Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Дифференциация способности человека аорты периваскулярной жировой клетки-предшественники

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59337
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Maine Medical Center Research Institute

Summary

Цель настоящего Протокола заключается в проверить способность прародитель клетки, полученные из жировой ткани человека периваскулярной дифференцироваться в несколько линий клеток. Дифференциация была по сравнению с мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга человека, который известен дифференцироваться в Адипоцит, остеоциты и хондроцитов линий.

Abstract

Жировой ткани является богатым источником нескольких мощных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) способны дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном родов. Адипогенном дифференцировки клеток-предшественников является механизмом основных вождения расширения жировой ткани и дисфункции в ответ на ожирение. Таким образом, понимание изменения периваскулярной жировой ткани (PVAT) является клинически значимых метаболических заболеваний. Однако, предыдущие исследования были преимущественно в мыши и других животных моделей. Этот протокол использует человеческой грудной PVAT пробах из пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование трансплантата. Жировой ткани от восходящей части аорты был собирается и используется для эксплантация стромальные сосудистой дроби. Мы ранее подтвердил наличие жировых прогениторных клеток в человека PVAT мощностью дифференцироваться в содержащих липидов адипоцитов. В этом исследовании мы дополнительно проанализировать потенциал дифференцировки клеток стромы сосудистой фракции, предположительно содержащих несколькими мощными прогениторных клеток. Мы сравнили PVAT-производные клеток костного мозга человека MSC для дифференциации в адипогенном, остеогенные и хондрогенном родов. После 14 дней дифференциации, конкретные пятна были использованы для выявления накопление липидов в адипоцитов (масло красный O), calcific месторождения в Остеогенные клетки (ализарин красный), или гликозаминогликанов и коллагена в клетках хондрогенном (Массон в Trichrome). Хотя костного MSC эффективно продифференцировано во всех трех линий, PVAT-производные клетки были адипогенном и хондрогенном потенциал, но не хватает надежных Остеогенные потенциал.

Introduction

Жировой ткани является богатым источником нескольких мощных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) способны дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном линий1. Эта ткань расширяет через гипертрофия адипоцитов зрелой и de novo дифференциация резидентов КБМ адипоцитов. Периваскулярной жировой ткани (PVAT) окружает кровеносных сосудов и регулирует функции сосудистого2,3. Ожирение индуцированной PVAT расширения усугубляет сердечно-сосудистой патологии. Хотя Multipotent с потенциал MSC от человека подкожных жировых депо были хорошо изучены4,5, исследования не описаны и оценены возможности дифференцировки клеток-предшественников человека PVAT-производные, вероятно, из-за инвазивность закупок. Таким образом цель этой работы заключается в обеспечивают методологию для explant и распространять клетки-предшественники из человека PVAT аорты у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями и проверки их склонность различать на остеогенные, хондрогенном и адипогенном линий. Наш источник PVAT — сайт анастомоза шунтирования на восходящей аорты ожирением пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование трансплантата. Свеже изолированные PVAT ферментативно отделить и стромы сосудистой фракции изолированных и распространяются в пробирке, позволяя нам в первый раз проверить возможности дифференциации клеток-предшественников человека PVAT-производные.

С помощью первичных искусственного человека PVAT стромальные сосудистой дроби, мы проверили три анализов, призванных побудить стволовых/прогениторных клеток дифференцировать сторону адипогенном, остеогенные, или хондрогенном линий. Наши предыдущие исследования определили населения CD73 +, CD105 + и PDGFRa + (CD140a) клеток, которые могут надежно дифференцировать в адипоцитов6, хотя их multipotency не был протестирован. PVAT непосредственно регулирует сосудистый тонус и воспаление7. Обоснование для тестирования потенциал дифференциации населения этот роман клеток является чтобы начать понимать специализированные влияние PVAT на сосудистой функции и механизмы расширения PVAT при ожирении. Эта методология расширяет наше понимание функций производным прародителя жировой клетки и позволяет нам определить и сравнить сходства и различия клетки-предшественники из источников различных тканей. Мы строим на установленные и проверенные подходы для изоляции и дифференциации MSC направлении различных линий и оптимизировать процедуры для обеспечения максимальной жизнеспособности клеток-предшественников человека PVAT-производные. Эти методы имеют широкое применение в области стволовых и прогениторных клеток жировой ткани и исследования развития.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использование человеческих тканей в этом исследовании был оценены и одобрены организационного обзора Совет от Мэн медицинский центр, и все сотрудники получили соответствующую подготовку до экспериментов.

1. Подготовка

  1. Сделать диссоциации буфера путем воссоздания 50 мг животных бесплатно коллагеназы/dispase смесь я решение с 1 мл раствора рабочего 1 мг/мл nanopure H2O. подготовка, добавив 49 мл высокой глюкозы DMEM, содержащие 1% w/v BSA восстановленный коллагеназы / dispase решение. Хранить 5 мл аликвоты рабочих при-20 ° C и тепло до 37 ° C, с использованием предварительного Ванна воды для использования.
  2. Сделать, добавив 1 мл раствора 100 x антибиотик/противогрибковое (конечная концентрация-200 единиц/мл пенициллин, 200 единиц/мл стрептомицина и 0,5 мкг/мл fungizone) 49 мл HBSS Антибиотик раствор и хранить на льду.
  3. Готовят раствор желатина (0,2% w/v) путем растворения желатина 200 мг из кожи крупного рогатого скота в 100 мл nanopure H2O. автоклава решение для 20 мин и хранить при 4 ° C.
  4. Подготовка 500 мл PVAT роста СМИ: высокие глюкоза DMEM/F12 с глютамин добавки, пируват натрия, бикарбонат натрия, дополненная 10% FBS и антимикробное средство 100 мкг/мл (см. Таблицу материалы).
  5. Подготовка 50 мл адипогенном индукции СМИ: 40,8 мл высокий глюкозы DMEM, дополнена 7,5 мл PVAT роста СМИ, 500 мкл, 100 x антибиотик/противогрибковое решения (конечная концентрация 100 единиц/мл пенициллин, 100 единиц/мл стрептомицина и fungizone 0,25 мкг/мл), 0,5 мм IBMX (500 мм сток в 0,1 М NaOH), дексаметазона 1 мкм (1 мм сток в этиловом спирте), 5 мкм Росиглитазон (5 мм сток в ДМСО), 33 мкм биотин (66 мм сток в ДМСО), 100 Нм инсулина (200 µM сток в 0,1% уксусной кислоты) и 20 мкм пантотеновой кислоты (100 мм складе H2 O).
  6. Подготовка 50 мл управления индукции СМИ для линии адипогенном: 40,8 мл высокий глюкозы DMEM, дополненная 7,5 мл PVAT роста СМИ и 500 мкл перо стрептококк (100 x акций).
  7. Подготовка 50 мл адипогенном обслуживание СМИ: 41,5 мл высокий глюкозы DMEM дополнена 7,5 мл PVAT роста средств массовой информации из шага 1.3, 500 мкл перо стрептококк (100 x бульон), дексаметазона 1 мкм (1 мм складе EtOH), 33 мкм биотин (66 мм сток в ДМСО), 100 Нм инсулина (200 µM складе переменного тока 0,1% этический кислота) и 20 мкм пантотеновой кислоты (100 мм складе H2O).
  8. Подготовка 500 мл питательных сред для Остеогенные и хондрогенном линий: высокие глюкоза αMEM дополнена 10% FBS, 1 x глютамина дополнение (см. Таблицу материалы) и 5 мл перо стрептококк (100 x акций).
  9. Подготовка 50 мл индукции СМИ для линии Остеогенные: 50 мл костного MSC питательных сред с 10 Нм дексаметазона и 10 мм β-метронидазол.
  10. Подготовка 50 мл индукции СМИ для линии хондрогенном: 50 мл костного MSC питательных сред с 100 Нм дексаметазон, 50 мкг/мл натрия аскорбат-2-фосфат и 10 нг/мл TGFβ1. Остеогенные и хондрогенном условий базальный костного MSC роста СМИ будет служить средства массовой информации не индукции.

2. Протокол 1: Культура человека PVAT клетки стромы сосудистой дроби

Примечание: PVAT резецируется от сайта трансплантата анастомоза на восходящей части аорты наркотизированных пациентов, перенесших процедур трансплантата обхода коронарной артерии. Аорты PVAT размещается в 15 мл конические содержащий 10 мл лед холодной высокой глюкозы DMEM F12 и передается от операционной комнате в лабораторию в течение 2 ч резекции. Аорты PVAT отбрасываются ткани во время обхода процедуры и был признан как не человеческого субъектов исследования Мэн медицинский центр внутреннего обзора Советом.

  1. Этот протокол предназначен для ~ 500 мг кусок человеческого PVAT (примерно 3 x 1 x 0.5 см3). Передать свежие человека PVAT от DMEM конические Тюбик 50 мл, содержащие Антибиотик раствор 25 мл. Инкубировать с качалки для 20 мин при 4 ° C. В то время как PVAT является антибиотиком решения, оттепель Алиготе диссоциации буфера при 37 ° C.
  2. 50 мкл антибиотик/противогрибковое раствора 100 x 5 мл диссоциации буфер и стерилизовать, используя фильтр шприц 0,22 мкм. Добавьте 1 мл раствора желатина 1 о 24-ну пластины хорошо. В Ламинарный шкаф используйте стерильные щипцами и ножницы передать стерильных Петри PVAT от антибиотиков решения. Добавьте 1 mL подогретым диссоциации буфера на ткани и мелко фарш всей ткани в суспензии (куски размером более ~ 2 x 2 мм2) с помощью стерильных щипцы и Рассечение ножницами.
  3. Передать буфер диссоциации 4 мл 1 мл суспензии и инкубировать трубку на его стороне в орбитальный шейкер подогретым 37 ° C при 200 об/мин на 1 ч. Через 1 ч без видимых ткани штук будет присутствовать, и решение будет отображаться как подвеска облачно ячейки.
  4. Фильтр решение через 70 мкм клеток стрейнер набор на вершине 50 мл Конические трубки. Промойте ситечко с еще 10 мл антибиотик решение захватить как много клеток как можно скорее. Не выжимать ситечко.
  5. Пелле клетки для 12 мин на 300 x g в центрифугу размахивая ведро.
    Примечание: После центрифугирования трубы будут разделены на жирные верхний слой адипоциты, межфазные и Пелле. Гранулы является стромальные сосудистой дроби, содержащие эндотелиальные клетки, клетки иммунной системы, клетки крови и клетки-предшественники.
  6. Ресуспензируйте гранулы в 10 мл HBSS и центрифуги для 5 мин на 300 x g. Повторите этот шаг для в общей сложности 2 стирок в HBSS. После окончательной стирки не лизируют красных кровяных клеток. Неоднократные попытки с несколькими коммерчески доступные буферы и инкубации раз привели к заметному сокращению прогениторных клеток привязанность и жизнеспособности.
  7. Аспирационная желатин от 24-ну пластины. Осторожно промойте хорошо 1 x с HBSS удалить несвязанные желатина.
  8. Ресуспензируйте стромальные сосудистой фракция гранул с нетронутыми красных кровяных клеток в 1 мл средства роста и семян на желатин покрытием хорошо. Добавьте человека FGF2 (высокомобильна в PBS с BSA 0,01% w/v) до конечной концентрации 25 нг/мл в культурной среде. Проинкубируйте 24 ч при 37 ° C с 5% CO2.
  9. На следующий день удалить роста средств массовой информации и мыть скважин 5 x с HBSS для удаления красных кровяных клеток и мертвые клетки. Добавьте в 1 мл свежих питательных сред с 25 нг/мл FGF2.
  10. Изменить СМИ каждые 48 ч, убедившись в том дополнить с 25 нг/мл свежего FGF2 каждый раз.
  11. Клетки обычно достигают 100% слияния 7-10 дней после экспланта; проход клетки затем:
    1. Аспирационная роста средств массовой информации и мыть монослоя 2 x в 1 мл HBSS. Аспирационная все HBSS из скважин и добавить несколько капель раствора диссоциации клеток.
    2. Коснитесь и вихрем пластину несколько раз и инкубировать при 37 ° C с 5% CO2 для 5-7 мин снять клетки. Добавить ~ 1 мл свежей питательной среды на отдельные ячейки и распространять 500 мкл до 2 скважин 24-ну плиты, каждый содержащий 500 мкл концентрированного роста средств массовой информации и 25 нг FGF2.
  12. Продолжать расширять человеческие клетки PVAT-производные, как указано на предыдущем шаге. Каждый проход должен быть не больше, чем 1:2 Сплит. Клетки пассированные 5 – 7 раз до выделения для дифференциации анализов.

3. Протокол 2: Культура костного мозга человека MSC колонии

Примечание: Костного мозга человека MSC изолированы как описано8 и хранятся как замороженные запасы начале проход заморозить СМИ (70% FBS 20% базального DMEM и 10% ДМСО) на ~ 100000 клеток/мл жидкого N2.

  1. Быстро разморозить флакон костного MSC от жидкости N2 в ванну воды 37 ° C и пластины для одной скважиной 6-ну культуры пластины, содержащий 3 мл MSC питательных сред и инкубировать на ночь при 37 ° C и 5% CO2.
  2. На следующий день, аспирационная MSC культуры средств массовой информации и вымыть клетки 3 x в 2 мл HBSS. При впадении в 100%, аспирационная питательных сред и вымыть клетки 3 x в 2 мл HBSS. Добавьте 500 мкл/хорошо клеток отряд решение и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 на 5 мин крана, выбили пластину для обеспечения всех клеток и равномерно распределять содержимое 2 скважин 6-ну пластины, содержащий 2 мл MSC роста средств массовой информации.
  3. Разверните костного мозга человека и PVAT-производные MSC параллельно для приблизительно 5 – 7 места или до тех пор, пока был достигнут достаточных количествах для тестирования.

4. Протокол 3: Пластины и побудить адипогенном, остеогенные и хондрогенном линий

  1. Соответствующие госномера костного мозга и PVAT-производные ячеек на 12-ну плиты и соответствующие реплицирует для каждого экспериментальные условия. Для адипогенном и остеогенном условий, ~ 200, 000 – 225 000 клеток/также необходимы, для хондрогенном условий, 150 000 – 175 000 клеток/также необходимы.
    Примечание: Мы побежали как минимум N = 3 реплицировать скважины для управления и индуцированных условия для каждой экспериментальной линии для в общей сложности 2 независимых работает (N = 6 реплицирует всего).
  2. Отделить клеток от PVAT прогениторных клеток населения и населения MSC костного мозга человека, используя мобильный отряд решение и инкубации при 37 ° C и 5% CO2 для 5 минут бассейн населения в отдельных 15 мл конические флаконов. Спиновые флакон вниз на 500 x g 7 мин для пеллет клетки. Ресуспензируйте в 1 мл PBS и использовать Горяева для оценки количества клеток.
  3. Пластина клетки в 12-ну блюда, как указано в шаге 4.1. Обеспечить отдельные блюда индуцированных и -индуцированной адипогенном, остеогенные, и условия и состояние-индуцированной может устанавливаться на более ранней точке времени без ущерба для продолжения культуры индуцированных состояния.
  4. Добавьте 1,5 мл адипогенном и остеогенном индукции СМИ в каждой скважине индуцированных состояния. Добавьте 1,5 мл адипогенном и остеогенном СМИ не индукции в каждой скважине-индуцированной состояния. Начните инкубации адипогенном и остеогенном индуцированных и -индуцированных клеточных популяций при 37 ° C и 5% CO2.
  5. Уменьшается объем оставшихся прогениторных клеток человека PVAT и костного мозга человека MSCs для 7 мин на 500 x g.
  6. Определите объем необходимых для Ресуспензируйте оставшихся костного мозга и PVAT-производные ячейки гранулы для достижения плотности 100000 клеток/10 мкл (106 клеток/мл). Ресуспензируйте окатышей в рассчитанном объеме MSC питательных сред для хондрогенном линии индукции. Аккуратно переместите объем клеток вверх и вниз с помощью пипетки, чтобы обеспечить равномерное распределение.
  7. Пипетка капельку 10 мкл концентрированного ячейки решения в центр каждой скважины, сформировать micromass 100000 клеток. Место 1 мл стерильного H2O в прилегающих хорошо для предотвращения испарения. Инкубировать micromass культур на 2 ч при 37 ° C и 5% CO2 разрешить micromass для статистической обработки.
  8. После 2 часов, осторожно добавить хондрогенном дифференциация СМИ шипами с 10 нг/мл человека TGFβ1 к каждому из индуцированных состояния скважин. Тщательно добавьте 1,5 мл не индукции СМИ (костного MSC роста СМИ)-индуцированной состояния скважин. Использование отдельных 12-ну плит для индуцированных и -индуцированной условий так что-индуцированной условие может устанавливаться на более ранний момент времени.

5. Протокол 4: Культура адипогенном, остеогенные и хондрогенном линий на 14 дней

  1. Культура индуцированных и -индуцированной условий всех трех линий для 4 дней при 37 ° C и 5% CO2, освежающий СМИ каждые 2 дня. День 4 Измените условие линии индуцированных адипогенном от индукции СМИ для обслуживания средств массовой информации на оставшуюся часть assay.
  2. Вымойте все фиксированные скважин 2 x в PBS, чтобы удалить все следы формалина и исправить все условия-индуцированной формалина 10% за 12 ч Dispose формалина. Хранить пластины в PBS на 4 ° C до обработки.
  3. Культура индуцированных условия для всего 14 дней, освежающий СМИ каждые 2 дня. Добавьте свежие TGFβ1 на 10 нг/мл конечной концентрации с каждым обновлением СМИ индукции хондрогенном. Продолжать культура адипогенном линии в адипогенном обслуживания массовой информации и остеогенном линии индукции, обновление каждые 2 дня. На 14 день исправьте все индуцированных условия для 12 h в формалина 10% для окрашивания.
  4. Царапина, или налить micromass в состоянии индуцированных хондрогенном в кассету для встраивания. Обезвоживанию micromass в серии все более концентрированный алкоголя ванны для 5 мин, начиная с 70%, то 80%, дважды в 95% и вдвое больше в абсолютном спирте. Установите кассету в dealcoholization агент и наконец внедрить кассету в парафин для разрезания и пятнать.

6. Протокол 5: Пятнать адипогенном условие с маслом красный O

  1. Подготовьте раствор нефти красный O, растворяя 350 мг в 100 мл 100% изопропиловый спирт Красного о нефти. Смешать 2 h с баром перемешать и вакуума через фильтр 0.2 мкм. Стоковый раствор может храниться в темноте при комнатной температуре на 1 год.
  2. Подготовка нефти красный O рабочего раствора, смешивая 3 частей Стоковый раствор 2 части diH20 (например, 60 мл Стоковый раствор 40 мл diH20). Окончательный концентрация O Красного масла в рабочем растворе составляет 2,1 мг/мл.
  3. Удалите все жидкости из скважины. Мыть каждый хорошо 2 x с 60% изопропиловый спирт, убедившись в том, чтобы полностью удалить всю воду из сторон скважин. Аспирационная 60% изопропиловый спирт и быстро добавить масло красный O рабочий раствор не касаясь стенок скважин для покрытия нижней. Важно, что этот шаг делается быстро, поэтому не сушите скважин.
  4. После добавления масла O красный, Проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре с плавное покачивание.
  5. Удалите все O Красного масла и сразу же добавить дистиллированной H2O. мыть с дистиллированной H2O для 10 m начать удаление несвязанных нефти красный O. После 10 минут, аспирационная O Красного масла и повторите процедуру Стиральная 3 x.
  6. После завершения стирки добавьте PBS и изображения клетки. Хранить окрашенных клеток в PBS на 4 ° C.

7. Протокол 6: Пятнать Остеогенные состояние с ализарин красный

  1. Удалите все жидкости из каждой скважины. Добавьте соответствующий объем 2% раствора ализарин красный краситель для каждой скважины (1,5 мл на хорошо для 12-ну плиты) и нежно наклона пластины стороны в сторону, до тех пор, пока решение полностью покрывает в нижней части скважины.
  2. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре. Удаление ализарин красный из скважин. Осторожно промойте дистиллированной H2O, принимая осторожностью, чтобы не вытеснить кристаллов кальция каждый хорошо четыре раза. Дайте высохнуть.

8. Протокол 7: Окрашивание хондрогенном состояния с Массон в Trichrome

  1. Выпекать слайды в сухой печи 60 ° C на 30 мин Deparaffinize и гидрат разделы в дистиллированной воде.
    1. Увлажняет, место слайды в трех инкубаций 5 мин с dealcoholization агентами, следуют инкубаций 5 мин в порядке убывания концентрации алкоголя следующим образом: два на 100% (абсолютного этанола), два в 95% спирте, две на 80%, два на 70% и, наконец, два в дистиллированной H2O. слайды могут оставаться в H2O фиксатор Буэна готовится.
  2. Место 40 мл фиксатор Буэна в пластиковых микроволновой печи coplin банку (непокрытый). Микроволновая печь на высоких довести темп до 55 ° C. Место слайда в подогревом раствора для 20 мин; пусть стоять на прилавке охвачены. Промыть струей воды за 10 мин, или до тех пор, пока все желтого цвета исчезает.
  3. Пятно разделы по Вейгерту гематоксилином 10 мин мыть в струей воды за 10 мин.
  4. Пятно секций в Beibrich в Скарлет кислоты фуксин решение для 10 минут Вымойте 3 x 10 мин в водопроводной воде. Морилка слайды в кислотного раствора фосфорвольфрамовой/phosphomolybdic за 10 мин. Не ополаскивайте.
  5. Место слайды непосредственно в анилиновый голубой решение для 10 минут промыть с двумя краткий провалы в водопроводной воде.
  6. Место слайды в растворе уксусной кислоты 1% для 3-5 мин мыть в проточной воде в течение 1 мин место в 95% этаноле за 1 мин Dehydrate, как указано в шаге 5.4 и горе с синтетической смолой.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Изоляция стромальные сосудистой дроби от человека PVAT

На рисунке 1A показана схема анатомического региона, где был получен PVAT, обволакивающие восходящей части аорты. Ранее мы описали популяциях пациентов, проходящих аортокоронарное шунтирование, из которого эти образцы были производных6. Рисунок 1B пример человеческого PVAT, полученные после операции. Рисунок 1 c показывает репрезентативной секции PVAT ткани окрашивали Массон в Trichrome пятно. Рисунок 1 d является этап контракта Микрофотография показаны население PVAT-производные стромальных клеток на этапе расширения до дифференциации. Клетки могут быть расширены и замороженные для использования в будущем. Клетки обычно замораживаются на плотности 2,5 x 105 клеток/мл в средствах массовой информации, состоит из 70% FBS, 20% базального (антибиотик бесплатно) DMEM F12 и 10% ДМСО в криокамере изопропиловый спирт на-80 ° C для 24 h и переехал в жидкой фазе жидкого N2 морозильник для Лонг t ERM хранения.

Адипогенном дифференциация

Исследования проводились параллельно с человека костный мозг производные MSC (рисунок 2AB) и PVAT-производные прогениторных клеток (рис. 2 cD). Левой панели Рисунок 2 показывают-индуцированной состояние, где нет накопление липидов является очевидным. Правой панели показывают ячейки после Адипоцит дифференциации и окрашивание нейтральные липиды с красного масла O. В то время как степень дифференцировки клеток аорты PVAT-производные человека является более надежной, как источники человеческих клеток выставлены способности различать к линии адипогенном.

Остеогенные дифференциация

Остеогенные дифференциация протокол был использован для человека костный мозг производные MSC (рис. 3A– C) и PVAT-производные клеток (рис. 3D– F). Non индуцированной клеток (рис. 3AD) сделал не пятно с ализарин красный. После Остеогенные дифференциация протокол, человека MSC разработал Кальцифицированный конкреций, которые окрашивали ализарин красный (рисунок 3B– C), в то время как клетки человека аорты PVAT-производные не (Рисунок 3E– F). Эти данные показывают, что наша подготовка клеток стромы сосудистой часть человека PVAT не хватает значительное количество прародителями с возможностью пройти Остеогенез. В зависимости от исследования и времени курс дифференциации рекомендуется следить за стандартные пятна с обнаружением молекулярных маркеров, которые определяют обязательства Остеогенные линии (например, RUNX2, osterix, щелочной фосфатазы) или остеобластов (Остеопоэтин, остеокальцин, щелочной фосфатазы, BAP1).

Хондрогенном дифференциация

Клетки, полученные от обоих костного мозга человека MSC (рис. 4A) и человеческого PVAT (рис. 4B) отображают характерные особенности хондрогенном дифференциации, с накоплением обильные коллагена в micromass. Micromasses формируется из костного мозга человека MSC и аорты PVAT-производные клетки также выставлены обильные накопление гликозаминогликанов (синий), как указано по окрашиванию Альциановый синий (Рисунок 4 c– D, соответственно). Морфологически структуры, аналогичные недостатки были обнаружены с клетками, сидит в полости окружающих осаждением коллагена (Рисунок 4, стрелки). В зависимости от исследования и времени курс дифференциации, выявления конкретных хондрогенном маркеров (Аггрекан, коллаген типа II, osteonectin, Sox9) является полезным.

Figure 1
Рисунок 1: морфологические характеристики человеческого PVAT. (A) мультфильм изображением человеческого аорты (красный) с окружающими PVAT (желтый). Стрелка указывает на восходящей части аорты. (B) A 480 мг кусок человека аорты PVAT от пациента АКШ в среде DMEM до диссоциации. (C) Массон trichrome окрашивание формалин Исправлена парафин врезанных человеческого PVAT (темно-коричневый/черный = ядер, голубой/пурпурный = соединительной ткани, розовый = цитоплазме; Обратите внимание, что РБК появляются красновато розовый. (D) представитель изображений описаны PVAT-стромальных клеток в 7 дней в культуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: дифференциация адипогенном. (A) фаза микроскопии костного мозга человека MSC в состоянии-индуцированной показывает никаких признаков дифференциации. (B) этап микроскопии костного мозга человека MSC в состоянии индуцированных адипогенном показывает некоторые дифференциации и иммобилизация нейтральные липиды, витражи с O Красного масла после 14 дней. (C) фаза показывает микроскопии аорты PVAT-производные клеток человека в состоянии-индуцированной адипогенном никаких доказательств дифференциации. (D) фаза микроскопии аорты PVAT-производные клеток человека в состоянии индуцированных адипогенном показывает надежные дифференциации и иммобилизация нейтральные липиды, витражи с O Красного масла после 14 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Остеогенные дифференциации. (A) фаза микроскопии костного мозга человека MSC-индуцированной Остеогенные состояния показывает никаких доказательств дифференциации сторону Остеогенные линии. (B) фаза показывает микроскопии костного мозга человека MSC в искусственных условиях после 14 дней в культуре свидетельствует о дифференциации и формирование отложений кальция, окрашенных с ализарин красный (стрелки). (C) изображения хорошо, содержащие костного мозга человека MSC в индуцированной Остеогенные состояние после окрашивания с ализарин красный указывает обильные кальция осаждений, предлагая успешной дифференциации сторону Остеогенные линии (стрелки, отложение кальция). (D) фаза микроскопии аорты PVAT-производные клеток человека в состояние Остеогенные-индуцированной экспонатов никаких признаков дифференциации сторону Остеогенные линии. (E) фаза микроскопии аорты клеток человека PVAT-производные индуцированных Остеогенные состояния после 14 дней в культуре показывает никаких свидетельств дифференциации сторону Остеогенные линии или осаждений кальция при окрашенных с ализарин красный, только неспецифичный пятнать. (F) изображения хорошо, содержащие аорты PVAT-производные клетки человека в индуцированной Остеогенные состоянии у следующих окрашивание с ализарин красный показывает только неспецифические пятнать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Дифференциация хондрогенном. (A, B) Световой микроскопии секции micromass основали костного мозга человека MSC (A) или человека аорты PVAT клетки-предшественники (B) в состоянии индуцированных хондрогенном после 14 дней в культуре и впоследствии витражи с Массон в Trichrome, который указывает на значительный отложение коллагена (синий) и предлагает успешной дифференциации к линии хондрогенном. (C, D) Световой микроскопии секции micromass формируется костного мозга человека MSC (C) или человека аорты PVAT клетки-предшественники (D) в состоянии индуцированных хондрогенном после 14 дней в культуре и впоследствии витражи с Альциановый синий, который указывает кислотные осаждения Протеогликаны (например, гликозаминогликанов) как обычно находятся в хряще. Изображение, ядерная быстро красный; стрелки, пробелы подобных структур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Жировой прогениторных клеток с разных складов различаются в фенотип и дифференциации потенциальных9. Выращивание PVAT-производные прародителей от одного пациента донора в одновременной индукционной вниз три различных линий, адипогенном, остеогенные и хондрогенном, позволяет хорошо контролируемых расследования плюрипотентных потенциала этого романа численность населения прогениторных клеток. Методике, описанной в настоящем докладе может использоваться для тестирования возможностей дифференциации прогениторных клеток из человека PVAT и понять их функции в регулировании PVAT патологии и сосудистый тонус. Некоторые преимущества этого метода являются его простота и использования первичных человеческих тканей от коронарной артерии обход больных, таким образом позволяя расследование PVAT прародитель клеточной функции у пациентов с тяжелыми сердечно-сосудистыми заболеваниями. Однако, как правило дают эксплантов от 500 мг кусок ткани < 1000 приверженца клетки и таким образом требуют проходов 5 – 7 для получения достаточного числа, выделив одно важное предостережение этот подход. Решающее значение для успеха экспериментов дифференциация tri линии является качество первоначальных клеток экспланта от доноров PVAT. Важно мелко фарш тканей тщательно перед ферментативные диссоциации. Кроме того в отличие от других протоколов экспланта, мы нашли драматические потери количества клеток, жизнеспособности и общее качество когда красных кровяных клеток литического буфера была использована до покрытия. Вместо этого настоятельно рекомендуется пластины весь стромальные сосудистой дроби (включая красных кровяных клеток). После 24 часов будет придают адэрентных клеток и -лизированы красные кровяные клетки могут быть удалены путем неоднократных стирок с HBSS. Пассированый PVAT-производные стромальных клеток должно быть не больше, чем 1:2 расколов. Мы наблюдали снижение темпов роста, когда клетки были Сплит 1:3 или больше.

Наиболее сложных компонент пробирного дифференциация trilineage является хондрогенном состояние, как это требует менее общий метод культивирования клеток в «micromass» и гистологическим внедрение и секционирование. Необходимо позаботиться должным образом пластина 10 мкл капелька 100000 клеток и не беспокоить массы на добавление питательной среды. Мы нашли различия между анализов относительно ли micromass оставался приклеенная к пластине или приостановлено в среде. Даже когда массы не придерживался, micromass структура и клеток жизнеспособности оставалась неизменной.

Стволовых и прогениторных клеток в пределах сосудистого микроокружения отвечают за восстановление тканей в ответ на травмы или болезни. Наиболее хорошо характеризуется являются населения, которые являются производными от перицит/adventitial отсеков, хотя есть еще споры о том, следует ли существует стандартизированных молекулярной идентификации этих групп населения в людей10,11 . В этом протоколе мы изучаем популяции клеток прародителю, специально производным от человека PVAT для тестирования их склонность различать остеогенные, хондрогенном или адипогенном линии. Используя методы окраски для определения сотовой приверженность каждой линии, мы демонстрируем, что в отличие от MSC из костного мозга человека, клетки-предшественники из человека PVAT смогли не дифференцировать к Остеогенные линии (рис. 3) но exhibit надежные адипогенном дифференциации. Способность дифференциации хондрогенном сопоставима между костного мозга и PVAT-производные клетки. Это свидетельствует о том, что PVAT-производные прогениторных клеток может быть более линии ограничена чем костного MSC или что родоначальниками PVAT не легко дифференцировать в остеогенном линий. Будущие исследования должны включать расследование экспрессии генов и белков маркеров для каждой линии более количественно оценить возможности дифференциации клеток PVAT-производные.

Стволовые клетки жировой производные были фокус для регенеративной медицины приложений, за счет легкого доступа и большое количество клеток, которые могут быть получены от жировой ткани12,13. В стромальные сосудистой долю жировой ткани есть сосудистая клетки, воспалительных клеток, фибробластов, preadipocytes и жировой производные стволовых клеток. Существуют различия в основе анатомического расположения жировых депо и Адипоцит характеристики14популяции стволовых клеток. Самое главное стволовых клеток жировой производные, как представляется, не только способны дифференцироваться в мезенхимальных линий15, но и потенциал принять нейрональных16,17 и эпидермальный18 судьбы.

Многочисленные исследования были сосредоточены на стволовых/прародитель клетки, полученные от человека подкожной белой жировой ткани, но очень мало исследований были рассмотрены характеристики прародитель населения в PVAT. Недавние исследования выделили Адипоцит прогениторных клеток от PVAT окружающих брыжеечных сосудов или грудной аорты крысы. Эти CD34 +/ CD140a + населения, дифференцированные в адипоциты, хотя возможности для получения других линий не протестированы19.

Мы недавно охарактеризовал прародитель жировой клетки, полученные из стромы сосудистой часть человеческого PVAT больных с передовых ишемической болезни6. Эти клетки жировой прародитель были CD73 +, CD105 + и CD140a + и эффективно дифференцированной в адипоцитов с термогенный характеристики (UCP1 выражение)6. В текущей работе мы нашли потенции ограниченной линии клеток PVAT-производные, по сравнению с костного мозга, полученных МСЦ, предполагая отсутствие или минимальный населения жировой производные стволовых клеток, которые характеризовались от других жировых тканях человека. Рассмотрение этого протокола является ожидаемый изменчивость между человеческих особей, которые могут повлиять на количество стволовых/прогениторных клеток в PVAT образца и их способность пройти дифференциации различных линий. Возраст, пол, BMI, лекарства и другие клинические параметры могут повлиять на фенотипа клетки-предшественники в PVAT. Таким образом ожидаемых будущих изменений настоящего Протокола ждут более четко определенных прародитель населения в пределах человеческого PVAT и возможно, для изоляции определенных подгрупп населения линии исследований с использованием сортировки клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы признаем помощи исследования навигации в Мэн медицинский центр для оказания помощи с закупками клинических ткани, гистопатология и Histomorphometry Core (при поддержке 1P20GM121301, л Liaw PI) в Мэн медицинский центр исследований Институт для разрезания и пятнать. Эта работа была поддержана NIH Грант R01 HL141149 (L. Liaw).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I   Millipore-Sigma SCR139 50mg
Alcian Blue NewComerSupply 1003A 1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red Amresco 9436-25G
alpha-MEM ThermoFisher 12561056
Aniline Blue NewComerSupply 10073C
Antibiotic/antimycotic ThermoFisher 15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin Millipore-Sigma A3908-25G
b-glycerophosphate Millipore-Sigma G9422-10G
Biebrich Scarlet EKI 2248-25G
Biotin Millipore-Sigma B4501-100MG
Bouin's fixative NewComerSupply 1020A
Bovine serum albumin Calbiochem 12659 stored at 4 °C
Cell detachment solution Accutase AT104
Bell strainer (70 mm) Corning 352350
Dexamethasone Millipore-Sigma D4902-100MG
DMEM Corning 10-013-CV 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium ThermoFisher 10565-042 high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO Millipore-Sigma D2650
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals  S11550
FGF2 Peprotech 100-18B
Formalin NewComerSupply 1090
Gelatin, bovine skin Millipore-Sigma G9391-500G
Glutamax ThermoFisher 35050061 glutamine supplement
HBSS Lonza 10-547F
IBMX Millipore-Sigma I5879-250MG
Insulin solution Millipore-Sigma I9278-5ML
Oil red O Millipore-Sigma O0625-100G
Pantothenic acid Millipore-Sigma P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution ThermoFisher 15240062 100ml
Permount Fisher SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution Millipore-Sigma P4006-100G/221856-100G
Primocin Invivogen ant-pm-1 Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone Millipore-Sigma R2408-10MG
TGFb1 Peprotech 100-21
Weigert's hematoxylin EKI 4880-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
  2. Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
  3. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  4. Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. Differentiation of adipose stem cells. Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).
  5. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  6. Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
  7. Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
  10. de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
  11. Majesky, M. W. Adventitia and perivascular cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).
  12. Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
  13. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  14. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
  15. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  16. Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
  17. Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
  18. Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
  19. Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).

Tags

Биология выпуск 145 человека периваскулярной жировой ткани прародитель жировых клеток мезенхимальных стволовых клеток chondrogenesis остеогенез adipogenesis дифференцировки клеток сердечно-сосудистых заболеваний
Дифференциация способности человека аорты периваскулярной жировой клетки-предшественники
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scott, S. S., Yang, X., Robich, M.,… More

Scott, S. S., Yang, X., Robich, M., Liaw, L., Boucher, J. M. Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (145), e59337, doi:10.3791/59337 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter