Summary

Дифференциация способности человека аорты периваскулярной жировой клетки-предшественники

Published: March 05, 2019
doi:

Summary

Цель настоящего Протокола заключается в проверить способность прародитель клетки, полученные из жировой ткани человека периваскулярной дифференцироваться в несколько линий клеток. Дифференциация была по сравнению с мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга человека, который известен дифференцироваться в Адипоцит, остеоциты и хондроцитов линий.

Abstract

Жировой ткани является богатым источником нескольких мощных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) способны дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном родов. Адипогенном дифференцировки клеток-предшественников является механизмом основных вождения расширения жировой ткани и дисфункции в ответ на ожирение. Таким образом, понимание изменения периваскулярной жировой ткани (PVAT) является клинически значимых метаболических заболеваний. Однако, предыдущие исследования были преимущественно в мыши и других животных моделей. Этот протокол использует человеческой грудной PVAT пробах из пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование трансплантата. Жировой ткани от восходящей части аорты был собирается и используется для эксплантация стромальные сосудистой дроби. Мы ранее подтвердил наличие жировых прогениторных клеток в человека PVAT мощностью дифференцироваться в содержащих липидов адипоцитов. В этом исследовании мы дополнительно проанализировать потенциал дифференцировки клеток стромы сосудистой фракции, предположительно содержащих несколькими мощными прогениторных клеток. Мы сравнили PVAT-производные клеток костного мозга человека MSC для дифференциации в адипогенном, остеогенные и хондрогенном родов. После 14 дней дифференциации, конкретные пятна были использованы для выявления накопление липидов в адипоцитов (масло красный O), calcific месторождения в Остеогенные клетки (ализарин красный), или гликозаминогликанов и коллагена в клетках хондрогенном (Массон в Trichrome). Хотя костного MSC эффективно продифференцировано во всех трех линий, PVAT-производные клетки были адипогенном и хондрогенном потенциал, но не хватает надежных Остеогенные потенциал.

Introduction

Жировой ткани является богатым источником нескольких мощных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) способны дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном линий1. Эта ткань расширяет через гипертрофия адипоцитов зрелой и de novo дифференциация резидентов КБМ адипоцитов. Периваскулярной жировой ткани (PVAT) окружает кровеносных сосудов и регулирует функции сосудистого2,3. Ожирение индуцированной PVAT расширения усугубляет сердечно-сосудистой патологии. Хотя Multipotent с потенциал MSC от человека подкожных жировых депо были хорошо изучены4,5, исследования не описаны и оценены возможности дифференцировки клеток-предшественников человека PVAT-производные, вероятно, из-за инвазивность закупок. Таким образом цель этой работы заключается в обеспечивают методологию для explant и распространять клетки-предшественники из человека PVAT аорты у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями и проверки их склонность различать на остеогенные, хондрогенном и адипогенном линий. Наш источник PVAT — сайт анастомоза шунтирования на восходящей аорты ожирением пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование трансплантата. Свеже изолированные PVAT ферментативно отделить и стромы сосудистой фракции изолированных и распространяются в пробирке, позволяя нам в первый раз проверить возможности дифференциации клеток-предшественников человека PVAT-производные.

С помощью первичных искусственного человека PVAT стромальные сосудистой дроби, мы проверили три анализов, призванных побудить стволовых/прогениторных клеток дифференцировать сторону адипогенном, остеогенные, или хондрогенном линий. Наши предыдущие исследования определили населения CD73 +, CD105 + и PDGFRa + (CD140a) клеток, которые могут надежно дифференцировать в адипоцитов6, хотя их multipotency не был протестирован. PVAT непосредственно регулирует сосудистый тонус и воспаление7. Обоснование для тестирования потенциал дифференциации населения этот роман клеток является чтобы начать понимать специализированные влияние PVAT на сосудистой функции и механизмы расширения PVAT при ожирении. Эта методология расширяет наше понимание функций производным прародителя жировой клетки и позволяет нам определить и сравнить сходства и различия клетки-предшественники из источников различных тканей. Мы строим на установленные и проверенные подходы для изоляции и дифференциации MSC направлении различных линий и оптимизировать процедуры для обеспечения максимальной жизнеспособности клеток-предшественников человека PVAT-производные. Эти методы имеют широкое применение в области стволовых и прогениторных клеток жировой ткани и исследования развития.

Protocol

Использование человеческих тканей в этом исследовании был оценены и одобрены организационного обзора Совет от Мэн медицинский центр, и все сотрудники получили соответствующую подготовку до экспериментов. 1. Подготовка Сделать диссоциации буфера путем воссоздани?…

Representative Results

Изоляция стромальные сосудистой дроби от человека PVAT На рисунке 1A показана схема анатомического региона, где был получен PVAT, обволакивающие восходящей части аорты. Ранее мы описали популяциях пациентов, прохо…

Discussion

Жировой прогениторных клеток с разных складов различаются в фенотип и дифференциации потенциальных9. Выращивание PVAT-производные прародителей от одного пациента донора в одновременной индукционной вниз три различных линий, адипогенном, остеогенные и хондрогенном, позвол…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признаем помощи исследования навигации в Мэн медицинский центр для оказания помощи с закупками клинических ткани, гистопатология и Histomorphometry Core (при поддержке 1P20GM121301, л Liaw PI) в Мэн медицинский центр исследований Институт для разрезания и пятнать. Эта работа была поддержана NIH Грант R01 HL141149 (L. Liaw).

Materials

animal-free collagenase/dispase blend I   Millipore-Sigma SCR139 50mg
Alcian Blue NewComerSupply 1003A 1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red Amresco 9436-25G
alpha-MEM ThermoFisher 12561056
Aniline Blue NewComerSupply 10073C
antibiotic/antimycotic ThermoFisher 15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin Millipore-Sigma A3908-25G
b-glycerophosphate Millipore-Sigma G9422-10G
Biebrich Scarlet EKI 2248-25G
biotin Millipore-Sigma B4501-100MG
Bouin's fixative NewComerSupply 1020A
bovine serum albumin Calbiochem 12659 stored at 4C
Cell detachment solution Accutase AT104
cell strainer (70mm) Corning 352350
dexamethasone Millipore-Sigma D4902-100MG
DMEM Corning 10-013-CV 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium ThermoFisher 10565-042 high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO Millipore-Sigma D2650
fetal bovine serum Atlanta Biologicals  S11550
FGF2 Peprotech 100-18B
formalin NewComerSupply 1090
gelatin, bovine skin Millipore-Sigma G9391-500G
glutamax ThermoFisher 35050061 glutamine supplement
HBSS Lonza 10-547F
IBMX Millipore-Sigma I5879-250MG
insulin solution Millipore-Sigma I9278-5ML
Oil red O Millipore-Sigma O0625-100G
pantothenic acid Millipore-Sigma P5155-100G
penicillin-streptomycin solution ThermoFisher 15240062 100ml
permount Fisher SP15-500
phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution Millipore-Sigma P4006-100G/221856-100G
primocin Invivogen ant-pm-1 Antimicrobial reagent for culture media.
rosiglitazone Millipore-Sigma R2408-10MG
TGFb1 Peprotech 100-21
Weigert's hematoxylin EKI 4880-100G

References

  1. Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
  2. Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
  3. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  4. Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. Differentiation of adipose stem cells. Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).
  5. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  6. Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
  7. Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
  10. de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
  11. Majesky, M. W. Adventitia and perivascular cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).
  12. Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
  13. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  14. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
  15. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  16. Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
  17. Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
  18. Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
  19. Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).

Play Video

Cite This Article
Scott, S. S., Yang, X., Robich, M., Liaw, L., Boucher, J. M. Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (145), e59337, doi:10.3791/59337 (2019).

View Video