Цель настоящего Протокола заключается в проверить способность прародитель клетки, полученные из жировой ткани человека периваскулярной дифференцироваться в несколько линий клеток. Дифференциация была по сравнению с мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга человека, который известен дифференцироваться в Адипоцит, остеоциты и хондроцитов линий.
Жировой ткани является богатым источником нескольких мощных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) способны дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном родов. Адипогенном дифференцировки клеток-предшественников является механизмом основных вождения расширения жировой ткани и дисфункции в ответ на ожирение. Таким образом, понимание изменения периваскулярной жировой ткани (PVAT) является клинически значимых метаболических заболеваний. Однако, предыдущие исследования были преимущественно в мыши и других животных моделей. Этот протокол использует человеческой грудной PVAT пробах из пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование трансплантата. Жировой ткани от восходящей части аорты был собирается и используется для эксплантация стромальные сосудистой дроби. Мы ранее подтвердил наличие жировых прогениторных клеток в человека PVAT мощностью дифференцироваться в содержащих липидов адипоцитов. В этом исследовании мы дополнительно проанализировать потенциал дифференцировки клеток стромы сосудистой фракции, предположительно содержащих несколькими мощными прогениторных клеток. Мы сравнили PVAT-производные клеток костного мозга человека MSC для дифференциации в адипогенном, остеогенные и хондрогенном родов. После 14 дней дифференциации, конкретные пятна были использованы для выявления накопление липидов в адипоцитов (масло красный O), calcific месторождения в Остеогенные клетки (ализарин красный), или гликозаминогликанов и коллагена в клетках хондрогенном (Массон в Trichrome). Хотя костного MSC эффективно продифференцировано во всех трех линий, PVAT-производные клетки были адипогенном и хондрогенном потенциал, но не хватает надежных Остеогенные потенциал.
Жировой ткани является богатым источником нескольких мощных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) способны дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном линий1. Эта ткань расширяет через гипертрофия адипоцитов зрелой и de novo дифференциация резидентов КБМ адипоцитов. Периваскулярной жировой ткани (PVAT) окружает кровеносных сосудов и регулирует функции сосудистого2,3. Ожирение индуцированной PVAT расширения усугубляет сердечно-сосудистой патологии. Хотя Multipotent с потенциал MSC от человека подкожных жировых депо были хорошо изучены4,5, исследования не описаны и оценены возможности дифференцировки клеток-предшественников человека PVAT-производные, вероятно, из-за инвазивность закупок. Таким образом цель этой работы заключается в обеспечивают методологию для explant и распространять клетки-предшественники из человека PVAT аорты у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями и проверки их склонность различать на остеогенные, хондрогенном и адипогенном линий. Наш источник PVAT — сайт анастомоза шунтирования на восходящей аорты ожирением пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование трансплантата. Свеже изолированные PVAT ферментативно отделить и стромы сосудистой фракции изолированных и распространяются в пробирке, позволяя нам в первый раз проверить возможности дифференциации клеток-предшественников человека PVAT-производные.
С помощью первичных искусственного человека PVAT стромальные сосудистой дроби, мы проверили три анализов, призванных побудить стволовых/прогениторных клеток дифференцировать сторону адипогенном, остеогенные, или хондрогенном линий. Наши предыдущие исследования определили населения CD73 +, CD105 + и PDGFRa + (CD140a) клеток, которые могут надежно дифференцировать в адипоцитов6, хотя их multipotency не был протестирован. PVAT непосредственно регулирует сосудистый тонус и воспаление7. Обоснование для тестирования потенциал дифференциации населения этот роман клеток является чтобы начать понимать специализированные влияние PVAT на сосудистой функции и механизмы расширения PVAT при ожирении. Эта методология расширяет наше понимание функций производным прародителя жировой клетки и позволяет нам определить и сравнить сходства и различия клетки-предшественники из источников различных тканей. Мы строим на установленные и проверенные подходы для изоляции и дифференциации MSC направлении различных линий и оптимизировать процедуры для обеспечения максимальной жизнеспособности клеток-предшественников человека PVAT-производные. Эти методы имеют широкое применение в области стволовых и прогениторных клеток жировой ткани и исследования развития.
Жировой прогениторных клеток с разных складов различаются в фенотип и дифференциации потенциальных9. Выращивание PVAT-производные прародителей от одного пациента донора в одновременной индукционной вниз три различных линий, адипогенном, остеогенные и хондрогенном, позвол…
The authors have nothing to disclose.
Мы признаем помощи исследования навигации в Мэн медицинский центр для оказания помощи с закупками клинических ткани, гистопатология и Histomorphometry Core (при поддержке 1P20GM121301, л Liaw PI) в Мэн медицинский центр исследований Институт для разрезания и пятнать. Эта работа была поддержана NIH Грант R01 HL141149 (L. Liaw).
animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
formalin | NewComerSupply | 1090 | |
gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
HBSS | Lonza | 10-547F | |
IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
permount | Fisher | SP15-500 | |
phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |