Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Differensiering kapasitet på menneskelig aorta Perivascular liggende under Adipose Progenitor celler

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59337
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Maine Medical Center Research Institute

Summary

Målet med denne protokollen er å teste muligheten for stamfar celler avledet fra menneskelige perivascular fettvev å skille ut flere celle overleveringslinjer. Differensiering var i forhold til stamceller fra human benmarg, som er kjent for å differensiere i adipocyte, osteocyte og chondrocyte linjene.

Abstract

Fettvev er en rik kilde av flere potente mesenchymal stamceller (MSC) i stand til å skille i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic linjene. Adipogenic differensiering av stamfar celler er en viktig mekanisme kjøring fettvev utvidelse og dysfunksjon svar til fedme. Forståelse endringer perivascular fettvev (PVAT) er dermed klinisk relevant i metabolsk sykdom. Tidligere studier har imidlertid vært hovedsakelig utført i musen og andre dyr modeller. Denne protokollen bruker thorax PVAT prøver fra mennesker samlet inn fra pasienter som gjennomgår Koronar bypass pode kirurgi. Fettvev fra stigende aorta ble samlet inn og brukt til explantation av pancreatic. Vi tidligere bekreftet tilstedeværelse av adipose progenitor celler i menneskelig PVAT med kapasitet til å skille ut lipid inneholder adipocytter. I denne studien analysert vi videre differensiering potensialet i celler fra pancreatic, antagelig inneholder flere potente progenitor celler. Vi sammenlignet PVAT-avledet celler til human benmarg MSC for differensiering i adipogenic, osteogenic, og chondrogenic linjene. Etter 14 dager av differensiering, bestemte flekker ble benyttet til å oppdage lipid akkumulering i adipocytter (olje røde O), calcific innskudd i osteogenic celler (Alizarin rød), eller glycosaminoglycans og kollagen i chondrogenic celler (Masson's Trichrome). Mens benmargen MSC effektivt differensiert i alle tre linjene, PVAT-avledet celler hadde adipogenic og chondrogenic potensial, men manglet robust osteogenic potensial.

Introduction

Fettvev er en rik kilde av flere potente mesenchymal stamceller (MSC) i stand til å skille i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic linjene1. Dette vevet utvides gjennom hypertrofi av eldre adipocytter og de novo differensiering av bosatt MSC til adipocytter. Perivascular fettvev (PVAT) omgir blodkar og regulerer vaskulær funksjon2,3. Fedme-indusert PVAT ekspansjon forverrer hjerte patologi. Mens multipotent potensialet i MSC fra menneskelige subkutan adipose depoter har vært godt studert4,5, har ingen studier explanted og vurdert differensiering kapasiteten av menneskelig PVAT-avledet stamfar celler, sannsynlig grunn invasiveness av innkjøp. Dermed er målet med dette arbeidet å gi en metodikk explant og utbre progenitor celler fra menneskelige aorta PVAT fra pasienter med hjerte-og karsykdommer og teste deres tilbøyelighet til å skille til osteogenic, chondrogenic og adipogenic linjene. Vår kilde til PVAT er området av anastomose av omkjøringsvei graft på stigende aorta av overvektige pasienter som gjennomgår Koronar bypass pode kirurgi. Fersk-isolert PVAT er enzymatisk avstand og pancreatic er isolert og overført i vitro, slik at vi kan teste for første gang differensiering kapasiteten til menneskelig PVAT-avledet progenitor celler.

Bruke primære kultivert menneskelig PVAT pancreatic, testet vi tre analyser for å indusere stammen/stamfar celler å skille mot adipogenic, osteogenic, eller chondrogenic linjene. Vår tidligere studie identifisert en befolkning på CD73 + CD105 + og PDGFRa + (CD140a) celler som kan robust differensiere i adipocytter6, selv om deres multipotency ikke var testet. PVAT regulerer direkte vaskulær tone og betennelse7. Begrunnelsen for testing differensiering potensialet i denne romanen celle befolkningen er å begynne å forstå spesialiserte påvirkning av PVAT på vaskulær funksjonen og mekanismer for PVAT utvidelse i fedme. Denne metoden øker vår forståelse av funksjonene av fettvev avledet stamfar celler og kan vi identifisere og sammenligne likheter og forskjeller stamfar celler fra ulike vev kilder. Vi bygge på etablerte og validert tilnærminger for å isolere og skille MSC mot ulike overleveringslinjer og optimalisere prosedyrer for å maksimere levedyktigheten til menneskelig PVAT-avledet progenitor celler. Disse teknikkene har bred programmer innen stammen og stamfar cellen forskning og fettvev utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bruk av menneskelig vev i denne studien ble evaluert og godkjent av institusjonelle gjennomgang styret av Maine medisinsk senter og alle fått riktig trening før eksperimentering.

1. forberedelser

  1. Gjøre dissosiasjon buffer av gjenoppbygge 50 mg dyr-fri collagenase/dispase blanding jeg løsning med 1 mL av nanopure H2O. forberede 1 mg/mL fungerende løsning ved å legge til 49 mL av høy glukose DMEM som inneholder 1% w/v BSA til den rekonstituerte collagenase / dispase løsning. Lagre 5 mL arbeider dele på 20 ° C og varmt 37 ° c med en vann bad før for å bruke.
  2. Lage antibiotika løsning ved å legge til 1 mL av 100 x antibiotika/antimycotic løsning (siste konsentrasjon er 200 enheter/mL penicillin, 200 enheter/mL streptomycin og 0,5 µg/mL fungizone) 49 mL av HBSS og lagre på is.
  3. Forberede gelatin løsning (0,2% w/v) ved å løse opp 200 mg gelatin fra storfe huden i 100 mL nanopure H2O. Autoclave løsningen for 20 min og lagre på 4 ° C.
  4. Forberede 500 mL PVAT vekst medier: høy glukose DMEM/F12 glutamin tilskudd, natrium pyruvate og natrium bikarbonat, supplert med 10% FBS og 100 µg/mL antimikrobiell agent (se Tabell for materiale).
  5. Forberede 50 mL adipogenic induksjon medier: 40,8 mL høy glukose DMEM, supplert med 7,5 mL PVAT vekst medier, 500 µL av 100 x antibiotika/antimycotic løsning (siste konsentrasjon er 100 enheter/mL penicillin, 100 enheter/mL streptomycin og 0,25 µg/mL fungizone), 0,5 mM IBMX (500 mM lager i 0.1 M NaOH), 1 µM deksametason (1 mM aksjer i etanol), 5 µM rosiglitazon (5 mM aksjer i DMSO), 33 µM biotin (66 mM aksjer i DMSO), 100 nM insulin (200 µM aksjer i 0,1% eddiksyre) og 20 µM Pantotensyre (100 mM lager i H2 O).
  6. Forberede 50 mL av kontroll induksjon media adipogenic linjen: 40,8 mL høy glukose DMEM med 7,5 mL PVAT vekst medier og 500 µL av penn-strep (100 x lager).
  7. Forberede 50 mL adipogenic vedlikehold medier: 41,5 mL høy glukose DMEM supplert med 7,5 mL PVAT vekst medier fra trinn 1.3, 500 µL penn-strep (100 x lager), 1 µM deksametason (1 mM aksjer i EtOH), 33 µM biotin (66 mM lager i DMSO), 100 nM insulin (200 µM aksjer i 0,1% ac etikk acid), og 20 µM Pantotensyre (100 mM stock i H2O).
  8. Forberede 500 mL vekst medier for osteogenic og chondrogenic linjen: høy glukose αMEM med 10% FBS, 1 x glutamin supplement (se Tabell for materiale), og 5 mL penn-strep (100 x lager).
  9. Forberede 50 mL av induksjon media osteogenic linjen: 50 mL av benmarg MSC vekst media med 10 nM dexamethasone og 10 mM β-glycerophosphate.
  10. Forberede 50 mL av induksjon media chondrogenic linjen: 50 mL av benmarg MSC vekst media med 100 nM dexamethasone og 50 µg/mL natrium ascorbate-2-fosfat 10 ng/mL TGFβ1. Osteogenic og chondrogenic forholdene, vil basale benmarg MSC veksten mediene fungere som ikke-induksjon media.

2. protocol 1: Kultur menneskelige PVAT celler fra pancreatic

Merk: PVAT resected området av pode anastomose på stigende aorta bedøvet pasienter gjennomgår Koronar bypass pode prosedyrer. Aorta PVAT er plassert i en 15 mL konisk inneholder 10 mL isen kalde høy glukose DMEM F12 og overført fra operasjonsstuen til laboratoriet i 2 timer med resection. Aorta PVAT er forkastet vev under omkjøringsvei prosedyren og har blitt ansett som ikke-menneskelige fag forskning av Maine Medical Centers interne Review Board.

  1. Denne protokollen er en ~ 500 mg stykke menneskelig PVAT (ca 3 x 1 x 0,5 cm3). Overføre friske menneskelige PVAT fra DMEM til en 50 mL konisk rør som inneholder 25 mL antibiotika løsning. Inkuber med rock etter 20 min på 4 ° C. Mens PVAT i antibiotika løsning, tine en aliquot dissosiasjon bufferen på 37 ° C.
  2. Legge til 50 µL av 100 x antibiotika/antimycotic løsning 5 mL dissosiasjon buffer og sterilisere bruker et 0.22 µm sprøyte filter. Legge til 1 mL av gelatin løsning 1 godt av en 24-vel plate. I laminær strømning hette, kan du bruke sterilt tang og saks for å overføre PVAT fra antibiotika løsningen til et sterilt Petriskål. Legge 1 mL av forvarmes dissosiasjon buffer til vev og fint hakke hele vevet i en slurry (ingen brikker som er større enn ~ 2 x 2 mm2) bruker sterilt tang og disseksjon saks.
  3. Overføre til 1 mL slurry til 4 mL dissosiasjon bufferen og ruge røret på siden i en forvarmes 37 ° C orbital shaker på 200 rpm 1t. Etter 1 h, ingen synlige vev biter vil være tilstede, og løsningen vises som en skyet celle suspensjon.
  4. Filtrere løsningen gjennom en 70 µm celle sil på toppen av en 50 mL konisk rør. Skyll silen med en ekstra 10 mL antibiotika løsning å fange så mange celler som mulig. Ikke klem silen.
  5. Pellets celler for 12 min på 300 x g i en svingende bøtte sentrifuge.
    Merk: Etter sentrifugering, vil røret bli delt inn i en fet øverste laget av adipocytter, en interphase og pellets. Pellet er pancreatic inneholder endotelceller, immunceller, blod celler og progenitor celler.
  6. Resuspend pellet i 10 mL av HBSS og sentrifuge for 5 min på 300 x g. Gjenta dette trinnet for totalt 2 vasker i HBSS. Etter siste vask, ikke lyse røde blodlegemer. Gjentatte forsøk med flere kommersielt tilgjengelig buffere og inkubasjon ganger har ført til merket reduksjoner i stamfar celle vedlegg og levedyktighet.
  7. Sug opp gelatin fra 24-vel plate. Forsiktig vaske den vel 1 x med HBSS fjerne ubundet gelatin.
  8. Resuspend pancreatic pellets med intakt røde blodlegemer i 1 mL av veksten medier og frø til gelatin-belagt godt. Legge til menneskelig FGF2 (resuspended på PBS med 0,01% BSA w/v) i en siste konsentrasjon av 25 ng/mL i kultur medium. Inkuber 24 h på 37 ° C med 5% CO2.
  9. På den neste dagen brønner Fjern vekst medier og vask 5 x med HBSS fjerne røde blodlegemer og døde celler. Legg i 1 mL av fersk vekst medier med 25 ng/mL FGF2.
  10. Endre media hver 48 h, sørge for å supplere med 25 ng/mL frisk FGF2 hver gang.
  11. Celler vanligvis nå 100% samløpet 7-10 dager etter explant; passasjen celler deretter:
    1. Sug opp vekst medier og vask monolayer 2 x 1 mL HBSS. Sug opp alle HBSS fra brønnene og legge noen dråper av cellen dissosiasjon løsning.
    2. Trykk og snurr den flere ganger og ruge på 37 ° C med 5% CO2 for 5-7 min å løfte cellene. Legge til ~ 1 mL av fersk kultur medium i frittstående cellene og distribuere 500 µL 2 brønner av en 24-vel plate, hver med 500 µL vekst medier og 25 ng FGF2.
  12. Fortsett å utvide menneskelige PVAT-avledet celler som angitt i forrige trinn. Hver passasje skal ikke større enn en splitt 1:2. Cellene er passaged 5-7 ganger før tildele differensiering analyser.

3. protocol 2: Kultur Human benmarg MSC kolonier

Merk: Human benmarg MSC er isolert som beskrevet8 og lagret som tidlig passering frosset aksjer i fryse medier (70% FBS 20% basale DMEM og 10% DMSO) på ~ 100.000 cellen/mL i flytende N2.

  1. Raskt tine ampuller av benmarg MSC fra flytende N2 37 ° C vannbad og plate til en godt av en 6-vel kultur plate inneholder 3 mL MSC vekst medier og ruge over natten på 37 ° C og 5% CO2.
  2. På den neste dagen, Sug opp MSC kultur medier og vaske cellene 3 x 2 mL HBSS. 100% samløpet, Sug opp vekst medier og vaske cellene 3 x 2 mL HBSS. Legge til 500 µL/vel celle avdeling løsning og ruge på 37 ° C og 5% CO2 i 5 min. Trykk platen til sikre alle celler er forskyves og jevnt distribuere innholdet 2 brønner i en 6-vel plate inneholder 2 mL MSC vekst medier.
  3. Utvid human benmarg og PVAT-avledet MSC parallelt i ca 5 til 7 passasjer eller til tilstrekkelige mengder til testing er oppnådd.

4. protokoll 3: Plate og indusere Adipogenic, Osteogenic, og Chondrogenic linjene

  1. Plate riktig antall benmargen og PVAT-avledet celler per brønn av en 12-vel plate og passende replikerer for hver eksperimentelle betingelse. For adipogenic og osteogenic forhold, ~ 200, er 000-225 000 celler/vel nødvendig, for chondrogenic forhold, 150.000-175 000 celler/vel er nødvendig.
    Merk: Vi kjørte minst N = 3 Repliker brønner for kontroll og indusert betingelser for hver eksperimentelle avstamning for totalt 2 uavhengige kjører (N = 6 gjentak totalt).
  2. Fjerne celler fra både PVAT stamfar celle befolkningen og human benmarg MSC befolkningen bruke cell avdeling løsningen og inkubasjon på 37 ° C og 5% CO2 for 5 min. bassenget bestander i separate 15 mL konisk hetteglass. Spinne ampullen ned på 500 x g i 7 min til pellets cellene. Resuspend i 1 mL av PBS og bruk en hemocytometer for å anslå hvor cellen.
  3. Plate cellene i 12-vel retter som angitt i trinn 4.1. Angi separate retter for indusert og ikke-indusert adipogenic, osteogenic, og vilkår slik at betingelsen ikke-indusert kan løses på et tidligere tidspunkt uten å forstyrre fortsetter kultur av indusert tilstanden.
  4. Legge til 1,5 mL adipogenic og osteogenic induksjon hver brønn av indusert tilstanden. Legge til 1,5 mL adipogenic og osteogenic ikke-induksjon hver brønn av ikke-indusert tilstanden. Starte inkubering av adipogenic og osteogenic indusert og ikke-indusert celle populasjoner på 37 ° C og 5% CO2.
  5. Nedspinning gjenværende volumet av menneskelige PVAT stamfar celler og human benmarg MSCs i 7 min 500 x g.
  6. Bestem volumet måtte resuspend gjenværende benmargen og PVAT-avledet celle pellets å oppnå en tetthet av 100.000 celler/10 µL (106 celler/mL). Resuspend pellets i beregnede volumet av MSC vekst medier for chondrogenic avstamning induksjon. Forsiktig flytte volumet av celler opp og ned med en Pipetter for å sikre en homogen distribusjon.
  7. Pipetter en 10 µL dråpe konsentrert celle løsningen i midten av hver brønn å danne en micromass av 100.000 celler. Sett 1 mL steril H2O i den tilstøtende godt for å hindre fordampning. Inkuber micromass kulturer 2 h 37 ° C og 5% CO2 å tillate micromass finne mengdeverdier.
  8. Etter 2 timer, nøye legge chondrogenic differensiering media spiked med 10 ng/mL menneskelige TGFβ1 til hver av indusert-tilstand. Forsiktig legge til 1,5 mL av ikke-induksjon media (benmarg MSC vekst medier) ikke-indusert tilstand brønnene. Bruke separate 12-vel plater indusert og ikke-indusert forholdene slik at betingelsen ikke-indusert kan løses på et tidligere tidspunkt.

5. 4: Kultur Adipogenic, Osteogenic, og Chondrogenic linjene i 14 dager

  1. Kultur indusert og ikke-indusert betingelsene for alle tre linjene i 4 dager på 37 ° C og 5% CO2, forfriskende media hver 2 dager. På dag 4, endre betingelsen indusert adipogenic avstamning fra induksjon media vedlikehold Media for resten av analysen.
  2. Fikse alle betingelsene ikke-indusert i 10% formalin for 12 h. kast formalin og vask alle fast brønner 2 x i PBS å fjerne alle spor av formalin. Oppbevar plater i PBS på 4 ° C før behandling.
  3. Kultur indusert vilkårene for totalt av 14 dager, forfriskende media hver 2 dager. Legge fersk TGFβ1 på 10 ng/mL siste konsentrasjon med hver oppdatering av chondrogenic induksjon media. Fortsette å kultur adipogenic slektslinje i adipogenic vedlikehold media og osteogenic avstamning induksjon media, forfriskende hver 2 dager. På dag 14, fikse alle indusert betingelser for 12 h i 10% formalin til farging.
  4. Skrape eller helle micromass indusert chondrogenic tilstanden i en kassett for innebygging. Tørke micromass i en rekke stadig mer konsentrert alkohol bad i 5 min, begynner på 70%, og 80%, to ganger i 95%, og to ganger mer i absolutte alkohol. Sett kassetten i en dealcoholization agent og deretter endelig bygge inn kassetten i parafinvoks for skjæring og flekker.

6. protocol 5: Flekker Adipogenic tilstand med olje røde O

  1. Klargjør olje Red O lagerløsning ved oppløsning 350 mg av olje Red O i 100 mL 100% isopropanol. Bland 2 h med rør bar og vakuum gjennom en 0,2 µm. Lagerløsning kan lagres i mørket ved romtemperatur for 1 år.
  2. Forberede olje Red O arbeider løsning ved å blande 3 deler lagerløsning 2 deler di20 (f.eks 60 mL av lagerløsning 40 mL di20). Siste konsentrasjonen av olje Red O i arbeider løsningen er 2.1 mg/mL.
  3. Fjern alle væske fra brønner. Vask hver vel 2 x med 60% isopropanol, sørge for å fjerne alle vann fra sidene av brønnene. Sug opp 60% isopropanol og raskt legge olje Red O fungerende løsning uten å berøre veggene av å dekke bunnen. Det er viktig at dette trinnet er gjort raskt så brønnene ikke tørr.
  4. Når olje Red O er lagt, ruge i 10 min ved romtemperatur med milde rocking.
  5. Fjerne alle olje Red O og umiddelbart legge destillert H2O. Wash med destillert H2O for 10 m å begynne å fjerne ubundet olje Red O. Etter 10 min, Sug opp olje Red O og gjenta vask 3 x.
  6. Når vasking er ferdig, legger PBS og image cellene. Lagre farget celler i PBS på 4 ° C.

7. protocol 6: Flekker Osteogenic tilstand med Alizarin rød

  1. Fjern alle væsken fra alle brønnene. Legge til riktig mengde 2% Alizarin rød flekk løsning i hver brønn (1,5 mL per brønn for en 12-vel plate) og forsiktig tilt den platen til siden til løsningen dekker helt bunnen av brønnen.
  2. Inkuber i 15 min ved romtemperatur. Fjern Alizarin Red fra brønnene. Forsiktig rense hver også fire ganger med destillert H2O, ta forsiktig å ikke fjerne kalsium krystaller. La tørke.

8. protocol 7: Flekker Chondrogenic tilstand med Masson's Trichrome

  1. Stek lysbilder i 60 ° C tørr ovn i 30 min. Deparaffinize og hydrat delene til destillert vann.
    1. For å vanne, plassere lysbilder i tre 5 min incubations med dealcoholization agenter, etterfulgt av 5 min incubations i synkende alkohol konsentrasjoner som følger: to på 100% (absolutt etanol), to på 95% alkohol, to på 80%, to på 70%, og til slutt to i destillert H2O. lysbilder kan forbli i H2O mens Bouins bindemiddel er forberedt.
  2. Sted 40 mL Bouins bindemiddel i en plast microwavable coplin jar (avdekket). Mikrobølgeovn på høy å bringe temp til 55 ° C. Plasser lysbildet i oppvarmet løsning for 20 min; La stå på disken dekket. Vask i rennende vann fra springen i 10 min eller til alle den gule fargen forsvinner.
  3. Stain inndelinger i Weigert's hematoxylin for 10 min. vask i rennende vann fra springen i 10 min.
  4. Stain delene i Beibrich's scarlet syre fuchsin løsning for 10 min. vask 3 x 10 minutter i vann fra springen. Mordant lysbilder i phosphotungstic/phosphomolybdic sur løsning for 10 min. Ikke skyll.
  5. Plasser lysbilder direkte i anilinhud blå løsning for 10 min. skyll med to kort dypper i vann fra springen.
  6. Plasser lysbilder i 1% eddiksyre løsning for 3 til 5 min. vask vann i 1 sted i 95% etanol i 1 Dehydrate som angitt i trinn 5.4 og montere med syntetisk harpiks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering av pancreatic fra menneskelig PVAT

Figur 1A viser en skjematisk av anatomiske området der PVAT overliggende stigende aorta ble innhentet. Vi beskrev tidligere pasientgrupper gjennomgår Koronar bypass pode som disse prøvene var avledet6. Figur 1B viser et eksempel på den menneskelige PVAT innhentet etter operasjonen. Figur 1 c viser et representativ PVAT vev delen med Masson's Trichrome flekken. Figur 1 d er en fase kontrakt mikroskop-bilde viser en befolkning på PVAT-avledet stromal celler i ekspansjon fasen før differensiering. Cellene kan expanded og frosset for fremtidig bruk. Cellene er vanligvis frosset på en tetthet på 2.5 x 105 celler/mL i media består av 70% FBS, 20% basale (antibiotika gratis) DMEM F12 og 10% DMSO i en isopropanol kryokammeret ved-80 ° C i 24 h og flyttet til flytende fase av flytende N2 fryser for lang-t erm lagring.

Adipogenic differensiering

Studier ble utført parallelt med menneskelige Ben margtransplantasjon-avledet MSC (figur 2AB) og PVAT-avledet progenitor celler (figur 2CD). Venstre paneler av figur 2 viser den ikke-indusert tilstanden, der lipid aldri er tydelig. Høyre panelene Vis cellene etter adipocyte differensiering og flekker av nøytrale lipider med olje Red O. Graden av differensiering i de menneskelige aorta PVAT-avledet cellene er mer robust, utstilt begge human celle kilder muligheten til å skille mot den adipogenic avstamning.

Osteogenic differensiering

Osteogenic differensiering protokollen ble brukt til menneskelig bein margtransplantasjon-avledet MSC (figur 3A-C) og PVAT-avledet celler (figur 3D-F). Ikke-indusert celler (figur 3AD) ikke flekker med Alizarin rød. Etter osteogenic differensiering protokollen, menneskelige MSC utviklet calcified knuter farget med Alizarin rød (figur 3B-C), mens menneskelige aorta PVAT-avledet celler ikke (figur 3E-F). Disse data tyder på at vår forberedelse av celler fra pancreatic av menneskelig PVAT mangler betydelig antall progenitors muligheten til å gjennomgå osteogenesis. Avhengig av studier og tid løpet av differensiering er det lurt å følge opp standard flekker med oppdagelsen av molekylære markører som definerer osteogenic avstamning engasjement (f.eks RUNX2, osterix, alkalisk fosfatase) eller osteoblasts (osteopontin, osteocalcin, alkalisk fosfatase, BAP1).

Chondrogenic differensiering

Celler avledet fra begge human benmarg MSC (figur 4A) og menneskelig PVAT (figur 4B) viser funksjoner kjennetegner chondrogenic differensiering, med rikelig kollagen akkumulering i micromass. Micromasses dannet fra human benmarg MSC og aorta PVAT-avledet celler også utstilt rikelig opphopning av glycosaminoglycans (blå) som indikert av Alcian blå flekker (figur 4C-D, henholdsvis). Morphologically, ble strukturer som ligner hull oppdaget med celler sitter i hulrom rundt ved avleiring av kollagen (Figur 4, piler). Avhengig studier og tid av differensiering, gjenkjenning av bestemte chondrogenic markører (aggrecan, collagen type II, osteonectin, Sox9) er nyttig.

Figure 1
Figur 1: morfologiske kjennetegn av menneskelig PVAT. (A) tegneserie skildring av menneskelig aorta (rød) med omkringliggende PVAT (gul). Pilen viser stigende aorta. (B) en 480 mg stykke menneskelig aorta PVAT fra en CABG pasient i DMEM før dissosiasjon. (C) Masson trichrome farging av formalin-fast parafin-embedded menneskelig PVAT (mørk brun/svart = kjerner, blålilla = bindevev, rosa = cytoplasma; Legg merke til at RBC vises rød-rosa. (D) representativt bilde av explanted PVAT-stromal celler på 7 dager i kultur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Adipogenic differensiering. (A) fase mikroskopi av menneskelig bein margtransplantasjon MSC i betingelsen ikke-indusert viser ingen bevis for differensiering. (B) fase mikroskopi av menneskelig bein margtransplantasjon MSC indusert adipogenic tilstanden viser noen differensiering og immobilisering av nøytrale lipider, farget med olje Red O etter 14 dager. (C) fase mikroskopi menneskelige aorta PVAT-avledet cellene i betingelsen ikke-indusert adipogenic viser ingen bevis for differensiering. (D) fase mikroskopi menneskelige aorta PVAT-avledet cellene i betingelsen indusert adipogenic viser robust differensiering og immobilisering av nøytrale lipider, farget med olje Red O etter 14 dager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Osteogenic differensiering. (A) fase mikroskopi av menneskelig bein margtransplantasjon MSC i betingelsen ikke-indusert osteogenic viser ingen bevis for differensiering mot en osteogenic avstamning. (B) fase mikroskopi av menneskelig bein margtransplantasjon MSC indusert tilstanden etter 14 dager i kultur viser bevis av differensiering og dannelse av kalsium innskudd med Alizarin rød (piler). (C) et bilde av den også inneholder menneskelige bein margtransplantasjon MSC indusert osteogenic tilstanden etter farging med Alizarin rødt angir rikelig kalsium deponering, tyder vellykket differensiering mot en osteogenic avstamning (piler, kalsium deponering). (D) fase mikroskopi aorta menneskelige PVAT-avledet cellene i betingelsen ikke-indusert osteogenic viser ingen indikasjon på differensiering mot en osteogenic avstamning. (E) fase mikroskopi av aorta menneskelige PVAT-avledet celler i indusert osteogenic tilstand etter 14 dager i kultur viser ingen bevis for differensiering mot en osteogenic avstamning eller deponering av kalsium når farget med Alizarin rødt, bare ikke-spesifikk farging. (F) et bilde av den også inneholder de menneskelige aorta PVAT-avledet cellene indusert osteogenic tilstanden følgende flekker med Alizarin rød viser bare ikke-spesifikk farging. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Chondrogenic differensiering. (A, B) * Lys av en del av micromass dannet av human benmarg MSC (A) eller menneskelig aorta PVAT progenitor celler (B) i indusert chondrogenic tilstand etter 14 dager i kultur og senere farget med Masson's Trichrome, som indikerer betydelige deponering av kollagen (blå) og foreslår vellykket differensiering mot en chondrogenic avstamning. (C, D) * Lys av en del av micromass dannet av human benmarg MSC (C) eller menneskelig aorta PVAT progenitor celler (D) i indusert chondrogenic tilstand etter 14 dager i kultur og senere farget med Alcian blå, som indikerer deponering av Sure proteoglycans (f.eks glycosaminoglycans) som vanligvis finnes i brusk. Counterstain, kjernefysiske rask rød; piler, hull-lignende strukturer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Adipose progenitor celler fra ulike depoter varierer mye i fenotypen og differensiering potensielle9. Dyrking PVAT-avledet progenitors fra en enkelt pasient donor i samtidige induksjon ned tre forskjellige linjene, gir adipogenic, osteogenic, og chondrogenic, en godt kontrollerte undersøkelse av pluripotent kapasiteten til denne romanen befolkningen i progenitor celler. Metodikk beskrevet i denne rapporten kan brukes til å teste differensiering kapasitet progenitor celler fra menneskelig PVAT og forstå deres funksjon i å regulere PVAT patologi og vaskulær tone. Noen fordeler av denne teknikken er dens enkelhet og bruk av primære menneskelig vev fra Koronar bypass pasienter, dermed muliggjør etterforskningen av PVAT stamfar celle-funksjonen fra pasienter med alvorlig kardiovaskulær sykdom. Men explants av 500 mg vev vanligvis gi < 1000 tilhenger celler og krever derfor 5 til 7 passasjer å få tilstrekkelig tall, opplyser en viktig påminnelse til denne tilnærmingen. Kritisk for suksess av tri-lineage differensiering eksperimenter er kvaliteten på den første cellen explant fra donor PVAT. Det er viktig å fint hakke vevet grundig før enzymatisk dissosiasjon. I tillegg, ulikt andre explant protokoller fant vi et dramatisk tap av celle nummer, levedyktighet og generell kvalitet når røde blodlegemer lyseringsbuffer ble brukt før plating. I stedet anbefales til plate i hele pancreatic (inkludert røde blodlegemer). Etter 24 timer, tilhenger celler vil ha knyttet og ikke-lysed røde blod celler kan fjernes gjennom gjentatt vasker med HBSS. Passaging PVAT-avledet stromal cellene skal ikke større enn 1:2 deler. Observerte vi en reduksjon i veksten når cellene var delt 1:3 eller senere.

Den vanskeligste delen av trilineage differensiering analysen er den chondrogenic tilstanden, som det krever en mindre vanlig metode for dyrking celler i en "micromass" og histologiske innebygging og snitting. Hensyn må tas til riktig plate 10 µL slippverktøyet 100.000 celler og ikke forstyrr massen på legge kultur medium. Vi fant variasjon mellom analyser om micromass forble adhered til plate eller suspendert i medium. Selv når massen ikke fortsatt adhered, forble micromass struktur og celle levedyktigheten konsekvent.

Stammen eller progenitor celler innenfor vaskulære microenvironment er ansvarlig for reparasjon av vev skade eller sykdom. Mest godt preget er populasjoner som er avledet fra pericyte/adventitial rom, men det er fortsatt strid om hvorvidt det er en standardisert molekylær identifikasjon av disse befolkningene i mennesker10,11 . I denne protokollen studere vi en stamfar celle befolkningen spesielt avledet fra menneskelige PVAT å teste deres tilbøyelighet til å skille til en osteogenic, chondrogenic eller adipogenic avstamning. Bruke flekker teknikker for å definere mobilnettet forpliktelse til hver avstamning, viser vi at i motsetning til Sivilingeniør fra human benmarg, stamfar celler fra menneskelige PVAT ikke var kjøpedyktig skille mot en osteogenic avstamning (Figur 3) men utstilling robust adipogenic differensiering. Chondrogenic differensiering kapasitet er sammenlignbare mellom benmargen og PVAT-avledet celler. Dette antyder at PVAT-avledet progenitor celler kan være mer avstamning begrenset enn benmarg MSC eller at den PVAT forfedre ikke lett skille i osteogenic linjene. Fremtidige studier bør inneholde en undersøkelse av genet og protein uttrykk for markører for hver avstamning mer kvantitativt evaluere differensiering kapasiteten til PVAT-avledet celler.

Liggende under adipose-avledet stilk celler vært fokus for regenerativ medisin programmer, enkel tilgang og det høye antallet celler som kan utledes fra fettvev12,13. Innenfor pancreatic i sanntid av fettvev finnes det vaskulære celler, inflammatoriske celler, fibroblaster, preadipocytes og liggende under adipose-avledet stilk celler. Det er forskjeller i befolkningen stamcelleforskningen basert på anatomiske plassering av de adipose depot og adipocyte egenskaper14. Viktigst, synes liggende under adipose-avledet stilk cellen å ha kapasitet ikke bare til å skille ut mesenchymal overleveringslinjer15, men også potensial til å vedta neuronal16,17 og epidermal18 skjebne.

Tallrike studier har fokusert på stammen/stamfar celler avledet fra menneskelige subkutant hvit liggende under adipose vev, men svært få studier har adressert karakteristika mellom de stamfar i PVAT. Nyere studier har isolert adipocyte progenitor celler fra PVAT rundt hvem fartøy eller thoracic aorta av rotte. Disse CD34 + CD140a + bestander differensiert i adipocytter, selv om kapasitet til å utlede andre linjene ikke var testet19.

Vi har nylig preget adipose progenitor celler avledet fra pancreatic av menneskelig PVAT fra pasienter med avansert coronary arterien sykdom6. Disse adipose progenitor celler var CD73 + CD105 + og CD140a +, og differensiert effektivt i adipocytter med thermogenic egenskaper (UCP1 uttrykk)6. I den nåværende arbeidet fant vi en begrenset avstamning styrke av PVAT-avledet celler sammenlignet med Ben margtransplantasjon-avledet MSC, antyder en mangel eller minimal befolkningen i liggende under adipose-avledet stilk celler som har vært preget fra andre menneskelige liggende under adipose vev. En vurdering for denne protokollen er den forventede variasjonen mellom menneske prøver, som kan påvirke antall stem/stamfar celler innenfor PVAT prøven og deres evne til å gjennomgå differensiering å forskjellige linjene. Alder, kjønn, BMI, medisiner og andre kliniske parametere sannsynlig påvirke fenotypen av stamfar celler innenfor PVAT. Dermed venter forventede fremtidige endringer i denne protokollen mer klart definert stamfar innbyggere i menneskelige PVAT, og muligens bruke celle sortering isolere bestemte undergrupper for avstamning studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi erkjenner hjelp av forskning navigasjon Maine Medical Center for å assistere med anskaffelse av klinisk vev, og histopatologi og Histomorphometry kjernen (støttet av 1P20GM121301, L. Liaw PI) for Maine Medical Center forskning Institutt for skjæring og flekker. Dette arbeidet ble støttet av NIH gi R01 HL141149 (L. Liaw).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I   Millipore-Sigma SCR139 50mg
Alcian Blue NewComerSupply 1003A 1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red Amresco 9436-25G
alpha-MEM ThermoFisher 12561056
Aniline Blue NewComerSupply 10073C
Antibiotic/antimycotic ThermoFisher 15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin Millipore-Sigma A3908-25G
b-glycerophosphate Millipore-Sigma G9422-10G
Biebrich Scarlet EKI 2248-25G
Biotin Millipore-Sigma B4501-100MG
Bouin's fixative NewComerSupply 1020A
Bovine serum albumin Calbiochem 12659 stored at 4 °C
Cell detachment solution Accutase AT104
Bell strainer (70 mm) Corning 352350
Dexamethasone Millipore-Sigma D4902-100MG
DMEM Corning 10-013-CV 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium ThermoFisher 10565-042 high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO Millipore-Sigma D2650
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals  S11550
FGF2 Peprotech 100-18B
Formalin NewComerSupply 1090
Gelatin, bovine skin Millipore-Sigma G9391-500G
Glutamax ThermoFisher 35050061 glutamine supplement
HBSS Lonza 10-547F
IBMX Millipore-Sigma I5879-250MG
Insulin solution Millipore-Sigma I9278-5ML
Oil red O Millipore-Sigma O0625-100G
Pantothenic acid Millipore-Sigma P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution ThermoFisher 15240062 100ml
Permount Fisher SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution Millipore-Sigma P4006-100G/221856-100G
Primocin Invivogen ant-pm-1 Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone Millipore-Sigma R2408-10MG
TGFb1 Peprotech 100-21
Weigert's hematoxylin EKI 4880-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
  2. Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
  3. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  4. Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. Differentiation of adipose stem cells. Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).
  5. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  6. Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
  7. Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
  10. de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
  11. Majesky, M. W. Adventitia and perivascular cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).
  12. Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
  13. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  14. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
  15. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  16. Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
  17. Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
  18. Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
  19. Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).

Tags

Biologi problemet 145 menneskelige perivascular fettvev adipose progenitor celler mesenchymal stamceller chondrogenesis osteogenesis adipogenesis celledifferensiering hjerte-og karsykdommer
Differensiering kapasitet på menneskelig aorta Perivascular liggende under Adipose Progenitor celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scott, S. S., Yang, X., Robich, M.,… More

Scott, S. S., Yang, X., Robich, M., Liaw, L., Boucher, J. M. Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (145), e59337, doi:10.3791/59337 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter