Summary
Bu iletişim kuralının amacı insan Perivasküler Yağ dokusundan elde edilen progenitör hücre birden çok hücre soy ayırt etmek yeteneği test etmektir. Farklılaşma Mezenkimal Kök hücre adipocyte, osteocyte ve kondrosit soy ayırt etmek için bilinen insan kemik iliği elde için karşılaştırıldı.
Abstract
Yağ dokusu çok güçlü Mezenkimal kök hücrelerin (MSC) içine ayırt yeteneğine sahip zengin bir kaynağıdır Osteojenik, Adipojenik ve chondrogenic soy. Progenitör hücrelerinin Adipojenik farklılaşma sürüş yağ dokusu genişleme ve fonksiyon bozukluğu obezite yanıt büyük bir mekanizmadır. Perivasküler Yağ dokusundan (PVAT) anlayış değişiklikler böylece metabolizma hastalığında klinik olarak ilgili. Ancak, önceki çalışmalar çoğunlukla fare ve diğer hayvan gerçekleştirilen olmuştur modelleri. Bu protokol insan torasik PVAT örnekleri koroner arter bypass greft cerrahisi uygulanan hastalardan toplanan kullanır. Yağ dokusu artan aort üzerinden toplanan ve stromal vasküler kesir explantation için kullanılır. Daha önce insan PVAT lipid içeren ayırt etmek için kapasiteli yağ progenitör hücrelerinin varlığı teyit adiposit. Bu çalışmada, daha fazla stromal vasküler kesir hücre farklılaşma potansiyeli muhtemelen çok güçlü progenitör hücre içeren analiz ettik. Biz PVAT kaynaklı hücrelere farklılaşma Adipojenik ve Osteojenik ve chondrogenic soy içine insan kemik iliği MSC göre. Farklılaşma 14 gün belirli lekeleri kullanılan adiposit (yağ kırmızı O), lipid birikimi tespit etmek için kireç yataklarında Osteojenik hücreleri (Alizarin Red), veya glikozaminoglikan ve kollajen chondrogenic hücrelerinde (Masson'ın Trichrome). Adipojenik ve chondrogenic potansiyel, PVAT kaynaklı hücreler kemik iliği MSC verimli bir şekilde tüm üç soy farklılaşmış, vardı ama sağlam Osteojenik potansiyelini yoktu.
Introduction
Yağ dokusu çok güçlü Mezenkimal kök hücrelerin (MSC) içine ayırt yeteneğine sahip zengin bir kaynağıdır Osteojenik, Adipojenik ve chondrogenic soy1. Olgun adiposit hipertrofisi ve adiposit için ikamet MSC de novo farklılaşma yoluyla bu doku genişler. Perivasküler Yağ dokusundan (PVAT) kan damarlarının çevreleyen ve vasküler işlevi2,3düzenler. Obezite kaynaklı PVAT genişleme kardiyovasküler patolojileri exacerbates. MSC multipotent potansiyel insan deri altı yağ depoları dan olmuştur iken de okudu4,5, hiçbir çalışmaları explanted ve insan PVAT kaynaklı progenitör hücre, muhtemelen nedeniyle ayırt etme kapasitesi değerlendirilen tedarik invasiveness. Böylece, bu çalışmanın amacı explant ve kardiyovasküler hastalığı olan hastalarda insan aort PVAT progenitör hücre yaymak için ve onların eğilimi için Osteojenik ayırt etmek için chondrogenic ve Adipojenik soy test etmek için bir yöntem sağlamaktır. Bizim PVAT anastomoz aort obez Hastalarda Koroner arter bypass greft cerrahisi uygulanan artan üzerinde bypass greft sitesinden kaynağıdır. Taze izole PVAT enzimatik ayrışmış ve stromal vasküler kesir izole ve tüp, ilk kez insan PVAT kaynaklı progenitör hücre farklılaşması kapasitesini test etmek olanaklı kılar yayılır.
Birincil kültürlü insan PVAT stromal vasküler kesir kullanarak, kök/progenitor hücreler Adipojenik ve Osteojenik, veya chondrogenic soy doğru ayırt etmek için tasarlanmış üç deneyleri test ettik. Onların multipotency değil test edildi, ancak önceki çalışmamızda bir nüfus CD73 +, CD105 + ve sağlam adiposit6', ayırt edebilir PDGFRa + (CD140a) hücreleri tespit edilmiştir. PVAT doğrudan damar sesi ve inflamasyon7düzenlemektedir. PVAT vasküler işlevi özel etkisi ve PVAT genişleme sırasında obezite mekanizmaları anlamaya başlamak için bu roman hücre popülasyonu ayırt etme potansiyelini test için mantığı olduğunu. Bu metodoloji yağ dokusu türetilmiş progenitör hücrelerin işlevlerini anlayışımızı geliştirir ve tanımlamak ve benzerlik ve farklılıkları progenitör hücre farklı doku kaynaklardan karşılaştırın sağlar. Biz izole edip farklı soy doğru MSC differentiating için kurulan ve doğrulanmış yaklaşımlar üzerine inşa ve yordamlar insan PVAT kaynaklı progenitör hücre canlılığı en üst düzeye çıkarmak için en iyi duruma getirme. Bu teknikler kök ve progenitör hücre araştırma ve yağ dokusu geliştirme alanlarında geniş uygulamalar var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma içinde insan doku kullanımı değerlendirilir ve kurumsal inceleme kurulu, Maine Tıp Merkezi tarafından onaylanmış ve tüm personel deneme önce uygun eğitim aldı.
1. hazırlıkları
- Ayrılma tampon yapmak 50 mg başlamaktan tarafından hayvan-alerjik collagenase/dispase karışım ben çözüm 1 mL nanopure H2O. hazırla 1 mg/mL çalışma çözeltisi ile yüksek glikoz % 1 w/v-BSA Sulandırılan collagenase içeren DMEM 49 mL ekleyerek / dispase çözüm. 5 mL çalışma aliquots-20 ° C ve kullanmak için bir su banyosu önceden kullanarak 37 ° c sıcak saklayın.
- HBSS için 49 mL 1 mL (son konsantrasyonu 200 adet/mL penisilin, 200 adet/mL streptomisin ve 0,5 µg/mL fungizone) 100 x antibiyotik/antimycotic çözüm ekleyerek antibiyotik çözüm alın ve buza saklayın.
- Jelatin çözüm (% 0,2 w/v) 200 mg jelatin nanopure H2O. otoklav 20 dk üçün 100 ml sığır deriden çözülerek hazırlamak ve 4 ° C'de depolayın
- 500 mL PVAT büyüme ortamının hazırlamak: yüksek glikoz DMEM/F12 glutamin takviyesi, sodyum pyruvate ve sodyum bikarbonat, %10 FBS ve 100 µg/mL antimikrobiyal ajan ile (bkz: Malzemeler tablo).
- 50 mL Adipojenik indüksiyon ortam hazırlamak: 40,8 mL yüksek glikoz 7.5 mL PVAT büyüme medya, 100 (son toplama 100 adet/mL penisilin, 100 adet/mL streptomisin ve 0,25 µg/mL fungizone) antibiyotik/antimycotic çözüm, x 500 µL ile takıma DMEM, 0,5 mM IBMX (500 mM stok 0.1 M NaOH), 1 µM deksametazon (etanol hisse senedi 1 mM), 5 µM rosiglitazone (DMSO hisse senedi 5 mM), 33 µM biotin (DMSO hisse senedi 66 mM), 100 nM insülin (200 µM hisse senedi % 0,1 Asetik asit) ve 20 µM pantotenik asit (100 mM hisse senedi H2 O).
- Denetim indüksiyon Medya 50 mL Adipojenik lineage için hazırlamak: 40,8 mL yüksek glikoz DMEM 7.5 mL PVAT büyüme medya ve kalem-strep (100 x hisse senedi) 500 µL ile desteklenmiştir.
- 50 mL Adipojenik bakım ortam hazırlamak: 41,5 mL yüksek glikoz DMEM takıma 7.5 mL PVAT büyüme ortamdan adım 1.3, 500 µL kalem-strep (100 x hisse senedi), 1 µM deksametazon (alkol hisse senedi 1 mM), 33 µM biotin (66 mM DMSO içinde hisse senedi), 100 nM insülin (200 µM stok %0,1 ac ETIC asit) ve 20 µM pantotenik asit (H2O hisse senedi 100 mM).
- Büyüme ortamının 500 mL hazırlamak için Osteojenik ve chondrogenic soy: % 10 ile desteklenmiş yüksek glikoz αMEM FBS, 1 x glutamine ek (bkz. Tablo reçetesi) ve 5 mL kalem-strep (100 x hisse senedi).
- İndüksiyon Medya 50 mL Osteojenik lineage için hazırlamak: 10 nM deksametazon ve 10 mM β-gliserofosfat ile kemik iliği MSC büyüme ortamının 50 mL.
- İndüksiyon Medya 50 mL chondrogenic lineage için hazırlamak: 100 nM deksametazon, 50 µg/mL sodyum askorbat-2-fosfat ve 10 ng/mL TGFβ1 ile kemik iliği MSC büyüme ortamının 50 mL. Osteojenik ve chondrogenic koşulları için Bazal kemik iliği MSC büyüme medya indüksiyon medya olarak görev yapacak.
2. iletişim kuralı 1: Kültür insan PVAT hücrelerden Stromal vasküler kesir
Not: PVAT imzalat Hastalarda Koroner arter bypass greft yordamlar geçiren artan aort greft anastomoz yapmama sitesinden rezeke. Aort PVAT bir 15 mL konik içeren 10 mL buz soğuk yüksek glikoz DMEM F12 yerleştirilir ve laboratuvar rezeksiyon 2 h içinde ameliyathane aktarılır. Aort PVAT yan yol yordam sırasında atılan dokudur ve insan olmayan konularda araştırma Maine Tıp Merkezi'nın iç inceleme Kurulu tarafından kabul edilmiş.
- Bu insan PVAT (yaklaşık 3 x 1 x 0.5 cm3) ~ 500 mg parçası için iletişim kuralıdır. Taze insan PVAT DMEM bir 50 mL konik tüp antibiyotik 25 mL solüsyon içeren aktarın. 4 ° C'de 20 dk için sallanan ile kuluçkaya PVAT antibiyotik çözüm olsa da, bir aliquot ayrılma arabelleği 37 ° C'de erimek
- Çözeltinin 100 x antibiyotik/antimycotic 50 µL 5 mL ayrılma arabelleğe eklemek ve 0,22 µm şırınga filtre sterilize. 1 mL jelatin çözeltisi için 24-şey plaka de 1 ekleyin. Bir laminar akış başlık, steril forseps ve makas PVAT antibiyotik çözüm için steril Petri kabına aktarmak için kullanın. Önceden ısıtılmış ayrılma arabellek 1 mL için doku ekleyin ve ince bir bulamaç (no adet ~ 2 x 2 mm2' den daha büyük) içine tüm doku kıyma steril forseps ve diseksiyon makası kullanarak.
- 1 mL Bulamaç 4 mL ayrılma arabelleğe aktarmak ve 1 h için bir Önceden ısıtılmış 37 ° C orbital shaker-200 devirde kendi tarafında tüp kuluçkaya. 1 h sonra hiçbir görünür doku parçaları mevcut olacak ve çözüm bulutlu hücre süspansiyon görünür.
- 50 mL konik tüp ayarla 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla çözüm filtre. Süzgeç mümkün olduğunca çok sayıda hücre yakalamak için bir ek 10 mL antibiyotik çözüm ile yıkayın. Süzgeç sıkmak değil.
- 300 x g sallanan bir kova santrifüj, 12 dk için hücreleri cips.
Not: Santrifüjü sonra tüp adipositler, bir interfaz ve bir Pelet yağlı bir üst tabaka ayrılacaktır. Pelet stromal vasküler kesir endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri, kan hücreleri ve progenitör hücreler içeren olduğunu. - Pelet, HBSS ve santrifüj 300 x gde 5 min için 10 ml resuspend. Toplam HBSS içinde 2 yıkama için bu adımı yineleyin. Son yıkama sonra kırmızı kan hücreleri parçalayıcı değil. Çeşitli ticari olarak kullanılabilir arabellek ve kuluçka süreleri ile tekrarlanan denemelerden progenitör hücre bağlanma ve canlılığı işaretli indirimleri açmıştır.
- 24-şey plaka jelatin Aspire edin. Yavaşça de 1 x ilişkisiz jelatin kaldırmak için HBSS ile yıkayın.
- Büyüme medya ve tohum jelatin kaplı üzerine 1 ml stromal vasküler kesir Pelet olduğu gibi kırmızı kan hücreleri ile resuspend de. İnsan FGF2 (% 0,01 BSA w/v ile desteklenmiş PBS resuspended) 25 ng/mL kültür ortamında son bir konsantrasyon ekleyin. %5 CO237 ° C'de 24 h için kuluçkaya.
- Ertesi gün, Kaldır büyüme medya ve yıkama kuyuları ile kırmızı kan hücreleri ve ölü hücreleri kaldırmak için HBSS 5 x. 1 mL 25 ng/mL ile FGF2 takıma taze büyüme ortamının ekleyin.
- Medya her 48 h, 25 ng/mL ile ek olarak emin değiştirmek taze FGF2 her zaman.
-
Hücreleri genellikle 7-10 gün sonra explant % 100 izdiham ulaşmak; sonra geçiş hücreleri:
- Büyüme medya ve yıkama monolayer 2 Aspire x 1 ml HBSS. Tüm HBSS kuyulardan Aspire edin ve hücre ayrılma çözümü birkaç damla ekleyin.
- Dokunun ve plaka birkaç kez girdap ve % 5 CO2 hücreleri kaldırmak 5-7 dk 37 ° C'de kuluçkaya. ~ 1 mL taze kültür ortamının müstakil hücrelere ekleme ve bir 24-şey plaka, içeren her 500 µL büyüme medya ve 25 2 kuyu için 500 µL dağıtmak ng FGF2.
- Önceki adımda gösterildiği gibi insan PVAT elde edilen hücreleri genişletmeye devam ediyoruz. Her geçiş 1:2 bölme büyük olmalıdır. Hücreleri 5 – 7 kez farklılaşma deneyleri için tahsis etme önce pasajlı.
3. Protokolü 2: Kültür insan kemik iliği MSC kolonileri
Not: İnsan kemik iliği MSC açıklanan8 olarak izole ve erken geçiş hisse senetleri donmuş olarak depolanan sıvı N2' medya (% 70 FBS % 20 Bazal DMEM ve % 10 DMSO) ~ 100.000 hücre/mL, dondur.
- Hızla MSC büyüme ortamının 3 mL içeren 6-şey kültür plaka bir de kemik iliği MSC 37 ° C su banyosu ve plaka sıvı N2 şişe çözülme ve gecede 37 ° C ve %5 CO2kuluçkaya.
- Ertesi gün, MSC kültür medya Aspire edin ve hücreleri 3 yıkama x 2 ml HBSS. % 100 izdiham, büyüme medya Aspire edin ve hücreleri 3 yıkama x 2 ml HBSS. 500 µL/iyi hücre dekolmanı çözümü ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO2 5 dk. tüm hücreler sağlamak için plaka yerinden dokunun için kuluçkaya ve 2 mL MSC büyüme ortamı içeren bir 6-şey plaka 2 kuyu içindekilere eşit olarak dağıtabilmenizi.
- İnsan kemik iliği ve PVAT elde edilen MSC paralel yaklaşık 5-7 pasajlar için veya test etmek için yeterli miktarda elde kadar genişletin.
4. Protokolü 3: Plaka ve Adipojenik ve Osteojenik, ve Chondrogenic soy
- Plaka uygun sayıda kemik iliği ve PVAT elde edilen hücre başına 12-şey plaka ve uygun deneysel her koşul için çoğaltır. Adipojenik ve Osteojenik koşulları, ~ 200, 000-225.000 hücreler/iyi, chondrogenic koşulları için 150.000-175.000 hücreler/iyi ihtiyaç vardır ihtiyaç vardır.
Not: N en az koştu 3 Çoğalt kuyular için denetim = ve toplam 2 bağımsız çalışan için koşullar her deneysel lineage için indüklenen (N = 6 çoğaltır toplam). - PVAT progenitör hücre nüfus ve hücre dekolmanı çözümü ve kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 de 5 dk. havuzu nüfus ayrı 15 mL konik tüpleri içine kullanan insan kemik iliği MSC kesimin hücrelerden ilişkilendirmelerini kaldırın. Spin aşağı flakon 500 x g hücreleri cips için 7 dakika için de. 1 mL PBS resuspend ve bir hemasitometre cep numarasını tahmin etmek için kullanın.
- 12-iyi yemekler hücrelerde 4.1 adımda gösterildiği gibi plaka. Sigara kaynaklı durum daha önceki bir zaman noktasına kültür indüklenen durumunun devam aksatmadan sabit olabilir böylece ayrı yemekleri indüklenen ve sigara kaynaklı Adipojenik ve Osteojenik ve koşullar için sağlar.
- Adipojenik ve Osteojenik indüksiyon medya 1,5 mL indüklenen koşul her şey için ekleyin. Adipojenik ve Osteojenik indüksiyon medya 1,5 mL sigara kaynaklı koşul her şey için ekleyin. Adipojenik ve Osteojenik indüklenen ve sigara kaynaklı hücre popülasyonlarının 37 ° C ve % 5 CO2kuluçka başlar.
- Spin aşağı kalan hacmi insan PVAT progenitor hücreler ve insan kemik iliği MSCs 500 x gde 7 dk için.
- Kalan kemik iliği ve PVAT elde edilen hücre topakları 100.000 hücreler/10 µL (106 hücre/mL) yoğunluğu elde etmek için resuspend için gerekli birim belirlemek. Granül MSC büyüme medya chondrogenic lineage indüksiyon için hesaplanan hacmi resuspend. Yavaşça hücreleri homojen bir dağılım sağlamak için bir damlalıklı kullanarak yukarı ve aşağı hareket.
- 10 µL damlacık konsantre hücre çözümün bir micromass 100.000 hücre oluşturmak için her şey ortasına pipette. 1 mL steril H2O buharlaşma önlemek için bitişik kuyuda yerleştirin. Micromass izin vermek için 37 ° C ve % 5 CO2 2 h micromass kültürler kuluçkaya toplamak için.
- 2 saat sonra dikkatli bir şekilde 10 ng/mL ile çivili chondrogenic farklılaşma medya ekleyin her indüklenen-koşul Wells insan TGFβ1. Dikkatle indüksiyon medya (kemik iliği MSC büyüme medya) 1,5 mL sigara kaynaklı koşulu wells için ekleyin. Böylece sigara kaynaklı durum-ebilmek saptanmak daha önceki bir zaman noktasına ayrı 12-şey levhalar için indüklenen ve sigara kaynaklı koşullar kullanıyorsunuz.
5. Protokolü 4: Kültür Adipojenik, Osteojenik ve 14 gün boyunca Chondrogenic soy
- Medya 2 günde yenileme 37 ° C ve % 5 CO2, 4 gün için tüm üç soy indüklenen ve sigara kaynaklı şartlarına kültür. 4 günde bakım medyaya tahlil geri kalanı için indüksiyon medyadan indüklenen Adipojenik lineage koşulu değiştirin.
- Sigara kaynaklı koşulların tümü % 10 formalin 12 h. formalin atmayın için fix ve yıkama tüm sabit PBS formalin bütün izlerini kaldırmak için 2 x kuyuları. Tabak PBS içinde işleme kadar 4 ° C'de depolayın.
- 14 gün medya her 2 gün yenileniyor, indüklenen şartları toplam kültür. Taze TGFβ1 10 ng/mL son konsantrasyonu chondrogenic indüksiyon medya her yenileme ile ekleyin. Adipojenik lineage Adipojenik bakım medya ve Osteojenik lineage indüksiyon medya, 2 günde bir yenileme kültür devam ediyor. 14 gün 12 saat için tüm bağlı koşullar boyama için % 10 formalin fix.
- Gırç veya micromass bağlı chondrogenic durumda katıştırma için bir kaset içine dökün. Micromass giderek yoğun alkol hamamlar % 70, sonra %80, % 95'i, iki kez ve iki kez daha mutlak alkol başlayarak 5 min için bir dizi kurutmak. Bir dealcoholization Ajan kaset yerleştirin ve sonra nihayet parafin kesit ve boyama için kaset embed.
6. iletişim kuralı 5: Adipojenik koşulu ile petrol boyama kırmızı O
- Yağ kırmızı O hisse senedi çözüm petrol kırmızı O 350 mg 100 ml % 100 isopropanol çözülerek hazırlayın. 2s için 0.2 µm filtreden bir heyecan bar ve vakum ile karıştırın. Hisse senedi çözüm içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında için 1 yıl muhafaza edilebilir.
- Yağ kırmızı O hisse senedi çözüm 2 parça diH20 (örneğin 60 mL stok çözeltisi 40 mL diH20) 3 parça karıştırılarak çözüm çalışma hazırlamak. Son petrol kırmızı O çalışma çözüm 2.1 mg/mL bölgedir.
- Tüm sıvı kuyulardan kaldırın. Her şey 2 x % 60 isopropanol, Bütün su kuyuları taraftan tamamen kaldırmak emin ile yıkayın. % 60 isopropanol Aspire edin ve hızlı bir şekilde alt kapsayacak şekilde wells duvarları dokunmadan petrol kırmızı O çalışma çözüm ekleyin. Bu kuyuları kuru değil bu yüzden bu adımı hızlı yapılması önemlidir.
- Yağ kırmızı O eklendikten sonra hafif sallanan ile oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
- Tüm yağ kırmızı O kaldırmak ve hemen distile H2O. yıkama ile distile H2O ilişkisiz petrol kırmızı O. kaldırmak başlamak 10 m için ekleyin 10 dk sonra yağ kırmızı O Aspire edin ve 3 çamaşır yordamı yineleyin x.
- Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra PBS ekleme ve hücreleri görüntü. PBS hücrelerde 4 ° C'de lekeli mağaza
7. Protokolü 6: Osteojenik koşulu Alizarin Red ile boyama
- Tüm sıvı her kuyudan çıkarın. Her şey (iyi bir 12-şey tabak başı 1,5 mL) % 2 Alizarin Red leke çözüm uygun miktarda ekleyin ve kadar çözüm tamamen kuyunun kapsar plaka yan yana hafifçe eğimli.
- 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Alizarin Red kuyulardan kaldırın. Yavaşça her şey dört kez distile H2ile kalsiyum kristalleri çıkarmak değil dikkat çekici O, durulayın. Kurumasını sağlar.
8. protokol 7: Chondrogenic koşulu ile Masson'ın Trichrome boyama
-
Distile su Deparaffinize ve hidrat bölümleri slaytlar 30 dk. 60 ° C kuru fırında pişirin.
- Suyla temasa için koyun slaytlar içinde alkol konsantrasyonu aşağıdaki gibi azalan 5 dk incubations ardından dealcoholization ajanlar ile üç 5 dk incubations: iki (mutlak etanol) % 100, % 95 alkol ikişer, ikişer % 80, 2'de % 70 ve nihayet iki inç distile Bouin'ın sabitleştirici hazır iken H2O. slaytlar H2O kalabilir.
- Bouin'ın sabitleştirici (ortaya) plastik mikrodalga coplin kavanoz içinde yer 40 mL. Yüksek sıcaklığı 55 ° C'ye getirmek için mikrodalga Slayt 20 dk için ısıtmalı çözüm yerleştirin; üstünde belgili tanımlık sayaç izin stand kaplı. Musluk suyu 10 dk ya da tüm sarı renk kaybolana kadar çalışan yıkayın.
- 10 dk. yıkama Weigert'ın Hematoksilen bölümlerde musluk suyu 10 min için çalışan leke.
- Beibrich'ın scarlet asit fuchsin çözüm için 10 dk. yıkama 3 x 10 dk musluk suyundaki bölümlerde leke. Phosphotungstic/phosphomolybdic asit solüsyonu 10 dk içinde Mordan slaytlar. Durulama değil.
- Slaytlar doğrudan anilin mavi çözüm için 10 dk. durulama musluk suyundaki iki kısa dips ile yerleştirin.
- Slaytlar için 3-5 dk. yıkama 1 dk. yer % 95 etanol 1 dk. Dehydrate musluk suyundaki % 1 Asetik asit çözüm adım 5.4 ve mount sentetik reçine ile gösterildiği gibi yerleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnsan PVAT üzerinden stromal vasküler kesir yalıtım
Şekil 1A bir şematik nerede artan aort örten PVAT elde edildi anatomik bölgenin gösterir. Biz daha önce koroner arter bypass bu örnekler türetilmiş6edildi aşılama geçiren hasta nüfus nitelendirdi. Şekil 1B ameliyat elde edilen insan PVAT bir örneği gösterilir. Şekil 1 c ile Masson'ın Trichrome leke lekeli bir temsilcisi PVAT doku bölümü göstermektedir. Şekil 1 d stromal hücreler PVAT elde edilen nüfus farklılaşma önce genişleme aşamasında gösterilen bir faz sözleşme test var. Hücreleri genişletilmiş ve gelecekte kullanılmak üzere donmuş. Hücreleri genellikle 2. 5 x 105 hücre/mL % 70'i oluşan bir medya yoğunluğu, donmuş FBS, % 20 Bazal (antibiyotik ücretsiz) bir isopropanol Kriyo 24 s ve taşınan bir sıvı N2 dondurucu sıvı faz için uzun-t-80 ° C'de DMEM F12 ve % 10 DMSO Erm depolama.
Adipojenik farklılaşma
İnsan kemik iliği türevi MSC (şekil 2AB) ve PVAT elde edilen progenitör hücreler (şekil 2CD) ile paralel olarak çalışmalar yapıldı. Şekil 2 sol panelleri sigara kaynaklı koşul yok lipid birikimi belirgin yerini göster. Doğru kapı aynası, nötr lipitler yağ kırmızı O. ile boyama ve adipocyte farklılaşma aşağıdaki değerleri göster İnsan aort PVAT kaynaklı hücrelere farklılaşma derecesini daha güçlü olsa da, her iki insan hücre kaynakları Adipojenik lineage doğru ayırt etmek için yetenek sergiledi.
Osteojenik farklılaşma
Osteojenik farklılaşma Protokolü insan kemik iliği türevi MSC (şekil 3A-C) ve PVAT elde edilen hücreler (şekil 3D– F) için kullanıldı. Sigara kaynaklı hücreler (şekil 3AD) Alizarin Red ile leke değil. Osteojenik farklılaşma Protokolü sonra insan MSC Alizarin Red (şekil 3B-C), lekeli kalsifiye nodüller geliştirilen insan aort PVAT elde edilen hücreleri yaparken değil (şekil 3E-F). İnsan stromal vasküler kısmını hücrelerden bizim hazırlanması PVAT eksikliği ataları önemli sayıda geçmesi yeteneği ile bu verileri belirtmek osteogenesis. Çalışma ve saat ders farklılaşma bağlı olarak, standart lekeleri Osteojenik lineage bağlılık (RUNX2, osterix, alkalen fosfataz gibi) veya dokusunu (osteopontin, define moleküler işaretleyiciler tespiti ile takip önerilir osteokalsin, alkalen fosfataz, BAP1).
Chondrogenic farklılaşma
Hücreleri her iki insan kemik iliği MSC (şekil 4A) elde edilen ve insan PVAT (şekil 4B) chondrogenic farklılaşma, micromass bol kollajen birikimi ile karakteristik özellikleri görüntülemek. Micromasses oluşan insan kemik iliği MSC ve aortik PVAT elde edilen hücreleri de sergilenen glikozaminoglikan (mavi) bol birikimi Alcian mavi boyama tarafından belirtildiği şekilde (şekil 4 c– D, sırasıyla). Morfolojik, yapıları lacunae için benzer hücreler boşluklar kollajen birikimi (şekil 4, oklar) çevreleyen oturan tespit edildi. Farklılaşma, belirli chondrogenic işaretleri (aggrecan, kolajen tip II, osteonectin, Sox9) tespiti çalışma ve saat ders bağlı olarak yararlıdır.
Şekil 1: insan PVAT Morfolojik özellikleri. (A)Cartoon PVAT (sarı) çevreleyen ile insan aort (kırmızı) tasviri. Ok artan aort gösterir. (B) A 480 mg DMEM CABG hastada ayrılma önce gelen insan aort PVAT parçası. (C) Masson'ın formalin sabit parafin gömülü insan PVAT trichrome boyama (koyu kahverengi/siyah çekirdekleri, = mavi/mor bağ dokusu, pembe = sitoplazma; = Dikkat, RBC kırmızımsı pembe görünür. (D) explanted PVAT-stromal hücre kültüründe 7 gün, temsili resim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Adipojenik farklılaşma. (A)faz mikroskobu sigara kaynaklı durumda insan kemik iliği MSC gösterir farklılaşma izine rastlanmadı. (B) bazı farklılaşma ve nötr lipitler, immobilizasyon faz mikroskobu indüklenen Adipojenik durumda insan kemik iliği MSC gösterir petrol kırmızı O ile 14 gün sonra lekeli. (C) faz mikroskobu insan aort PVAT elde edilen hücre sigara kaynaklı Adipojenik durumda gösterir farklılaşma izine rastlanmadı. (D) faz mikroskobu insan aort PVAT elde edilen hücre indüklenen Adipojenik durumda sağlam farklılaşma ve nötr lipitler, immobilizasyon gösterir petrol kırmızı O ile 14 gün sonra lekeli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Osteojenik farklılaşma. (A)faz mikroskobu sigara kaynaklı Osteojenik durumda insan kemik iliği MSC gösterir farklılaşma Osteojenik bir soy doğru izine rastlanmadı. (B) faz mikroskobu kültür 14 gün sonra bağlı durumda insan kemik iliği MSC gösterir kanıt farklılaşma ve kalsiyum mevduat Alizarin Red (oklar) ile lekeli oluşumu. Osteojenik lineage (oklar, doğru başarılı farklılaşma düşündüren bol kalsiyum birikimi, (C) de Alizarin Red ile boyama takip indüklenen Osteojenik durumda insan kemik iliği MSC içeren bir görüntü gösterir Kalsiyum birikimi). (D) faz mikroskopi PVAT elde edilen aort insan hücre sigara kaynaklı Osteojenik durumda sergileyen farklılaşma Osteojenik bir soy doğru belirtisi yok. (E) faz mikroskopi PVAT elde edilen aort insan hücre kültüründe 14 gün sonra indüklenen Osteojenik durumda farklılaşma Osteojenik bir soy doğru kanıtı yok veya yalnızca Alizarin Red ile lekeli zaman kalsiyum birikimi gösterir non-spesifik boyama. (F) de insan aort PVAT elde edilen hücreleri aşağıdaki Alizarin Red ile boyama sadece non-spesifik gösterir indüklenen Osteojenik koşulu içeren bir görüntü boyama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Chondrogenic farklılaşma. (A, B) Micromass bir bölümünün ışık mikroskobu insan kemik iliği MSC (A) veya insan aort PVAT tarafından 14 gün içinde kültür progenitör hücreler (B) indüklenen chondrogenic koşul Kaiserliche ve daha sonra gösterir Masson'ın Trichrome ile önemli lekeli kollajen (mavi) birikimi ve chondrogenic lineage doğru başarılı farklılaşma göstermektedir. (C, D) Micromass bir bölümünün ışık mikroskobu insan kemik iliği MSC (C) veya insan aort PVAT tarafından progenitör hücre (D) indüklenen chondrogenic durumda sonra 14 gün içinde kültür kurdular ve daha sonra Alcian ile mavi lekeli, asidik birikimi gösterir Proteoglikanlar (örneğin glikozaminoglikan) olarak genellikle kıkırdak içinde bulunur. Counterstain, nükleer hızlı kırmızı; okları, lacunae benzeri yapılar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adipose progenitör hücrelerin farklı depoları fenotip ve farklılaşma potansiyeli9' büyük ölçüde değişmektedir. PVAT türetilmiş ataları üç farklı soy aşağı eşzamanlı indüksiyon bir tek hasta donörden kültür, Adipojenik ve Osteojenik ve chondrogenic, izin verir Bu romanın pluripotent kapasitesi iyi kontrollü bir soruşturma için nüfus progenitör hücre. Bu raporda açıklanan metodoloji insan PVAT progenitör hücre farklılaşması kapasite sınamak ve PVAT patolojiler ve vasküler sesi düzenlenmesinde onların işlevini anlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin bazı yararları sadeliği ve kullanımı insan dokudan birincil: Koroner arter bypass hastalar, böylece soruşturma ciddi kardiyovasküler hastalığı olan hastalarda da PVAT progenitör hücre işlevinin etkinleştirilmesi. Ancak, explants 500 mg parça doku genellikle verim < 1000 yapışık hücreleri ve böylece bu yaklaşımın bir önemli uyarı vurgulayarak yeterli sayı elde etmek için 5 – 7 pasajlar istemek. İlk hücre explant PVAT donörden kalitesini tri-lineage farklılaşma deneyler başarısı için önemlidir. İnce doku enzimatik ayrılma önce iyice kıyma esastır. Kırmızı kan hücre lizis tampon kaplama önce kullanıldığında ek olarak, diğer explant protokollerinden farklı olarak, cep telefonu numarasını, canlılık ve genel kalitesi dramatik kaybı bulduk. Bunun yerine, tüm stromal vasküler kesir (kırmızı kan hücreleri de dahil olmak üzere) plaka için önerilir. 24 saat sonra yapışık hücreleri ekli var ve kırmızı kan hücreleri olmayan lysed-ebilmek var olmak çıkarmak ile HBSS ile tekrar tekrar yıkar. PVAT türetilmiş stromal hücreler passaging 1:2 bölmeleri büyük olmalıdır. Hücreleri Böl 1:3 veya daha fazla zaman büyüme oranı bir azalma görülmektedir.
Bir "micromass" ve histolojik gömme ve kesit kodlamayla hücrelerinin daha az yaygın bir yöntem gerektirdiği en zor trilineage farklılaşma tahlil chondrogenic koşul bileşenidir. Düzgün 100.000 hücre 10 µL damlacık plaka ve kitle kültürü orta ekleme bozmamaya özen göstermelidir. Varyasyon olarak olup olmadığını micromass plaka yapıştırılır kaldı ya da orta askıya deneyleri arasında bulduk. Hatta ne zaman kitle yapıştırılır kalır, micromass yapısı ve hücre canlılığı tutarlı kaldı.
Vasküler microenvironment içinde kök veya progenitör hücre doku onarım yaralanma veya hastalık karşılık olarak sorumludur. Rağmen hala tartışma olup olmadığı hakkında en iyi karakterize pericyte/adventitial bölmeleri türetmek nüfus are insanlar10,11 bu nüfusun standart bir moleküler kimlik olduğunu . Bu protokol için özel olarak bir Osteojenik, chondrogenic veya Adipojenik soy ayırt etmek için onların eğilimi test etmek için insan PVAT türetilen progenitör hücre nüfus inceleriz. Her lineage hücresel bağlılığı tanımlamak için boyama teknikleri kullanarak, biz insan kemik iliği dan MSC progenitör hücrelerin insan PVAT bir Osteojenik lineage (şekil 3) doğru ayırt etmek ama sağlam sergilemek mümkün değildi göstermek Adipojenik farklılaşma. Chondrogenic ayırt etme kapasitesi kemik iliği ve PVAT elde edilen hücreleri arasında karşılaştırılabilir olduğunu. Bu PVAT elde edilen progenitör hücre daha fazla lineage kemik iliği MSC sınırlı olabilir veya PVAT ataları kolayca Osteojenik soy ayırt değil olduğunu göstermektedir. Gelecekteki çalışmaları bir soruşturma daha kantitatif PVAT kaynaklı hücrelere farklılaşma kapasitesini değerlendirmek her lineage için işaretleri gen ve protein ifade içermelidir.
Yağ kaynaklı kök hücre kolay erişim ve yüksek yağ dokusu12,13elde edilebilir hücre sayısı nedeniyle rejeneratif tıp uygulamaları için bir odak noktası olmuştur. Yağ dokusu içinde stromal vasküler kesir damar hücreleri, inflamatuar hücreler, fibroblastlar, preadipocytes ve yağ elde edilen kök hücre vardır. Yağ depo ve adipocyte özellikleri14anatomik konuma göre kök hücre nüfus farklılıklar vardır. En önemlisi, yağ kaynaklı kök hücre sadece Mezenkimal soy15, aynı zamanda potansiyel nöronal16,17 ve epidermal18 kader benimsemeye ayırt etmek için kapasitesine sahip görünüyor.
İnsan subkutan beyaz yağ doku elde edilen kök/progenitor hücreler çok sayıda çalışma odaklı olması, ancak çok az sayıda çalışmalar PVAT atası nüfus özellikleri ele sahip. Son yıllarda yapılan çalışmalarda PVAT çevreleyen Mezenterik damarları veya farenin Torasik aort adipocyte progenitör hücre izole ettim. Bu CD34 + / diğer soy türetmek için değil ne kadar kapasite adiposit farklılaşmış CD140a + nüfus test19.
Son zamanlarda gelişmiş koroner arter hastalığı6hastalardan insan PVAT stromal vasküler kısmını elde adipose progenitör hücreler ile karakterize. Bu yağ progenitör hücrelerin CD73 +, CD105 + CD140a + vardı ve ve verimli bir şekilde içine adiposit termojenik özellikleri (UCP1 ifade)6farklı. Geçerli çalışma, bir eksikliği veya yağ kaynaklı kök hücrelerin diğer insan yağ dokulardan karakterize en az nüfus düşündüren PVAT kaynaklı hücreler kemik iliği türevi MSC için karşılaştırıldığında sınırlı lineage potens bulduk. PVAT örnek ve farklılaşma farklı soy için geçmesi onların kapasite içinde kök/progenitor hücre sayısını etkileyebilir insan örnekler arasında beklenen değişkenlik bu iletişim kuralı için bir noktadır. Yaş, cinsiyet, BMI, ilaçlar ve diğer klinik parametreler büyük olasılıkla fenotip progenitör hücre içinde PVAT etkiler. Böylece, bu protokol beklenen gelecekteki değişiklikler daha fazla açıkça tanımlanmış progenitör nüfus içinde insan PVAT ve muhtemelen hücre sıralama kullanarak belirli alt nüfus lineage Etütler izole etmek için bekliyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz tedarik klinik doku ve histopatoloji ve Histomorfometri (1P20GM121301, L. Liaw PI desteklenen) özünde Maine Tıp Merkezi araştırma ile yardım için Maine Tıp Merkezi araştırma navigasyon yardım kabul Enstitüsü kesit ve boyama için. Bu eser NIH tarafından desteklenen R01 HL141149 vermek (L. Liaw).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| Antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| Biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| Bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4 °C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| Bell strainer (70 mm) | Corning | 352350 | |
| Dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| Formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| Gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| Insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| Pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| Penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| Rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
References
- Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
- Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M.
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
- Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
- de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
- Majesky, M. W.
- Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
- Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
- Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
