאולי, הדמיה תהודה מגנטית הניבה סעיפים בממוצע של 34,000 בודדים פקולי ל כליה26. בתוך הכליות ferritin שאינם שכותרתו, הדמיה תהודה מגנטית הניבה ספירות של 2,000 נפרורון כמו מבנים בשל ספירת אזורים שאינם פקתית של כליה עם אותות מגנטיים של בסדר גודל דומה וצורה כמו באופן ferritin התווית פקאראולי. כאשר ממצאים אלה מופחתים מהספירות שנקבעו על-ידי הכליות המסומנות בשיטת התהודה המגנטית, מספרם האפקטיבי של הפקאיות נקבע, תוך שימוש בהדמיה מגנטית, קרוב יותר ל-32,000 נליות לכל כליה26. במחקר זה, ניסויים באימות הניב ספירות פקפיות ממוצעת של 31,000 לכל כליה באמצעות שיטת החומצה המקדיר26. לפיכך, שיטת החומציות מייצרת הערכות של מספר כליות מלאה של כליה, כי הם בתוך < 5% מאלה שנקבעו באמצעות טכניקות המדינה האמנות כגון דימות תהודה מגנטית.
למרות שיש כמה יתרונות מרכזיים הקשורים בשיטת החומצה, החוקרים צריכים גם להיות מודעים למגבלות המשויכות לשיטה זו. מגבלה אחת מתייחסת לשימוש בכליה שלמה. כאשר כל הכליה מומס והומוגניים, מידע בנוגע להתפלגות המרחבית של הפקאולי בתוך קליפת הכליה לא ניתן לקבוע. אם הידיעה את התפלגות intrarenal של נפח הפקייתי חשוב, אז השימוש בדימות תהודה מגנטית תהיה שיטה מתאימה יותר.
בהשוואה לשיטות אחרות, השימוש בשיטת החומצה מופיע מעט בערכם של מספר הנפרורון הכולל. ההערכות הקטנות יותר עשויות לנבוע, בין השאר, לפירוק אחוז קטן של פקאולי בחומצה או במהלך ההכליה של הכליה. בנוסף, עם הזדקנות או מחלה, יש אובדן של הנליות תפקודית, אשר, אם כי לא לתרום היווצרות שתן, עשוי להיות רגיש יותר חומצה משקע ועלול להיהרס במהלך העיבוד, ובכך לתרום האומדנים הנמוכים של סך נפרון ספר. לכן, הטיפול צריך לשמש בעת איסוף ועיבוד הכליות כדי לא להשאיר כל רקמת הכליה בvivo בעת חיתוך הכליה, או בתוך מזרקים בעת הבלטת דגימות רקמות. באופן כללי, עם זאת, הערכה של מספר הנפרורון הכולל בשל עיבוד רקמות נראה קטן יחסית.
כמו ספירת של פקולי שימוש בשיטת החומצה המקדיר היא סובייקטיבית, הערכה התחתון של מספר נפרורון עשוי להיות גם רפלקטיבית של הטיית המתבונן, אשר ניתן להתגבר בקלות על ידי מדידות שבוצעו על ידי שני חוקרים נפרדים עיוור ל מידע בנוגע לבעלי חיים ניסיוניים או למצבו. אם יש חשש משמעותי לגבי מה שמהווה את הפקעית, הגישה החלופית כוללת החדרת בעלי חיים ניסיוניים עם תחמוצת ברזל לפני המתת חסד. בשעת החדרת באופן מבוקר, תחמוצת הברזל תיכנס ותהיה לכוד בתוך הפקעית; לכן, פקולי מעובד צריך להכתים שחור כהה, ומאפשר זיהוי גדול יותר של פקולי כאשר סופר30.
שיטת החומצה מעריכה את מספר הכליות המלא על בסיס מדידה של דגימות קטנות (3 x 0.5 mL או 1.5 mL) לעומת מדידות של הפתרון כולו של כליה (50 mL). שיטת החומצה מיועלת באופן מאוד טבעי, והוא נחשב בתוך דגימות של כליה אחת ובתוך קבוצות נסיוניות, מצויים בעקביות רבה. יתר על כן, תוצאות הנציג דיווחו במחקר הנוכחי מסוג פראי C57Bl/6 עכברים וחולדות נולד עם כליה אחת (איור 2 ו- 3) הם עקביים מאוד עם ממצאים קודמים, כמו גם עם טווחים שדווחו בעבר (טבלה 1 )5,31. במידת הצורך, ניתן לבצע בקלות מדידות נוספות כדי להעריך טוב יותר את מספר הנפרון הכולל לכל כליה.
בעוד שטכניקת החומצה המקורית מספקת הערכות אמינות ובלתי ניתנת לשחזור של מספר נפרורון, שיטה זו אינה מומלצת להשגת מדידות של עוצמת הקול הפקורית, כחשיפה לחומצה ככל הנראה מייצרת שינויים בכרך פקולי. כקביעת עוצמת הקול הפקייתי חשוב לקבוע את השטח כליה שלמות המשטח הפנים, מומלץ כי מדידות כאלה נעשה באמצעות שיטות היסטולוגית ו סטריאוולוגית24,25. במיוחד, שיטות סטריאוולוגית שעושות שימוש בכליות הטבעה של גליקול מתיונין על מנת להגביל את הנפיחות רקמות והתרחבות, ובכך, לשמור על הגיאומטריה פקקתית קרוב ככל האפשר זה בvivo.
בסופו של דבר, הגבלה נוספת של הטכניקה המקדיר חומצה, ואחד כי הוא משותף לשיטות אחרות של הערכת מספר נפרורון, הוא כי אין מידע על הפונקציה הפקורית (כגון שיעור סינון לפקמות) ניתן לברר מן העין בפעם אחת עובד. לפיכך, בעוד שניתן לספור את הפקאולי בודדים, מצבה התפקודי (היווצרות שתן או שאינו יוצר שתן) לא ניתן לקבוע באמצעות שיטת החומצה. באופן דומה, אין מידע אורכי ניתן לברר באמצעות שיטת החומצה המקדיר בעכברים בודדים. במקום זאת, קבוצות נפרדות של בעלי חיים בנקודות זמן שונות נדרשים כדי לקבל תובנה שינויים במספר נפרורון על תוחלת חיים של חיה או לפני או פוסט התערבות פרמקולוגית או תרופתי.
לסיכום, שיטת החומציות היא בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה, ושיטה יעילה להערכת מספר כליות נפרורון שלם. שיטת חומצת החומצה מספקת מידה גבוהה של השקפעות כעדות לשתי הדוגמאות שהוצגו כאן, כמו גם על ידי אלה שדווחו בעבר בשיטה זו18,19,20,21 , מיכל בן 22 , 28. בעוד השימוש בשיטת החומצה המקדיר תוארה לשימוש בעכבר (ועכברוש), ניתן גם לשנות את שיטת החומצה המקדיר לשימוש במינים גדולים יותר, כגון הכלב והחזיר27,32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, לב לאומי, ריאות ומכון בלאד (R01HL107632).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
- Hall, J. E., Guyton, A. C. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 13th, Elsevier. Philadelphia, PA. (2016).
- Wang, X., Garrett, M. R. Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models. Physiological Genomics. 49 (3), 180-192 (2017).
- Didion, S. P. A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension. Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).
- Brenner, B. M. Nephron adaptation to renal injury or ablation. American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).
- Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension. Hypertension. 68, A052 (2016).
- Luyckx, V. A., Brenner, B. M. The clinical importance of nephron mass. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (6), 898-910 (2010).
- Mackenzie, H. S., Brenner, B. M. Fewer nephrons at birth: a missing link in the etiology of essential hypertension? American Journal of Kidney Diseases. 26 (1), 91-98 (1995).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes with the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Denic, A., et al. The substantial loss of nephrons in healthy human kidneys with aging. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 313-320 (2016).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 101-108 (2003).
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Hoy, W. E., et al. Distribution of volumes of individual glomeruli in kidneys at autopsy: association with age, nephron number, birth weight and body mass index. Clinical Nephrology. 74 (Suppl 1), S105-S122 (2010).
- Hughson, M. D., et al. Hypertension, glomerular hypertrophy and nephrosclerosis: the effect of race. Nephrology Dialysis Transplantation. 29 (7), 1399-1409 (2014).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2010).
- Brenner, B. M., Garcia, D. L., Anderson, S. Glomeruli and blood pressure. Less of one, more of the other? American Journal of Hypertension. 1 (4 Pt 1), 335-347 (1988).
- Clark, A. T., Bertram, J. F.
- Benz, K., et al. Early glomerular alterations in genetically determined low nephron number. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (2), F521-F530 (2011).
- Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
- Sims-Lucas, S., Caruana, G., Dowling, J., Kett, M. M., Bertram, J. F. Augmented and accelerated nephrogenesis in TGF-beta2 heterozygous mutant mice. Pediatric Research. 63 (6), 607-612 (2008).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Stelloh, C., et al. Prematurity in mice leads to reduction in nephron number, hypertension and proteinuria. Translational Research. 159 (2), 80-89 (2012).
- Galinsky, R., et al. Effect of intra-amniotic lipopolysaccharide on nephron number in preterm fetal sheep. American Journal of Physiology Renal Physiology. 301 (2), F280-F285 (2011).
- Bertam, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29 (4), 575-580 (2014).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Damadian, R. V., Shawayri, E., Bricker, N. S. On the existence of non-urine forming nephrons in the diseased kidney of the dog. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 65, 26-39 (1965).
- Bonvalet, J. P., et al. Number of glomeruli in normal and hypertrophied kidneys of mice and guinea-pigs. The Journal of Physiology. 269 (3), 627-641 (1977).
- Bains, R. K., Sibbons, P. D., Murray, R. D., Howard, C. V., Van Velzen, D. Stereological estimation of the absolute number of glomeruli in the kidneys of lambs. Research in Veterinary Science. 60 (2), 122-125 (1996).
- Assmann, K. J., van Son, J. P., Koene, R. A. Improved method for the isolation of mouse glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 944-946 (1991).
- Wang, X., et al. Nephron deficiency and predisposition to renal injury in a novel one-kidney genetic model. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1634-1646 (2015).
- Lodrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Fassi, A., et al. Progressive glomerular injury in the MWF rat is predicted by inborn nephron deficit. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (8), 1399-1406 (1998).
- Wintour, E. M., et al. Reduced nephron number in adult sheep, hypertensive as a result of prenatal glucocorticoid treatment. The Journal of Physiology. 549 (Pt 3), 929-935 (2003).
- Van Vuuren, S. H., et al. Compensatory growth of congenital solitary kidneys in pigs reflects increased nephron numbers rather than hypertrophy. PLoS One. 7 (11), e49735 (2012).
