Summary
والهدف من هذا البروتوكول اختبار قدرة الخلايا السلف المستمدة من الأنسجة الدهنية ارتشاح البشرية على التفريق في الأنساب خلية متعددة. تمت مقارنة التمايز للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام البشرية، التي من المعروف أن تفرق في adipocyte، أوستيوسيتي، والأنساب تشوندروسيتي.
Abstract
الأنسجة الدهنية مصدر غنى قوية متعددة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) قادر على التفريق في أوستيوجينيك، أديبوجينيك، والأنساب تشوندروجينيك. أديبوجينيك التفريق بين الخلايا السلف إليه رئيسية يقود التوسع في الأنسجة الدهنية، والخلل الوظيفي في الاستجابة إلى السمنة. وهكذا فهم التغيرات في الأنسجة الدهنية ارتشاح (بفات) ذات الصلة سريرياً في الأمراض الأيضية. ومع ذلك، كانت الدراسات السابقة يغلب أداؤها في الماوس والحيوانات الأخرى نماذج. هذا البروتوكول يستخدم البشرية الصدر بفات العينات التي جمعت من المرضى الذين يخضعون لجراحة الشريان التاجي بالاختلاس. الأنسجة الدهنية من الشريان الاورطي تصاعدي تم جمعها واستخدامها اكسبلانتيشن كسر الأوعية الدموية stromal. نحن سبق وأكدت وجود الخلايا الدهنية السلف في بفات البشرية مع القدرة على التفريق في المحتوية على الدهن adipocytes. في هذه الدراسة، ونحن حلل كذلك إمكانات تمايز الخلايا من الكسر الأوعية الدموية stromal، يفترض أنها تحتوي على خلايا السلف قوية متعددة. أننا بالمقارنة مع الخلايا المستمدة من بفات بنخاع العظام البشرية ماجستير للتمايز في أديبوجينيك، أوستيوجينيك، والأنساب تشوندروجينيك. وبعد 14 يوما تمايز، استخدمت البقع محددة للكشف عن تراكم الدهن في adipocytes (س زيت أحمر)، رواسب كالسيفيك في خلايا أوستيوجينيك (الأليزارين الأحمر)، أو الجليكوزامينوجليكان والكولاجين في الخلايا تشوندروجينيك (Masson's Trichrome). بينما نخاع العظام MSC كفاءة متباينة في جميع الأنساب الثلاثة، قد الخلايا المستمدة من بفات أديبوجينيك وتشوندروجينيك المحتملة، ولكنها تفتقر إلى إمكانات osteogenic قوية.
Introduction
الأنسجة الدهنية مصدر غنى قوية متعددة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) قادر على التفريق في أوستيوجينيك، أديبوجينيك، وتشوندروجينيك الأنساب1. يوسع هذا النسيج من خلال تضخم adipocytes ناضجة وتمايز نوفو دي ماجستير المقيمين في adipocytes. الأنسجة الدهنية ارتشاح (بفات) يحيط بالأوعية الدموية وينظم وظيفة الأوعية الدموية2،3. توسيع بفات الناجمة عن السمنة يؤدي إلى تفاقم أمراض القلب والأوعية الدموية. بينما كانت إمكانات لجنة السلامة البحرية مولتيبوتينت من المستودعات الدهنية تحت الجلد البشري جيدا درس4،5، أي دراسات اكسبلانتيد وتقييم قدرة الخلايا البشرية السلف المستمدة من بفات، يحتمل نظراً للتمايز اختزاع للمشتريات. وهكذا، والهدف من هذا العمل تقديم منهجية explant ونشر الخلايا السلف من البشرية بفات الابهري من المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية واختبار الميل إلى التفريق إلى أوستيوجينيك، تشوندروجينيك، والأنساب أديبوجينيك. لدينا مصدر بفات من الموقع لملامسة للاختلاس الالتفافية في ترتيب تصاعدي الشريان الاورطي للمرضى الذين يعانون من السمنة المفرطة يخضعون للاختلاس الشريان التاجي سيخضع لعملية جراحية. بفات طازجة-المعزولة انزيماتيكالي نات والكسر والأوعية الدموية stromal معزولة ويتم نشرها في المختبر، مما مكننا من اختبار قدرة التمايز للخلايا البشرية السلف المستمدة من بفات للمرة الأولى.
استخدام الأولية مثقف البشرية بفات stromal الأوعية الدموية الكسر، اختبرنا ثلاث فحوصات مصممة لحمل الخلايا الجذعية/السلف للتمييز تجاه أديبوجينيك، أوستيوجينيك، أو تشوندروجينيك الأنساب. دراستنا السابقة حددت عدد سكان من CD73 + CD105 + و + PDGFRa (CD140a) الخلايا التي يمكن التفريق بين قوة في adipocytes6، على الرغم من أن لا تم اختبارها على مولتيبوتينسي. وينظم بفات مباشرة7لهجة والتهاب الأوعية الدموية. والأساس المنطقي لاختبار إمكانيات التمايز هذه الخلية رواية السكان هو البدء في فهم تأثير المتخصصة بفات في وظيفة الأوعية الدموية، والآليات لتوسيع بفات خلال السمنة. هذه المنهجية ويعزز فهمنا لوظائف خلايا الأنسجة الدهنية المشتقة السلف، وتمكننا من تحديد ومقارنة أوجه الشبه والاختلاف للخلايا السلف من مصادر مختلفة من الأنسجة. ونحن بناء على النهج المتبعة وتم التحقق من صحتها لعزل والتفريق بين لجنة السلامة البحرية نحو الأنساب المختلفة وتحسين الإجراءات إلى أقصى حد ممكن بقاء الخلايا البشرية السلف المستمدة من بفات. هذه التقنيات لها تطبيقات واسعة في ميادين الجذعية والسلف تنمية البحوث والأنسجة الدهنية للخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
استخدام الأنسجة البشرية في هذه الدراسة تم تقييمها والموافقة عليها قبل "المؤسسية استعراض المجلس لولاية ماين المركز الطبي"، وتلقى جميع موظفي التدريب المناسب قبل التجريب.
1-الأعمال التحضيرية
- جعل الانفصال من المخزن المؤقت قبل إعادة تشكيل 50 ملغ خالية من الحيوان كولاجيناز/ديسباسي مزيج أنا الحل مع 1 مل من نانوبوري ح2سين تحضير 1 ملغ/مل العامل الحل عن طريق إضافة مل 49 من ارتفاع الجلوكوز دميم يحتوي على 1% w/v جيش صرب البوسنة إلى كولاجيناز المعاد تشكيلها/ ديسباسي الحل. تخزين 5 مل العامل مختبرين في-20 درجة مئوية والحارة إلى 37 درجة مئوية، استخدام مياه قبل حمام لاستخدام.
- جعل حل المضادات الحيوية عن طريق إضافة 1 مل حل المضادات الحيوية/فطري x 100 (التركيز النهائي هو 200 وحدة/مل البنسلين، 200 وحدة/مل ستربتوميسين و 0.5 ميكروغرام/مل فونجيزوني) لمل 49 من هبس، وتخزين على الجليد.
- إعداد الحل الجيلاتين (0.2% w/v) عن طريق تذويب الجيلاتين 200 مغ من الجلد البقري في 100 مل من نانوبوري ح2O. اﻷوتوكﻻف الحل لمدة 20 دقيقة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد 500 مل وسائط النمو بفات: ارتفاع الجلوكوز DMEM/F12 مع الملحق الجلوتامين، بيروفات الصوديوم، وبيكربونات الصوديوم، وتستكمل مع 10% FBS وعامل مضادات الميكروبات 100 ميكروغرام/مل (انظر الجدول للمواد).
- إعداد 50 مل أديبوجينيك تحريض وسائل الإعلام: مل 40.8 الجلوكوز عالية دميم، وتستكمل مع وسائط النمو بفات 7.5 مل، 500 ميليلتر من 100 × حل المضادات الحيوية/فطري (التركيز النهائي هو 100 وحدة/مل البنسلين و 100 وحدة/مل ستربتوميسين فونجيزوني 0.25 ميكروغرام/مل)، 0.5 مم إيبمكس (الأسهم 500 ملم في 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم)، 1 ميكرومتر الديكساميتازون (الأوراق المالية 1 مم في الإيثانول) 5 روزيغليتازون ميكرومتر (5 مم من الأوراق المالية في [دمس])، 33 ميكرون البيوتين (الأوراق المالية 66 ملم في [دمس])، 100 نانومتر الأنسولين (200 ميكرومتر الأوراق المالية في حمض الخليك 0.1 ٪) وحمض البانتوثينيك 20 ميكرومتر (الأسهم 100 ملم في ح2 O).
- إعداد 50 مل من مراقبة الإعلام التعريفي لنسب أديبوجينيك: مل 40.8 ارتفاع الجلوكوز دميم تستكمل مع وسائط النمو 7.5 مل بفات و 500 ميليلتر من القلم-بكتيريا (100 x الأسهم).
- إعداد 50 مل أديبوجينيك صيانة وسائل الإعلام: الجلوكوز ارتفاع 41.5 مل دميم وتستكمل مع الوسائط في النمو بفات 7.5 مل من الخطوة 1، 3، 500 ميليلتر القلم-بكتيريا (100 x الأسهم)، الديكساميتازون 1 ميكرومتر (الأوراق المالية 1 مم في EtOH)، 33 ميكرون البيوتين (الأوراق المالية 66 ملم في [دمس])، 100 نانومتر الأنسولين (200 ميكرومتر الأسهم في التيار المتردد 0.1% حمض آتيك)، وحمض البانتوثنيك ميكرومتر 20 (الأسهم 100 ملم في ح2س).
- إعداد 500 مل وسائط النمو للأنساب أوستيوجينيك وتشوندروجينيك: αMEM الجلوكوز عالية وتستكمل مع 10% FBS، 1 x الجلوتامين تكملة (انظر الجدول للمواد)، و 5 مل من القلم-بكتيريا (100 x الأسهم).
- إعداد 50 مل الإعلام التعريفي لنسب أوستيوجينيك: 50 مل وسائط النمو ماجستير نخاع العظام وتستكمل مع 10 الديكساميتازون نانومتر و 10 مم β-جليسيروفوسفاتي.
- إعداد 50 مل الإعلام التعريفي لنسب تشوندروجينيك: 50 مل وسائط النمو ماجستير نخاع العظام وتستكمل مع 100 نانومتر الديكساميتازون و 50 ميكروغرام/مل اسكوربات-2-فوسفات الصوديوم 10 نانوغرام/مل TGFβ1. لظروف أوستيوجينيك وتشوندروجينيك، وسائط النمو ماجستير نخاع العظام القاعدية سيكون بمثابة وسائل الإعلام غير التعريفي.
2-البروتوكول 1: الثقافة البشرية بفات الخلايا من الكسر الأوعية الدموية Stromal
ملاحظة: هو مستأصل بفات من الموقع لملامسة الاختلاس في الشريان الاورطي تصاعدي تخديره من المرضى الذين يخضعون لإجراءات الفساد تجاوز الشريان التاجي. بفات الابهري وضعها في 15 مل مخروطية التي تحتوي على 10 مل جليد باردة ارتفاع جلوكوز F12 دميم ونقلها من غرفة العمليات إلى مختبر داخل ح 2 من الاستئصال. بفات الابهري الأنسجة المتخلص منها أثناء الإجراء تجاوز وكانت تعتبر البحوث المواضيع غير البشرية "مجلس المراجعة الداخلية" في المركز الطبي في ولاية ماين.
- هذا البروتوكول قطعة ~ 500 ملغ بفات البشرية (حوالي 3 × 1 × 0.5 سم3). نقل بفات البشرية الطازجة من دميم إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 25 مل حل المضادات الحيوية. احتضان مع هزاز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. بينما بفات في حل المضادات الحيوية، ذوبان الجليد قاسمة للانفصال من المخزن المؤقت عند 37 درجة مئوية.
- إضافة 50 ميليلتر من حل المضادات الحيوية/فطري x 100 إلى 5 مل تفارق المخزن المؤقت وتعقيمها باستخدام مرشح حقنه 0.22 ميكرومتر. أضف 1 مل من محلول الجيلاتين 1 جيدا من صفيحة 24-جيدا. في غطاء الاندفاق الصفحي، استخدام الملقط العقيمة ومقص لنقل بفات من حل المضادات الحيوية إلى طبق بتري معقم. أضف 1 مل من الانفصال قبل حرارة المخزن المؤقت للأنسجة وفرم ناعما الأنسجة كاملة إلى الطين (لا قطعة أكبر من ~ 2 × 2 مم2) استخدام الملقط العقيمة ومقص التشريح.
- نقل الطين 1 مل إلى 4 مل تفارق المخزن المؤقت واحتضان الأنبوب على جانبها في شاكر مداري حرارة قبل 37 درجة مئوية 200 لفة في الدقيقة ح 1. بعد ح 1، لا قطع الأنسجة مرئية ستكون حاضرة، والحل سوف تظهر كتعليق خلية الملبدة بالغيوم.
- تصفية الحل من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70 مجموعة فوق أنبوب مخروطي 50 مل. شطف في المصفاة مع حل المضادات الحيوية إضافية 10 مل لالتقاط خلايا أكبر عدد ممكن. لا الضغط المصفاة.
- بيليه الخلايا لمدة 12 دقيقة في 300 x ز في أجهزة الطرد مركزي دلو يتأرجح.
ملاحظة: بعد الطرد المركزي، سيتم فصل الأنبوب إلى طبقة أعلى دهنية adipocytes والطور البيني بيليه. بيليه هو كسر الأوعية الدموية stromal الذي يحتوي على خلايا بطانية والخلايا المناعية، وخلايا الدم، وخلايا السلف. - ريسوسبيند بيليه في 10 مل من حبس والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ز. كرر هذه الخطوة لما مجموعة 2 يغسل في حبس. بعد الغسيل النهائي، خلايا الدم الحمراء. محاولات متكررة مع عدد من المخازن المؤقتة المتوفرة تجارياً وأوقات الاحتضان أدت إلى تخفيضات ملحوظة في مرفق خلية السلف وقدرتها على البقاء.
- نضح الجيلاتين من لوحة 24-جيدا. تغسل بلطف x 1 جيدا مع حبس لإزالة الجيلاتين غير منضم.
- ريسوسبيند بيليه كسر الأوعية الدموية stromal مع خلايا الدم الحمراء سليمة في 1 مل من وسائط النمو والبذور على المغلفة الجيلاتين جيدا. إضافة FGF2 البشرية (حراكه في برنامج تلفزيوني وتستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.01% w/v) إلى تركيز نهائي من 25 نانوغرام/مل في الثقافة المتوسطة. احتضانها ل 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
- في اليوم التالي، إزالة وسائط النمو وغسل الآبار 5 س مع حبس لإزالة خلايا الدم الحمراء والخلايا الميتة. أضف 1 مل من وسائط النمو جديدة تستكمل مع 25 نانوغرام/مل FGF2.
- تغيير وسائل الإعلام كل 48 ساعة، مع التأكد من الملحق مع 25 نانوغرام/مل FGF2 جديدة في كل مرة.
-
الخلايا عادة التوصل إلى التقاء 100% 7-10 أيام بعد اكسبلانت؛ مرور الخلايا ثم:
- نضح نمو وسائل الإعلام والمياه والصرف الصحي أحادي الطبقة 2 x 1 مل حبس. نضح حبس كل من الآبار، وإضافة بضع قطرات من الحل الانفصال من الخلية.
- اضغط ودوامه اللوحة عدة مرات واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لمدة 5 – 7 دقيقة رفع الخلايا. إضافة ~ 1 مل من جديد الثقافة المتوسطة إلى خلايا منفصلة وتوزيع 500 ميليلتر للآبار 2 لوحة 24-جيدا وكل تحتوي على 500 ميليلتر وسائط النمو 25 ng FGF2.
- الاستمرار في توسيع نطاق الخلايا البشرية المستمدة من بفات كما هو مبين في الخطوة السابقة. ينبغي أن يكون كل مرور لا يزيد عن انقسام 1:2. الخلايا هي باساجيد 5 – 7 مرات قبل تخصيص لفحوصات التمايز.
3-بروتوكول 2: الثقافة نخاع العظام البشرية ماجستير المستعمرات
ملاحظة: تجميد نخاع العظام البشرية ماجستير معزولة كما هو موضح8 وتخزينها كبداية الممر تجميد الأرصدة وسائل الإعلام (70% FBS 20% القاعدية دميم و 10% [دمس]) في ~ 100,000 خلية/مل في السائل ن2.
- سرعة ذوبان الجليد قنينة نخاع العظام ماجستير من سائل ن2 في حمام الماء 37 درجة مئوية واللوحة إلى بئر واحدة للوحة 6-بئر الثقافة التي تحتوي على 3 مل وسائط النمو ماجستير واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- في اليوم التالي، نضح ماجستير ثقافة الإعلام وتغسل الخلايا 3 x 2 مل من حبس. في التقاء 100%، نضح وسائط النمو وتغسل الخلايا 3 x 2 مل من حبس. إضافة 500 ميليلتر/بئر الخلية المفرزة الحل واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لأدنى 5 الحنفية هي أخرجت اللوحة تأمين كافة الخلايا وتوزيع المحتويات إلى الآبار 2 من لوحة 6-البئر الذي يحتوي على وسائط النمو ماجستير 2 مل بالتساوي.
- توسيع نخاع العظام البشرية وماجستير المستمدة من بفات بالتوازي لحوالي 5 – 7 مقاطع أو حتى يتحقق كميات كافية للاختبار.
4-البروتوكول 3: لوحة والحث على أديبوجينيك، أوستيوجينيك، والأنساب تشوندروجينيك
- لوحة الأرقام المناسبة نخاع العظام والخلايا المستمدة من بفات الواحد أيضا من لوحة 12-جيدا ومناسباً وإنشاء نسخ متماثلة لكل حالة تجريبية. أديبوجينيك وشروط osteogenic ~ 200، 000 – 225,000 الخلايا/بئر مطلوبة، لظروف تشوندروجينيك، 150,000 – 175,000 هناك حاجة إلى خلايا/جيدا.
ملاحظة: نحن يتعارض مع الحد ني N = 3 آبار نسخ متماثل للتحكم والناجمة عن ظروف كل سلالته التجريبية لتشغيل ما مجموعة 2 مستقلة (N = مجموع 6 replicates). - إلغاء إقران خلايا من السكان خلية السلف بفات البشرية والسكان MSC نخاع العظام البشرية باستخدام الخلية المفرزة الحل وحضانة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 دقيقة 5 تجمع السكان في قارورة مخروطية الشكل منفصلة 15 مل. تدور القنينة إلى أسفل في 500 x ز 7 دقيقة بيليه الخلايا. ريسوسبيند في 1 مل من برنامج تلفزيوني، واستخدام هيموسيتوميتير لتقدير عدد الخلايا.
- لوحة الخلايا في أطباق 12-جيدا كما هو مبين في الخطوة 4، 1. تقديم أطباق منفصلة للمتعمد وغير المتعمد أديبوجينيك، أوستيوجينيك، وظروف حيث أن الشرط غير فعل يمكن أن تكون ثابتة في نقطة سابقة من الزمن دون الإخلال باستمرار ثقافة الشرط الإرادي.
- إضافة 1.5 مل أديبوجينيك والاستقراء أوستيوجينيك وسائل الإعلام لكل بئر من الشرط الإرادي. إضافة 1.5 مل أديبوجينيك ووسائل الإعلام غير التعريفي osteogenic لكل بئر المستحثة من غير شرط. تبدأ الحضانة أديبوجينيك والسكان osteogenic خلية المتعمد وغير المتعمد في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- تدور أسفل حجم الخلايا السلف بفات البشرية ونخاع العظام البشرية MSCs لمدة 7 دقائق في 500 x زالمتبقية.
- تحديد وحدة التخزين اللازمة ريسوسبيند نخاع العظام المتبقية والكريات الخلية المستمدة من بفات لتحقيق كثافة 100,000 الخلايا/10 ميليلتر (6 10 خلايا/مل). ريسوسبيند الكريات في حجم المحسوبة من وسائط النمو ماجستير لتحريض النسب تشوندروجينيك. تحرك بلطف حجم الخلايا صعودا وهبوطاً باستخدام بيبيت لضمان توزيع متجانس.
- "الماصة؛" معالجة تجميعية 10 ميليلتر من الحل خلية مركزة داخل المركز من كل بئر لتشكيل ميكروماس خلايا 100,000. ضع 1 مل من العقيم ح2س في البئر المجاورة لمنع التبخر. احتضان ثقافات ميكروماس ح 2 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 للسماح ميكروماس للتجميع.
- وبعد ساعتين، بعناية إضافة وسائط التمايز تشوندروجينيك ارتفعت مع 10 نانوغرام/مل TGFβ1 البشرية لكل من الآبار التي يسببها الشرط. عناية إضافة 1.5 مل من وسائط الإعلام غير تعريفية (وسائط النمو ماجستير نخاع العظام) إلى الآبار غير الناجمة عن الشرط. استخدام لوحات 12-بئر منفصلة لشروط المتعمد وغير المتعمد حيث أن الشرط غير فعل يمكن أن تكون ثابتة في نقطة سابقة من الزمن.
5-البروتوكول 4: الثقافة، أديبوجينيك، أوستيوجينيك، والأنساب تشوندروجينيك لمدة 14 يوما
- الثقافة أوضاع جميع الأنساب ثلاثة المتعمد وغير المتعمد لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية و 5% CO2، تحديث وسائل الإعلام كل يومين. في يوم 4، تغيير شرط النسب أديبوجينيك المستحث من تحريض وسائل الإعلام لصيانة وسائل الإعلام لما تبقى من المقايسة.
- إصلاح كافة الشروط غير المستحث في الفورمالين 10% على 12 حاء تخلص فورمالين ويغسل كل إصلاح الآبار x 2 في برنامج تلفزيوني لإزالة جميع آثار الفورمالين. تخزين لوحات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى التجهيز.
- الثقافة شروط المستحث لما مجموعة 14 يوما، تحديث وسائل الإعلام كل يومين. إضافة TGFβ1 جديدة في 10 نانوغرام/مل التركيز النهائي مع كل تحديث لوسائل الإعلام التعريفي تشوندروجينيك. ما زالت الثقافة نسب أديبوجينيك في أديبوجينيك صيانة وسائل الإعلام ونسب osteogenic التعريفي وسائط الإعلام، وتحديث كل يومين. في يوم 14، إصلاح ظروف الإطلاق المتعمد ح 12 في الفورمالين 10% لتلطيخ.
- كشط أو صب ميكروماس في حالة تشوندروجينيك المستحث في كاسيت للتضمين. يذوي ميكروماس في سلسلة من الحمامات الكحول تركيز متزايد لمدة 5 دقائق، بدءاً من 70%، ثم 80%، مرتين في 95 في المائة، ومرتين أكثر في الكحول المطلق. ضع الكاسيت في عامل ديلكوهوليزيشن وثم أخيرا تضمين الكاسيت في شمع البارافين لتمزيقها وتلطيخ.
6-البروتوكول 5: تلطيخ شرط أديبوجينيك مع النفط يا أحمر
- تحضير حل مخزون "النفط الأحمر يا" بإذابة 350 مغ من "زيت الأحمر يا" في 100 مل الكحول 100%. مزيج ح 2 مع شريط ضجة والفراغ من خلال فلتر 0.2 ميكرون. ويمكن تخزين حل الأسهم في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة سنة واحدة.
- إعداد "س الأحمر النفط" تعمل الحل بخلط 3 أجزاء الحل الأسهم إلى أجزاء 2 diH20 (مثلاً 60 مل من محلول الأسهم إلى 40 مل diH20). تركيز "الزيت الأحمر يا" النهائي في الحل العامل 2.1 ملغ/مل.
- قم بإزالة كافة السوائل من الآبار. تغسل كل x 2 جيدا مع الايزوبروبانول 60 في المائة، مع التأكد من إزالة جميع المياه من الجانبين من الآبار. نضح الايزوبروبانول 60% وإضافة "س الأحمر النفط" العامل الحل بسرعة دون لمس جدران الآبار لتغطية الجزء السفلي. من الأهمية بمكان أن هذه الخطوة تتم بسرعة حيث لم تجف الآبار.
- حالما تتم إضافة "س الأحمر النفط"، احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف.
- إزالة كافة "يا الحمراء النفط" وفورا إضافة المقطر ح2يغسل سين مع المقطر ح2س لمسافة 10 أمتار للبدء في إزالة غير منضم "الأحمر النفط" سين بعد 10 دقيقة، نضح "الزيت الأحمر س" وكرر الإجراء الغسيل 3 x.
- بمجرد اكتمال الغسيل، إضافة برنامج تلفزيوني والصورة الخلايا. تخزين الخلايا الملون في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
7-البروتوكول 6: تلطيخ شرط أوستيوجينيك مع أحمر الأليزارين
- قم بإزالة كافة السوائل من كل بئر. إضافة حجم 2% "الأليزارين الأحمر" وصمة عار الحل المناسب لكل بئر (1.5 مل كل بئر للوحة 12-جيدا) وآماله لوحة جنبا إلى جنب بلطف حتى الحل الذي يغطي تماما أسفل البئر.
- احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة "الأليزارين الأحمر" من الآبار. شطف بلطف كل أيضا أربع مرات مع المقطر ح2س، مع أخذ الحذر عدم إزاحة بلورات الكالسيوم. السماح لتجف.
8-البروتوكول 7: تلطيخ شرط تشوندروجينيك مع ماسون في تريتشرومي
-
خبز الشرائح في فرن جاف 60 درجة مئوية للحد الأدنى 30 مقاطع ديبارافينيزي والصودا الكاوية إلى الماء المقطر.
- لترطيب, وضع الشرائح في ثلاثة إينكوبيشنز 5 دقائق مع وكلاء ديلكوهوليزيشن، تليها إينكوبيشنز 5 دقائق تنازلي تركيزات الكحول على النحو التالي: اثنان في 100% (الإيثانول المطلقة)، واثنان في الكحول 95%، اثنان في 80%، اثنان في 70 في المائة، وأخيراً اثنان في المقطر سين الشرائح يمكن أن تبقى ح2في ح2س بينما أعد مثبت في بوين.
- مكان 40 مل من مثبت في بوين في جرة بلاستيكية كوبلين البروكولي (كشف). الميكروويف عالية لتحقيق درجة الحرارة إلى 55 درجة مئوية. ضع الشريحة في حل ساخنة لمدة 20 دقيقة؛ وللوقوف على العداد المشمولة. تغسل في إدارة مياه الحنفية لمدة 10 دقيقة أو حتى يختفي كل من اللون الأصفر.
- وصمة عار المقاطع في توضع في ويجيرت عن 10 كحد أدنى من المياه والصرف الصحي في تشغيل مياه الحنفية لمدة 10 دقائق.
- وصمة عار المقاطع في فوكسين حمض القرمزي الحل في بيبريتش للحد الأدنى 10 يغسل 3 × 10 دقيقة في مياه الحنفية. إذع الشرائح في حل حامض فوسفوتونجستيك/فوسفوموليبديك لمدة 10 دقائق. لا شطف.
- وضع الشرائح مباشرة في حل الأزرق الانيليني لأدنى 10 شطف مع اثنين من الانخفاضات قصيرة في مياه الحنفية.
- وضع الشرائح في حل حامض الخليك 1% 3 إلى 5 دقيقة يغسل بماء الصنبور للحد الأدنى 1 مكان في الإيثانول 95% للحد الأدنى 1 ديهيدراتي كما هو مبين في الخطوة 5، 4 وجبل مع راتنج الاصطناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عزلة كسر الأوعية الدموية stromal من بفات البشرية
ويبين الشكل 1A تخطيطي للمنطقة التشريحية التي حصلت فيها بفات تغمر الشريان الاورطي تصاعدي. ونحن سابقا وصف السكان المريض يمر الشريان التاجي الالتفافية التطعيم الذي كانت هذه العينات المشتقة6. يبين الشكل 1B مثال بفات البشرية التي تم الحصول عليها في أعقاب عملية جراحية. ويبين الشكل 1 مقطع أنسجة بفات ممثل الملون مع Trichrome وصمة عار ماسون 's. الشكل 1 صورة مجهرية عقد مرحلة عرض عدد خلايا اللحمية المستمدة من بفات خلال مرحلة التوسع قبل التمايز. ويمكن توسيع نطاق الخلايا والمجمدة لاستخدامها في المستقبل. عادة يتم تجميد الخلايا في كثافة 2.5 × 105 خلايا/مل في وسائل الإعلام وتتألف من 70% FBS، 20% القاعدية (خالية من المضادات الحيوية) [دمس] F12 دميم و 10% في كريوتشامبير الايزوبروبانول في-80 درجة مئوية 24 ح وتم نقله إلى الطور السائل في الثلاجة2 ن السائل لفترة طويلة-t مخزن إدارة مخاطر المؤسسات.
التفريق أديبوجينيك
وأجريت الدراسات بالتوازي مع MSC المشتقة من نخاع العظام البشرية (الشكل 2 أ، ب) وخلايا السلف المستمدة من بفات (الشكل 2، د). تظهر لوحات الأيسر من الشكل 2 المستحثة من غير الشرط، حيث يتضح لا تراكم الدهون. لوحات حق إظهار الخلايا بعد التمايز adipocyte وتلطيخ الدهون محايدة مع سين "النفط الأحمر" بينما درجة التمايز في الخلايا البشرية المستمدة من بفات الابهري أكثر قوة، عرضت كلا مصادر الخلايا البشرية القدرة على تمييز تجاه النسب أديبوجينيك.
التفريق أوستيوجينيك
تم استخدام البروتوكول التمايز osteogenic لماجستير المشتقة من نخاع العظام البشرية (الشكل 3 ألف– ج) والخلايا المستمدة من بفات (3D الشكل– و). عدم وصمة عار الخلايا التي يسببها عدم (الشكل 3 أ، د) مع "الأليزارين الأحمر". بعد البروتوكول osteogenic التمايز، ماجستير البشرية المتقدمة عقيدات متكلسة ملطخة "الأحمر الأليزارين" (الشكل 3B– ج)، بينما لم تفعل الخلايا البشرية المستمدة من بفات الابهري (3E الشكل– و). وتشير هذه البيانات إلى أن لدينا إعداد الخلايا من كسر الأوعية الدموية stromal الإنسان بفات يفتقر عدد كبير من فروعه مع القدرة على الخضوع لتكون العظم. اعتماداً على سير الدراسة والوقت التمايز، فمن المستحسن أن متابعة البقع القياسية مع الكشف عن المؤشرات الجزيئية التي تحدد التزام النسب أوستيوجينيك (مثل RUNX2، أستر، الفوسفاتيز القلوية) أو خلايا الاوستيوبلاستس (osteopontin، osteocalcin، الفوسفاتيز القلوية، BAP1).
التفريق تشوندروجينيك
الخلايا المستمدة من كلا نخاع العظام البشرية ماجستير (الشكل 4 أ) والبشرية بفات (الشكل 4) عرض ميزات مميزة للتفريق بين تشوندروجينيك، مع تراكم الكولاجين الوفيرة في ميكروماس. ميكروماسيس تتكون من نخاع العظام البشرية ماجستير والخلايا المستمدة من بفات الابهر أيضا معارضها الوفيرة تراكم الجليكوزامينوجليكان (أزرق) كما هو مبين تلطيخ السيان الأزرق (الشكل 4-د، على التوالي). شكلياً، تم الكشف عن هياكل مشابهة إلى الثغرات مع خلايا يجلس في تجاويف المحيطة بترسيب الكولاجين (الشكل 4، الأسهم). اعتماداً على مسار الدراسة والوقت للتمايز، الكشف عن علامات محددة تشوندروجينيك (أجريكان، الكولاجين من النوع الثاني، أوستيونيكتين، Sox9) مفيد.
رقم 1: الخصائص المورفولوجية للبشرية بفات. (أ) الرسوم المتحركة تصوير الابهر البشرية (أحمر) مع المحيطة بفات (أصفر). يشير السهم إلى الشريان الاورطي تصاعدي. (ب) قطعة 480 ملغ بفات الابهري البشرية من تحويل مريض في دميم قبل الانفصال. (ج) ماسون تلطيخ trichrome من الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين بفات البشرية (بني داكن/أسود = نوى، أزرق/أرجواني = النسيج الضام، الوردي = السيتوبلازم؛ تظهر ملاحظة، ربك الوردي المحمر. (د) صورة تمثيلية اكسبلانتيد الخلايا اللحمية بفات في 7 أيام في الثقافة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التمايز أديبوجينيك. المرحلة (A) يبين الفحص المجهري لنخاع العظام البشرية ماجستير في حالة عدم فعل أي دليل على التفريق. (ب) مرحلة الفحص المجهري لنخاع العظام البشرية ماجستير في حالة أديبوجينيك المستحث ويبين بعض التمايز وتجميد الدهون محايدة، ملطخة "الزيت الأحمر يا" بعد 14 يوما. (ج) المرحلة يبين الفحص المجهري للخلايا المستمدة من بفات الابهري البشرية في حالة أديبوجينيك غير الناجمة عن أي دليل على التفريق. (د) مرحلة الفحص المجهري الخلايا المستمدة من بفات الابهري البشرية في حالة أديبوجينيك المستحث يظهر التمايز قوية وتجميد الدهون محايدة، ملطخة "الزيت الأحمر يا" بعد 14 يوما. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التفريق أوستيوجينيك. المرحلة (A) يبين الفحص المجهري لنخاع العظام البشرية ماجستير في حالة أوستيوجينيك غير الناجمة عن أي دليل على التفرقة تجاه نسب أوستيوجينيك. (ب) مرحلة الفحص المجهري لنخاع العظام البشرية ماجستير في الشرط الإرادي بعد 14 يوما في الثقافة يظهر دليل على التفريق، وتشكيل رواسب الكالسيوم ملطخة "الأحمر الأليزارين" (الأسهم). (ج) صورة من التقرير كذلك تتضمن نخاع العظام البشرية ماجستير في الشرط osteogenic المستحثة بعد تلطيخ مع "الأليزارين الأحمر" يشير إلى ترسب الكالسيوم وفيرة، مما يوحي بالتمايز الناجحة نحو نسب أوستيوجينيك (الأسهم، ترسيب الكالسيوم). (د) مرحلة مجهرية الخلايا المستمدة من بفات البشرية الابهري في الشرط osteogenic المستحثة بغير معارض أي إشارة إلى التمايز تجاه نسب أوستيوجينيك. (ه) مرحلة الفحص المجهري الخلايا المستمدة من بفات البشرية الابهري في الشرط osteogenic المستحثة بعد 14 يوما في الثقافة يظهر أي دليل على وجود تمييز تجاه النسب أوستيوجينيك أو ترسب الكالسيوم عند ملطخة "الأحمر الأليزارين"، إلا تلوين غير محددة. (و) صورة كذلك التي تحتوي على الخلايا المستمدة من بفات الابهري البشرية في حالة osteogenic المستحث تلطيخ التالية مع "الأليزارين الأحمر" يظهر فقط غير محددة تلطيخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: التمايز تشوندروجينيك. (أ وب) الخفيفة مجهرية لمقطع من ميكروماس شكلتها نخاع العظام البشرية ماجستير (A) أو بفات الابهري البشرية خلايا السلف (ب) في حالة تشوندروجينيك العمدي بعد 14 يوما في الثقافة وفي وقت لاحق ملطخة ب Trichrome ماسون، الذي يشير إلى كبير ترسيب الكولاجين (أزرق) ويشير إلى التمايز الناجحة نحو نسب تشوندروجينيك. (ج، د) مجهرية الخفيفة لقسم من ميكروماس شكلتها نخاع العظام البشرية ماجستير (ج) أو بفات الابهري البشرية السلف الخلايا (د) في حالة تشوندروجينيك المستحث بعد 14 يوما في الثقافة وبعد ذلك الملون مع السيان الأزرق، الذي يشير إلى ترسب الحمضية بروتيوجليكانس (مثل الجليكوزامينوجليكان) كما توجد عادة في الغضروف. كونتيرستين، الأحمر سريع النووية؛ أسهم، الهياكل الشبيهة بالثغرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخلايا الدهنية السلف من مستودعات مختلفة اختلافاً كبيرا في النمط الظاهري والتمايز المحتمل9. استزراع المتكفل بفات المستمدة من مانح واحد مريض في تحريض متزامنة أسفل ثلاثة مختلفة الأنساب، أديبوجينيك، أوستيوجينيك، وتشوندروجينيك، يسمح بإجراء تحقيق القدرة pluripotent هذه الرواية التي تسيطر عليها جيدا سكان خلايا السلف. يمكن استخدام المنهجية الموصوفة في هذا التقرير لاختبار قدرة تمييز الخلايا السلف من بفات البشرية وفهم وظيفتها في تنظيم الأمراض بفات ولهجة الأوعية الدموية. بعض فوائد هذا الأسلوب هي بساطته واستعمال الأنسجة البشرية الأولية من الشريان التاجي الالتفافية المرضى، مما مكن التحقيق في بفات الدالة cell السلف من المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية الشديدة. ومع ذلك، explants من قطعة 500 ملغ من الأنسجة عادة ما تسفر عن < 1000 تمسكا الخلايا وبالتالي تتطلب الفقرات 5-7 للحصول على العدد الكافي، تسليط الضوء على أحد المحاذير الهامة لهذا النهج. حاسمة بالنسبة لنجاح تجارب التفرقة تراي-النسب نوعية explant الخلية الأولى من المانحين بفات. من الضروري فرم ناعما الأنسجة دقة قبل الانفصال الانزيمية. بالإضافة إلى ذلك، على عكس الأخرى بروتوكولات explant، وجدنا خسارة هائلة في عدد الخلايا، والسلامة والجودة الشاملة عندما كان يستخدم المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء قبل الطلاء. بدلاً من ذلك، فإنه ينصح بشدة للوحة الكسر الأوعية الدموية stromal كاملة (بما في ذلك خلايا الدم الحمراء). بعد 24 ساعة، وسوف تعلق الخلايا ملتصقة وغير تفكيك خلايا الدم الحمراء يمكن إزالتها عن طريق يغسل المتكررة مع حبس. باساجينج الخلايا اللحمية المستمدة من بفات ينبغي أن لا تزيد عن 1:2 الانقسامات. لاحظنا انخفاضا في معدل النمو عند الخلايا تم تقسيم 1:3 أو أكبر.
العنصر الأكثر صعوبة للمقايسة المفاضلة تريلينيجي هو شرط تشوندروجينيك، كما أنه يتطلب أسلوباً أقل شيوعاً من تثقيف الخلايا في "ميكروماس" وغذائها التضمين وتمزيقها. ويجب الحرص على لوحة الحبرية 10 ميليلتر من 100,000 الخلايا بشكل سليم وعدم الإزعاج الشامل على إضافة الثقافة المتوسطة. ووجدنا التباين بين فحوصات بشأن أم لا ميكروماس ظل التقيد بها على اللوحة أو تعليقه في الأجلين المتوسط و. حتى عندما الكتلة لم يبقى الالتزام بها، صلاحية الهيكل وخلية ميكروماس ظل ثابتاً.
الخلايا الجذعية أو السلف داخل المكروية الأوعية الدموية المسؤولة عن إصلاح الأنسجة استجابة للإصابة أو المرض. تتسم معظم هم السكان التي تستمد من المقصورات بيريسيتي/أدفينتيتيال، على الرغم من أن مازال هناك جدل حول ما إذا كان هناك تعريف جزيئية موحدة لهؤلاء السكان في البشر10،11 . في هذا البروتوكول، نقوم بدراسة عدد سكان خلية السلف على وجه التحديد المستمدة من بفات البشرية لاختبار ميلها التفريق بنسب أوستيوجينيك أو تشوندروجينيك أو أديبوجينيك. باستخدام تقنيات المصبوغة لتعريف الالتزام الخلوية لكل النسب، علينا أن نبرهن أن الخلايا السلف من بفات البشرية خلافا لماجستير من نخاع العظام البشرية، لم تكن قادرة على التفريق بين نحو نسب أوستيوجينيك (الشكل 3) ولكن المعرض قوية التفريق بين أديبوجينيك. قدرة التمايز تشوندروجينيك قابل للمقارنة بين نخاع العظام والخلايا المستمدة من بفات. وهذا يوحي أن الخلايا المستمدة من بفات السلف قد تكون النسب أكثر تقييداً من نخاع العظام ماجستير أو أن المتكفل بفات لا تفرق سهولة في الأنساب أوستيوجينيك. ينبغي أن تشمل الدراسات المستقبلية تحقيقا لتعبير الجينات والبروتين من علامات لكل النسب لتقييم قدرة تمييز الخلايا المستمدة من بفات أكثر كمياً.
وكانت الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية تركيز لتطبيقات الطب التجديدي، نظراً لسهولة الوصول والعدد الكبير من الخلايا التي يمكن استخلاصها من الأنسجة الدهنية12،13. داخل الأوعية الدموية stromal جزء صغير من الأنسجة الدهنية، وهناك خلايا الأوعية الدموية والخلايا التحريضية، والليفية، برياديبوسيتيس، والخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية. هناك اختلافات في الخلايا الجذعية السكان استناداً إلى موقع تشريحي الدهنية مستودع و adipocyte الخصائص14. الأهم من ذلك، تظهر الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية تملك القدرة ليس فقط على التفريق في الأنساب الوسيطة15، ولكن أيضا يمكن أن تعتمد العصبية16،17 ومصائر البشرة18 .
وركزت العديد من الدراسات على الخلايا الجذعية/السلف المستمدة من الأنسجة الدهنية البيضاء تحت الجلد البشري، ولكن دراسات قليلة جداً وقد تناول خصائص السكان السلف في بفات. الدراسات التي أجريت مؤخرا قد عزل adipocyte الخلايا السلف من سفن المساريقي العلوي المحيطة بفات أو الشريان الاورطي الصدري من الفئران. هذه CD34 + CD140a + السكان متباينة في adipocytes، على الرغم من أن القدرة على اشتقاق الأنساب الأخرى لم يكن اختبرت19.
ونحن مؤخرا تتميز الخلايا الدهنية السلف المستمدة من كسر الأوعية الدموية stromal بفات البشرية من المرضى الذين يعانون من مرض الشريان التاجي المتقدمة6. هذه الخلايا الدهنية السلف CD73 + CD105 + و CD140a +، وكفاءة متباينة في adipocytes مع خصائص حرارة (التعبير UCP1)6. في العمل الحالي، وجدنا فاعلية نسب محدودة من الخلايا المشتقة من بفات MSC المشتقة من نخاع العظام، بالمقارنة مع مما يوحي بانعدام أو الحد الأدنى من السكان من الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية التي اتسمت من الأنسجة الدهنية البشرية الأخرى. نظر لهذا البروتوكول هو التغير المتوقع بين العينات البشرية، مما قد يؤثر على عدد الخلايا الجذعية/السلف ضمن العينة بفات وقدرتها على الخضوع للتمايز للأنساب متميزة. السن والجنس، ومؤشر كتلة الجسم، والأدوية والمعلمات السريرية الأخرى المحتمل تؤثر على النمط الظاهري لخلايا السلف داخل بفات. وبالتالي، انتظار التعديلات المستقبلية المتوقعة من هذا البروتوكول عدد سكان أكثر السلف محددة بوضوح داخل بفات البشرية، وربما باستخدام الخلية الفرز لعزل السكان الفرعية المحددة للدراسات النسب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نعترف بالمساعدة من "التنقل للبحث" في المركز الطبي في ولاية ماين للمساعدة في شراء الأنسجة السريرية، والأنسجة وكور هيستومورفوميتري (بدعم من 1P20GM121301، L. لياو PI) في "ولاية ماين الطبي مركز البحوث" معهد تمزيقها وتلطيخ. هذا العمل كان يدعمها في المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HL141149 (L. لياو).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| Antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| Biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| Bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4 °C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| Bell strainer (70 mm) | Corning | 352350 | |
| Dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| Formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| Gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| Insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| Pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| Penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| Rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
References
- Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
- Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. Differentiation of adipose stem cells. Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
- Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
- de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
- Majesky, M. W. Adventitia and perivascular cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).
- Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
- Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
- Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
