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Biology

Capacidade de diferenciação de células progenitoras de aorta humana Perivascular adiposo

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59337
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Maine Medical Center Research Institute

Summary

O objetivo do presente protocolo é testar a capacidade de células progenitoras derivadas de tecido adiposo de perivascular humana de se diferenciar em várias linhagens de célula. Diferenciação foi comparada com as células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea humana, que é conhecida por se diferenciar em adipócitos, osteócito e linhagens de condrócitos.

Abstract

Tecido adiposo é uma fonte rica de multi potentes tronco células mesenquimais (MSC) capazes de diferenciar em osteogênica, adipogenic e linhagens de chondrogenic. Adipogenic diferenciação de células progenitoras é um mecanismo importante conduzir a expansão do tecido adiposo e disfunção em resposta à obesidade. Mudanças de entendimento para o tecido adiposo de perivascular (PVAT) é, portanto, clinicamente relevantes na doença metabólica. No entanto, estudos anteriores têm sido predominantemente realizada em mouse e outro animal modelos. Este protocolo usa humana torácica PVAT amostras coletadas de pacientes submetidos à cirurgia de enxerto de bypass de artéria coronária. Tecido adiposo da aorta ascendente foi recolhido e utilizado para explantação da fração vascular do estroma. Anteriormente confirmamos a presença de células adiposas reprodutoras em PVAT humana com a capacidade de se diferenciarem em lipídios contendo adipócitos. Neste estudo, mais analisamos o potencial de diferenciação das células da fracção do estroma vascular, presumivelmente, contendo células progenitoras multi potente. Nós comparamos PVAT-derivado de células de medula óssea humana MSC para diferenciação em adipogenic, osteogênica e linhagens de chondrogenic. Após 14 dias de diferenciação, manchas específicas foram utilizadas para detectar o acúmulo de lipídios nos adipócitos (O óleo vermelho), calcificar depósitos em células osteogênicas (vermelho de alizarina), ou glicosaminoglicanos e colagénio nas células chondrogenic (Trichrome de Masson). Enquanto a medula óssea MSC eficientemente diferenciada em todas as três linhagens, PVAT-derivado de células tinham adipogenic e chondrogenic potencial, mas faltava-lhe potencial osteogênico robusto.

Introduction

Tecido adiposo é uma fonte rica de multi potentes tronco células mesenquimais (MSC) capazes de diferenciar em osteogênica, adipogenic e linhagens de chondrogenic1. Este tecido se expande através da hipertrofia dos adipócitos maduros e de diferenciação de novo de MSC residente de adipócitos. Tecido adiposo de perivascular (PVAT) envolve os vasos sanguíneos e regula a função vascular2,3. Expansão de PVAT induzida pela obesidade exacerba patologias cardiovasculares. Enquanto o potencial multipotent de MSC de depósitos de tecido adiposos subcutâneos humanos têm sido bem estudadas4,5, nenhum estudo tem explantados e avaliada a capacidade de diferenciação das células progenitoras humano PVAT-derivado, provavelmente devido a a invasividade dos contratos. Assim, o objetivo deste trabalho é fornecer uma metodologia de explantes e propagar as células progenitoras de PVAT aórtica humana de pacientes com doença cardiovascular e testar a sua propensão para diferenciar a osteogênica, chondrogenic e adipogenic linhagens. Nossa fonte de PVAT é do local da anastomose do enxerto desvio na crescente aorta de pacientes obesos submetidos à cirurgia de enxerto de bypass de artéria coronária. PVAT recentemente isolado é enzimaticamente dissociada e a fração do estroma vascular é isolada e propagada in vitro, permitindo-nos testar, pela primeira vez, a capacidade de diferenciação de células progenitoras derivadas PVAT humana.

Usando principal culto humano PVAT do estroma vascular fração, testamos três ensaios projetados para induzir células tronco/progenitoras para diferenciar em direção adipogenic, osteogênica, ou linhagens chondrogenic. Nosso estudo prévio identificou uma população de CD73 + CD105 + e células PDGFRa + (CD140a) que podem verdadeiramente diferenciar em adipócitos6, apesar de sua multipotency não foi testado. PVAT regula diretamente de Tom e inflamação vascular7. A justificativa para testar o potencial de diferenciação dessa população celular novela é para começar a entender a influência especializada de PVAT na função vascular e mecanismos de expansão PVAT durante a obesidade. Esta metodologia melhora o nosso entendimento das funções das células progenitoras derivadas de tecido adiposo e nos permite identificar e comparar as semelhanças e diferenças de células progenitoras de fontes diferentes de tecido. Nós construímos abordagens estabelecidos e validados para isolar e diferenciando MSC no sentido de diferentes linhagens e otimizar procedimentos para maximizar a viabilidade de células progenitoras derivadas PVAT humana. Estas técnicas têm aplicações amplas nos campos da haste e progenitoras célula pesquisa e tecido adiposo desenvolvimento.

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Protocol

O uso de tecidos humanos neste estudo foi avaliado e aprovado pelo institucional Review Board de Maine centro médico, e todos os funcionários receberam treinamento adequado antes da experimentação.

1. preparações

  1. Fazer reserva de dissociação por reconstituir 50mg colagenase/dispase animal-free misturar eu solução com 1 mL de solução de trabalho de 1 mg/mL preparar nanopure H2O. adicionando 49 mL de glicose alta DMEM contendo 1% w/v BSA para o reconstituído colagenase / solução de Dispase. Loja alíquotas de trabalho 5ml a-20 ° C e quente a 37 ° C, usando um antes do banho de água para usar.
  2. Faça a solução antibiótica, adicionando 1 mL de solução de antibiótico/antimicótico 100 x (concentração final é 200 penicilina unidades/mL, de 200 unidades/mL Estreptomicina e de 0,5 µ g/mL fungizone) a 49 mL de HBSS e armazene no gelo.
  3. Preparar a solução de gelatina (0,2% p/v), dissolvendo a gelatina de 200 mg de pele bovina em 100 mL de nanopure H2Autoclave O. a solução para 20 min e armazenar a 4 ° C.
  4. Preparar 500 mL de meio de crescimento PVAT: glicose alta DMEM/F12 com suplemento de glutamina, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio, suplementado com 10% FBS e agente antimicrobiano de 100 µ g/mL (ver Tabela de materiais).
  5. Preparar a mídia de indução de adipogenic 50ml: glicose alta de 40,8 mL DMEM, suplementado com mídia de crescimento 7,5 mL PVAT, 500 µ l de 100 x antibiótico/antimicótico solução (concentração final é 100 penicilina unidades/mL, 100 unidades/mL Estreptomicina e fungizone 0,25 µ g/mL), 0.5 mM IBMX (estoque de 500 mM em 0.1 M NaOH), 1 dexametasona µM (estoque de 1 mM em etanol), 5 µM rosiglitazone (estoque de 5 mM em DMSO), 33 biotina µM (estoque de 66 mM em DMSO), 100 nM insulina (200 ações µM em 0,1% de ácido acético) e o ácido pantotênico 20 µM (estoque de 100 mM H2 Ó).
  6. Preparar 50 mL de mídia de indução de controlo para a linhagem de adipogenic: glicose alta de 40,8 mL DMEM suplementado com mídia de crescimento PVAT 7,5 mL e 500 µ l de caneta-estreptococos (estoque de x 100).
  7. Preparar a mídia de manutenção adipogenic 50ml: glicose alta de 41,5 mL DMEM suplementado com 7,5 mL PVAT crescimento mídia da etapa 1.3, 500 µ l pen-estreptococos (estoque de x 100), dexametasona 1 µM (estoque de 1 mM em EtOH), 33 biotina µM (estoque de 66 mM em DMSO), 100 insulina nM (200 µM ações 0,1% ac ácido ETIC) e ácido pantotênico de 20 µM (estoque de 100 mM em H2O).
  8. Preparar 500 mL de mídia de crescimento para as linhagens osteogênicas e chondrogenic: suplemento de FBS, 1 glutamina x glicose alta αMEM suplementado com 10% (ver Tabela de materiais) e 5 mL de caneta-estreptococos (estoque de x 100).
  9. Preparar 50 mL de mídia de indução para a linhagem osteogênica: 50 mL de medula óssea mídia crescimento MSC suplementada com 10 nM dexametasona e β-glicerofosfato de 10 mM.
  10. Preparar 50 mL de mídia de indução para a linhagem de chondrogenic: 50 mL de medula óssea mídia crescimento MSC suplementada com 100 dexametasona nM e 50 µ g/mL fosfato de sódio ascorbato-2-10 ng/mL TGFβ1. Para as condições osteogênicas e chondrogenic, a mídia de crescimento basal da medula óssea MSC irá servir como a mídia não-indução.

2. Protocolo 1: Cultura humana PVAT células da fracção do estroma Vascular

Nota: PVAT é ressecado do local da anastomose do enxerto na aorta ascendente de pacientes anestesiados submetidos a procedimentos de enxerto de bypass de artéria coronária. PVAT aórtica é colocado em um 15ml cónico contendo 10 mL gelo frio alta glicose DMEM F12 e transferido da sala de cirurgia para laboratório até 2 horas após ressecção. PVAT aórtica é tecido Descartado durante procedimento de bypass e tem sido considerado como pesquisa de sujeitos não-humanos pelo Conselho de revisão interna do Maine Medical Center.

  1. Este protocolo é para um pedaço de ~ 500 mg de PVAT humana (aproximadamente 3 x 1 x 0,5 cm3). Transferi PVAT humano fresco de DMEM para um tubo cônico de 50 mL contendo 25 mL de solução antibiótica. Incube com balanço por 20 min a 4 ° C. Enquanto o PVAT em solução antibiótica, descongelar uma alíquota do buffer de dissociação a 37 ° C.
  2. Adicionar 50 µ l de solução de antibiótico/antimicótico 100 x 5 mL de tampão de dissociação e esterilizar usando um filtro de seringa 0,22 µm. Adicione 1 mL de solução de gelatina para 1 bem de uma placa de 24. Um capuz de fluxo laminar, utilize Pinças esterilizadas e tesoura para transmitir PVAT da solução antibiótica para uma placa de Petri estéril. Adicionar 1 mL de tampão de dissociação previamente aquecido no tecido e picar finamente o tecido inteiro em uma pasta (sem pedaços maiores que ~ 2 x 2 mm2) usando Pinças esterilizadas e tesoura de dissecação.
  3. Transferir o chorume de 1 mL a 4 mL de tampão de dissociação e incubar o tubo em seu lado em um agitador orbital de pre-aquecido a 37 ° C a 200 rpm por 1h. Depois de 1h, sem pedaços de tecido visível estará presentes, e a solução aparecerá como uma suspensão de células nublado.
  4. Filtre a solução através de um filtro de célula 70 µm situado no topo de um tubo cónico de 50 mL. Lave o filtro com uma solução antibiótica 10ml adicionais para capturar o maior número de células possível. Não esprema o filtro.
  5. Granule as células para 12 min a 300 x g em uma centrífuga de balde oscilante.
    Nota: Após a centrifugação, o tubo será separado em uma camada gordurosa de adipócitos, uma interfase e uma pelota. A pelota é a fração vascular do estroma contendo células endoteliais, células do sistema imunológico, as células do sangue e células progenitoras.
  6. Resuspenda o pellet em 10 mL de HBSS e centrifugar durante 5 min à 300 x g. Repita esta etapa para um total de 2 lavagens em HBSS. Após a lavagem final, não lise os glóbulos vermelhos. Repetidas tentativas com vários buffers comercialmente disponíveis e tempos de incubação têm levado a reduções marcadas na fixação de células progenitoras e viabilidade.
  7. Aspire a gelatina da placa de 24 poços. Lave delicadamente o bem 1x com HBSS remover gelatina desacoplada.
  8. Resuspenda o pellet de fração vascular do estroma com hemácias intactas em 1 mL de sementes para a gelatina-revestido e mídia de crescimento bem. Adicione FGF2 humana (resuspended em PBS suplementado com BSA de 0,01% w/v) a uma concentração final de 25 ng/mL em meio de cultura. Incube durante 24 horas a 37 ° C com 5% de CO2.
  9. No dia seguinte, remover mídia de crescimento e lavagem poços 5x com HBSS para remover células vermelhas do sangue e as células mortas. Adicione 1 mL de meio de crescimento fresco suplementado com 25 ng/mL FGF2.
  10. Mudar a cada 48h, certificando-se de suplemento com 25 ng/mL de mídia FGF2 fresco cada vez.
  11. As células tipicamente alcançar confluência 100% 7-10 dias após explant; Então células de passagem:
    1. Aspirar 2, monocamadas de mídia e lavagem de crescimento x em 1 mL HBSS. Aspire HBSS todos dos poços e adicione algumas gotas de solução de dissociação de célula.
    2. Torneira e agite a chapa várias vezes e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 5 – 7 min levantar as células. Adicionar ~ 1 mL de meio de cultura fresco para as células desanexadas e distribuir 500 µ l a 2 poços de uma placa de 24, cada contendo mídia de crescimento 500 µ l e 25 ng FGF2.
  12. Continue a expandir células humanas PVAT-derivado, conforme indicado no passo anterior. Cada passagem deve ser maior do que uma divisão de 1:2. As células são passadas de 5 a 7 vezes antes de alocar para ensaios de diferenciação.

3. protocolo 2: Cultura medula óssea humana MSC colônias

Nota: Medula óssea humana MSC são isoladas como descrito8 e armazenado como cedo passagem congelada estoques em congelar mídia (70% FBS 20% basal DMEM e 10% DMSO) ~ 100.000 células/ml no líquido N2.

  1. Rapidamente, descongelar um frasco de MSC medula óssea a partir do líquido N2 em um banho-maria a 37 ° C e a placa para um poço de uma placa de cultura de 6-poços contendo 3 mL de meio de crescimento de MSC e incubar durante uma noite a 37 ° C e 5% de CO2.
  2. No dia seguinte, meios de cultura MSC de aspirar e lavar as células 3 x em 2 mL de HBSS. Na confluência de 100%, meios de crescimento de aspirar e lavar as células 3 x em 2 mL de HBSS. Adicionar solução de desprendimento 500 µ l/poço de célula e incubar a 37 ° C e 5% CO2 por 5 min. torneira a placa para garantir que todas as células são desalojados e distribuir conteúdo 2 poços de uma placa de 6 contendo 2 mL MSC crescimento meios de comunicação.
  3. Expanda a medula óssea humana e MSC PVAT-derivado em paralelo para aproximadamente 5-7 passagens ou até quantidades suficientes para o teste tenha sido alcançado.

4. protocolo 3: Placa e induzir Adipogenic, osteogênica e linhagens de Chondrogenic

  1. Placa de número da medula óssea e células PVAT-derivado por bem de uma placa de 12 e apropriado Replica para cada condição experimental. Para adipogenic e condições osteogênicas, ~ 200, 000 – 225.000 células/poço é necessários, para chondrogenic condições, 150.000 – 175.000 células/poço são necessários.
    Nota: Nós corremos um mínimo de N = 3 poços replicar para controle e induzido condições para cada linhagem experimental para um total de 2 independente funciona (N = total de 6 repetições).
  2. Desassocie as células de tanto a população de células progenitoras PVAT humana e a população de MSC medula óssea humana usando solução de desprendimento de célula e incubação a 37 ° C e 5% de CO2 para populações de piscina 5 min. em frascos cônicos 15ml separado. Gire o frasco para baixo a 500 x g durante 7 min para as células de Pelotas. Resuspenda em 1 mL de PBS e usar um hemocytometer para estimar o número de células.
  3. As células em pratos 12-poços da placa como indicado no ponto 4.1. Fornece pratos separados para adipogenic induzido e não induzida, osteogênica e as condições para que a condição não induzida pode ser fixo em um ponto do tempo anterior sem interromper continuando a cultura da condição induzida.
  4. Adicione 1,5 mL de adipogenic e indução osteogênica media a cada poço da condição induzida. Adicione 1,5 mL de adipogenic e osteogênica não-indução mídia a cada poço da condição não induzida. Começa a incubação do adipogenic e populações de células osteogênicas de induzidos e não induzida em 37 ° C e 5% de CO2.
  5. Spin para baixo o volume restante de células humanas de progenitor PVAT e medula óssea humana MSCs para 7 min a 500 x g.
  6. Determine o volume necessário para Ressuspender o restante da medula óssea e células PVAT-derivado pelotas para atingir uma densidade de 100.000 células/10 µ l (106 células/mL). Resuspenda pelotas do volume calculado de mídia de crescimento MSC para indução de linhagem de chondrogenic. Movimente suavemente o volume das células acima e para baixo usando uma pipeta para garantir uma distribuição homogénea.
  7. Pipete uma gotícula de 10 µ l da solução concentrada de células para o centro de cada poço para formar um micromass de 100.000 células. Coloque 1 mL de estéril H2O no poço adjacente para evitar a evaporação. Incubar as culturas micromass por 2 h a 37 ° C e 5% CO2 para permitir que o micromass para agregar.
  8. Depois de 2 horas, cuidadosamente adicionar mídia de diferenciação chondrogenic cravada com 10 ng/mL TGFβ1 humana a cada um dos poços induzida-condição. Cuidadosamente adicione 1,5 mL da mídia não-indução (meio de crescimento da medula óssea MSC) nos poços de condição não induzida. Use chapas separadas 12-poços para as induzido e não induzida condições para que a condição não induzida pode ser fixo em um ponto do tempo anterior.

5. protocolo 4: Cultura Adipogenic, osteogênica e linhagens de Chondrogenic por 14 dias

  1. Cultura as condições de todas as três linhagens induzidas e não induzida por 4 dias a 37 ° C e 5% CO2, refrescante mídia cada 2 dias. No dia 4, altere a condição de linhagem adipogenic induzido de mídia de indução aos meios de manutenção para o restante do ensaio.
  2. Corrigir todas as condições não induzida em formol a 10% por 12 h. Dispose de formalina e lavar tudo fixada poços 2x em PBS para remover todos os vestígios de formol. Armazenar as placas em PBS a 4 ° C até o processamento.
  3. Cultura as condições induzidas por um total de 14 dias, refrescante mídia cada 2 dias. Adicione TGFβ1 fresco em 10 ng/mL concentração final com cada atualização de mídia da indução chondrogenic. Continue a cultura da linhagem de adipogenic na adipogenic manutenção mídia e mídia de indução de linhagem osteogênica, atualizando a cada 2 dias. No dia 14, fixar condições tudo induzidas por 12 h em formol a 10% para a coloração.
  4. Raspar ou despeje o micromass na condição induzida chondrogenic dentro de um estojo para a incorporação. Desidrate o micromass em uma série de banhos de álcool cada vez mais concentrado por 5 min, começando em 70%, em seguida, 80%, duas vezes em 95% e duas vezes mais em álcool absoluto. Coloque a fita em um agente de dealcoholization e então finalmente incorporar a gaveta em cera de parafina para corte e coloração.

6. protocolo 5: Coloração Adipogenic condição com óleo O vermelho

  1. Prepare solução estoque de óleo vermelho O dissolvendo 350 mg de óleo vermelho em 100 mL de isopropanol 100%. Misture por 2 h com uma barra de agitação e vácuo através de um filtro de 0,2 µm. Solução de reserva pode ser armazenada no escuro à temperatura ambiente por 1 ano.
  2. Prepare o óleo vermelho O solução de trabalho misturando 3 partes de solução de 2 partes diH20 (por exemplo, 60 mL da solução de 40 mL diH20). A concentração final de óleo vermelho O da solução de trabalho é de 2,1 mg/mL.
  3. Remova todo fluido de poços. Lave cada bem 2x com 60% de isopropanol, certificando-se de remover completamente toda a água dos lados dos poços. 60% de isopropanol, Aspire e rapidamente adicionar solução de óleo vermelho O trabalho sem tocar as paredes dos poços para cobrir o fundo. É fundamental que este passo é feito rapidamente, assim que os poços não secar.
  4. Se adicionarmos o óleo vermelho O, incube durante 10 minutos à temperatura ambiente com balanço suave.
  5. Remover todo O vermelho de óleo e adicione imediatamente destilada H2O. Wash com água destilada H2O para 10m começar a remover desacoplado óleo vermelho O. Depois de 10 min, Aspire O vermelho de óleo e repita o procedimento de lavagem 3 x.
  6. Uma vez que a lavagem é completa, adicionar PBS e as células da imagem. Armazenar as células coradas em PBS a 4 ° C.

7. protocolo 6: Coloração osteogênica condição com vermelho de alizarina

  1. Remova todo fluido de cada poço. Adicionar um volume adequado de solução de mancha de vermelho de alizarina 2% a cada poço (1,5 mL por bem para uma placa de 12) e inclinar suavemente a placa lateral-lateral até que a solução cobre completamente o fundo do poço.
  2. Incube durante 15 minutos à temperatura ambiente. Vermelho de alizarina remova os poços. Suavemente, enxágue cada poço quatro vezes com água destilada H2O, tomando cuidado para não deslocar os cristais de cálcio. Deixe-a secar.

8. protocolo 7: A coloração tricromo Chondrogenic condição com Masson

  1. Asse slides em forno seco de 60 ° C por 30 min. seções Deparaffinize e hidrato com água destilada.
    1. Para hidratar, coloque slides em três incubação do 5min com agentes de dealcoholization, seguidos de incubação do 5 min em decrescente concentrações de álcool da seguinte forma: dois em 100% (etanol absoluto) em 95% de álcool, dois em 80%, dois em 70% e, finalmente, dois em água destilada H2O. Slides pode permanecer em H2O enquanto fixador de Bouin está preparada.
  2. Lugar de 40 mL de fixador de Bouin em uma jarra de plástico coplin microwavable (descoberta). Microondas em alta para trazer a temperatura de 55 ° C. Coloque o slide em uma solução aquecida por 20 min; deixe descansar no balcão coberto. Lavar em água corrente por 10 minutos ou até que todos da cor amarela desaparece.
  3. Mancha de seções em hematoxilina de Weigert por 10 min. Lave em água corrente por 10 minutos.
  4. Mancha de seções em solução de fucsina ácida escarlate do Beibrich de 10 min. lavar 3 x 10 min em água da torneira. Mordente slides em solução de ácido fosfotúngstico/fosfomolíbdico durante 10 minutos. Não enxague.
  5. Coloque slides diretamente na solução azul de anilina durante 10 min. enxaguar com dois mergulhos breves na água da torneira.
  6. Coloque slides em solução de ácido acético a 1% para 3 a 5 min. Lave em água da torneira por 1 min. lugar em etanol a 95% por 1 min. desidratando, conforme indicado no passo 5.4 e montagem com resina sintética.

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Representative Results

Isolamento da fração vascular do estroma de PVAT humana

A figura 1A mostra um diagrama esquemático da região anatômica, onde obteve-se o PVAT sobrejacente a aorta ascendente. Descrevemos anteriormente as populações de pacientes submetidos a revascularização do qual estas amostras foram derivadas6enxerto de bypass. A figura 1B mostra um exemplo do humano PVAT obtido após a cirurgia. Figura 1 mostra uma secção de tecido PVAT representante manchada com tricromo de Masson. Figura 1 é uma micrografia de contrato fase mostrando uma população de células do estroma PVAT-derivado durante a fase de expansão antes da diferenciação. As células podem ser expandidas e congeladas para uso futuro. As células tipicamente estão congeladas em uma densidade de 2,5 x 105 células/mL em uma mídia composta por 70% FBS, 20% basal (antibiótico livre) DMEM F12 e 10% de DMSO em uma câmara de isopropanol a-80 ° C durante 24 h e mudou-se para a fase líquida de um freezer de2 N líquido para long-t armazenamento de ERM.

Diferenciação de Adipogenic

Estudos foram realizados em paralelo com a MSC derivadas da medula óssea humana (Figura 2AB) e células progenitoras PVAT-derivado (Figura 2D). Os painéis à esquerda da Figura 2 mostram a condição não induzida, onde não há acúmulo de lipídios é evidente. Os painéis mostram células seguindo a diferenciação dos adipócitos e coloração de lipídios neutros com óleo vermelho O. Enquanto o grau de diferenciação em células aórtica humanas PVAT-derivado é mais robusto, ambas as fontes de célula humana exibiram a capacidade de diferenciar-se em direção a linhagem de adipogenic.

Diferenciação osteogênica

O protocolo de diferenciação osteogênica foi usado para MSC derivadas da medula óssea humana (Figura 3A-C) e células PVAT-derivado (Figura 3D– F). Células não-induzido (Figura 3AD) não manchou com vermelho de alizarina. Após o protocolo de diferenciação osteogênica, o MSC humano desenvolveu nódulos calcificados de manchada de vermelho de alizarina (Figura 3B– C), enquanto não células humanas PVAT-derivado da aorta (Figura 3E– F). Estes dados indicam que a nossa preparação de células da fracção do estroma vascular de humanos PVAT falta significativo número de progenitores com a capacidade de se submeter a osteogênese. Dependendo do curso de estudo e tempo de diferenciação, é aconselhável seguir padrão manchas com detecção de marcadores moleculares que definem o compromisso de linhagem osteogênica (por exemplo, RUNX2, osterix, fosfatase alcalina) ou osteoblastos (osteopontin, osteocalcina, fosfatase alcalina, BAP1).

Chondrogenic diferenciação

Células derivadas de ambos medula óssea humana MSC (Figura 4A) e PVAT humano (Figura 4B) exibir a característica de características de diferenciação de chondrogenic, com acúmulo de colágeno abundante no micromass. Micromasses formado a partir da medula óssea humana MSC e células PVAT-derivado da aorta também exibiram abundante acúmulo de glicosaminoglicanos (azul), conforme indicado pela coloração de Alcian blue (Figura 4-D, respectivamente). Morfologicamente, estruturas semelhantes a lacunas foram detectadas com células sentado nas cavidades circundantes pela deposição de colágeno (Figura 4, setas). Dependendo do curso de estudo e tempo de diferenciação, a detecção de marcadores específicos de chondrogenic (aggrecan, colágeno tipo II, osteonectin, Sox9) é útil.

Figure 1
Figura 1: características morfológicas da humana PVAT. (A) Cartoon representação da aorta humana (vermelha) em redor da PVAT (amarelo). A seta indica a aorta ascendente. (B), um pedaço de 480 mg de PVAT aórtica humana de um paciente de CABG em DMEM antes da dissociação. Coloração tricromo de Masson (C) de PVAT humana de parafina fixada em formol (castanho escuro/preto = núcleos, azul/roxo = tecido conjuntivo, rosa = citoplasma; Nota, RBC aparecem rosa-avermelhada. (D) imagem representativa das células estromais-PVAT explantadas aos 7 dias em cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: diferenciação de Adipogenic. (A) fase microscopia da medula óssea humana MSC na condição induzida por não mostra nenhuma evidência de diferenciação. (B) fase microscopia da medula óssea humana MSC na condição induzida adipogenic mostra alguns diferenciação e imobilização de lipídios neutros, manchado com óleo vermelho O após 14 dias. (C) fase de microscopia de aórtica PVAT-derivado células humanas na condição de adipogenic induzida por não mostra nenhuma evidência de diferenciação. (D) microscopia de fase de aórtica PVAT-derivado células humanas na condição induzida adipogenic mostra diferenciação robusta e imobilização de lipídios neutros, manchado com óleo vermelho O após 14 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Diferenciação osteogênica. (A) fase microscopia da medula óssea humana MSC na condição osteogênica induzida por não mostra nenhuma evidência de diferenciação em direção a uma linhagem osteogênica. (B) fase microscopia da medula óssea humana MSC no estado induzido após 14 dias na cultura mostra evidência de diferenciação e formação de depósitos de cálcio manchada de vermelho de alizarina (setas). (C), uma imagem do bem que contém a medula óssea humana MSC na condição osteogênica induzida após coloração com vermelho de alizarina indica a deposição de cálcio abundante, sugerindo diferenciação bem-sucedida em direção a uma linhagem osteogênica (setas, deposição de cálcio). (D) fase de microscopia de aórtica PVAT-derivado células humanas na condição osteogênica induzida por não apresenta nenhuma indicação de diferenciação em direção a uma linhagem osteogênica. (E) fase de microscopia de aórtica PVAT-derivado células humanas na condição osteogênica induzida após 14 dias na cultura mostra nenhuma evidência de diferenciação em direção a uma linhagem osteogênica ou deposição de cálcio quando manchada de vermelho de alizarina, apenas mancha não específica. (F), uma imagem do bem que contenham aórtica PVAT-derivado células humanas na condição induzida osteogênica seguir coloração com vermelho de alizarina mostra apenas específico de coloração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Diferenciação Chondrogenic. (A, B) Microscopia de luz de uma seção do micromass formado pela medula óssea humana MSC (A) ou PVAT aórtica humana células progenitoras (B) na condição induzida chondrogenic após 14 dias na cultura e posteriormente corados com Trichrome de Masson, que indica significativa deposição de colágeno (azul) e sugere a diferenciação bem-sucedida em direção a uma linhagem de chondrogenic. (C, D) Microscopia de luz de uma seção do micromass formado pela medula óssea humana MSC (C) ou PVAT aórtica humana células progenitoras (D) na condição induzida chondrogenic após 14 dias na cultura e posteriormente corados com Alcian blue, que indica a deposição de ácidos os proteoglicanos (por exemplo, glicosaminoglicanos) como são normalmente encontrados na cartilagem. Corante de contraste, nuclear rápido vermelho; setas, lacunas-como estruturas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Células progenitoras adiposa de diferentes depósitos variam amplamente no fenótipo e diferenciação potencial9. Cultivo de progenitores PVAT-derivado de um único doador paciente na indução simultânea para baixo três linhagens diferentes, adipogenic, osteogênica e chondrogenic, permite uma investigação bem controlada da capacidade deste romance pluripotentes população de células progenitoras. A metodologia descrita neste relatório pode ser usada para testar a capacidade de diferenciação de células progenitoras de PVAT humana e entender sua função na regulação patologias PVAT e Tom vascular. Alguns benefícios desta técnica são sua simplicidade e utilização de tecido humano primário de artéria coronária ignorar pacientes, possibilitando, assim, a investigação da função de células progenitoras PVAT de pacientes com doença cardiovascular grave. No entanto, explantes de um pedaço de 500 mg de tecido geralmente produzem < aderente de 1000 células e portanto necessitam de 5 – 7 passagens para obter números adequados, destacando uma ressalva importante para esta abordagem. Fundamental para o sucesso dos experimentos de diferenciação do tri-linhagem é a qualidade do explante inicial da célula do doador PVAT. É essencial para picar finamente o tecido completamente antes da dissociação enzimática. Além disso, ao contrário de outros protocolos de explante, encontramos uma dramática perda de número de celular, viabilidade e qualidade global quando o tampão de lise de células vermelhas do sangue era usada antes do chapeamento. Em vez disso, é altamente recomendável a placa inteira do estroma vascular fração (incluindo células vermelhas do sangue). Após 24h, células aderentes têm acompanha e pilhas de sangue vermelhas lysed não podem ser removidas através de repetidas lavagens com HBSS. Passagem das células do estroma PVAT-derivado deve ser não maior que 1:2 divisões. Observamos uma redução na taxa de crescimento, quando as células foram dividida 1:3 ou maior.

O componente mais difícil do ensaio de diferenciação do trilineage é a condição de chondrogenic, que requer um método menos comuns de cultivo as células em um "micromass" e histológica de incorporação e de corte. Deve ter cuidado para as gotículas de 10 µ l de 100.000 células da placa corretamente e não perturbe a massa sobre a adição de meio de cultura. Encontramos a variação entre os ensaios ou não o micromass permaneceram aderidas à placa ou suspenso no meio. Mesmo quando a massa não permaneceram aderida, a viabilidade de estrutura e célula micromass permaneceu consistente.

Células estaminais ou progenitoras dentro do microambiente vascular são responsáveis pela reparação tecidual em resposta à lesão ou doença. Mais bem caracterizados são populações que derivam de compartimentos Pericito/adventícia, embora ainda haja controvérsia sobre se há uma identificação molecular padronizada dessas populações em seres humanos10,11 . Neste protocolo, estudamos uma população de células progenitoras especificamente derivada PVAT humano para testar a sua propensão para diferenciar uma linhagem osteogênica, chondrogenic ou adipogenic. Usando técnicas de coloração para definir celular compromisso de cada linhagem, demonstramos que, ao contrário MSC da medula óssea humana, células progenitoras de PVAT humana não foram capazes de diferenciar-se no sentido de uma linhagem osteogênica (Figura 3), mas exibem robusto adipogenic diferenciação. A capacidade de diferenciação de chondrogenic é comparável entre medula óssea e células PVAT-derivado. Isto sugere que as células progenitoras PVAT-derivado podem ser linhagem mais restringida do que a medula óssea MSC ou que os progenitores PVAT não diferenciar facilmente em linhagens osteogênicas. Estudos futuros devem incluir uma investigação da expressão de gene e proteína de marcadores para cada linhagem mais quantitativamente avaliar a capacidade de diferenciação das células PVAT-derivado.

Células-tronco derivadas adiposo foram um foco para aplicações de medicina regenerativa, devido ao fácil acesso e o elevado número de células que podem ser derivadas de tecido adiposo12,13. Dentro do estroma vascular fração de tecido adiposo, existem células vasculares, células inflamatórias, fibroblastos, preadipocytes e células-tronco adiposo-derivado. Existem diferenças na população de células-tronco com base na localização anatômica do tecido adiposo depot e adipócito características14. O mais importante, as células-tronco adiposo-derivado parece ter a capacidade não só de se diferenciar em linhagens mesenquimais15, mas também potencial para adotar neuronal16,17 e epidérmico18 destinos.

Numerosos estudos focalizaram sobre células tronco/progenitoras derivadas de tecidos adiposo subcutâneos brancos de humanos, mas poucos estudos abordaram as características das populações no PVAT progenitor. Estudos recentes isolaram as células progenitoras dos adipócitos de vasos mesentéricos circundantes de PVAT ou aorta torácica do rato. Estes CD34 + CD140a + populações diferenciadas em adipócitos, embora a capacidade para derivar outras linhagens não foi testaram19.

Nós recentemente caracterizada células progenitoras adiposa derivadas da fração do estroma vascular PVAT humano de portadores de doença coronariana avançada6. Estas células progenitoras adiposas foram CD73 +, CD105 + e CD140a + e eficientemente diferenciadas em adipócitos com características termogênico (expressão da UCP1)6. No trabalho atual, encontramos uma potência limitada a linhagem das células derivadas PVAT comparado a MSC derivadas da medula óssea, sugerindo uma falta ou uma população mínima de células-tronco derivadas adiposo que caracterizaram-se de outros tecidos adiposo humanos. Uma consideração para este protocolo é a variabilidade esperada entre espécimes humanos, que podem afetar o número de células tronco/progenitoras dentro da amostra PVAT e sua capacidade de submeter-se a diferenciação de linhagens distintas. Idade, sexo, IMC, medicamentos e outros parâmetros clínicos provavelmente afetam o fenótipo das células progenitoras dentro PVAT. Assim, o esperado futuras modificações do presente protocolo esperam por uma população mais de progenitor claramente definidos dentro PVAT humana e possivelmente usando celular classificação para isolar as subpopulações específicas para estudos de linhagem.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Reconhecemos a assistência de navegação de pesquisa no Maine Medical Center para assistir com a aquisição de tecido clínico, histopatologia e Histomorfometria Core (apoiada pela 1P20GM121301, L. Liaw PI) em Maine Medical Center Research Instituto de corte e coloração. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01 HL141149 (L. Liaw).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I   Millipore-Sigma SCR139 50mg
Alcian Blue NewComerSupply 1003A 1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red Amresco 9436-25G
alpha-MEM ThermoFisher 12561056
Aniline Blue NewComerSupply 10073C
Antibiotic/antimycotic ThermoFisher 15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin Millipore-Sigma A3908-25G
b-glycerophosphate Millipore-Sigma G9422-10G
Biebrich Scarlet EKI 2248-25G
Biotin Millipore-Sigma B4501-100MG
Bouin's fixative NewComerSupply 1020A
Bovine serum albumin Calbiochem 12659 stored at 4 °C
Cell detachment solution Accutase AT104
Bell strainer (70 mm) Corning 352350
Dexamethasone Millipore-Sigma D4902-100MG
DMEM Corning 10-013-CV 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium ThermoFisher 10565-042 high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO Millipore-Sigma D2650
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals  S11550
FGF2 Peprotech 100-18B
Formalin NewComerSupply 1090
Gelatin, bovine skin Millipore-Sigma G9391-500G
Glutamax ThermoFisher 35050061 glutamine supplement
HBSS Lonza 10-547F
IBMX Millipore-Sigma I5879-250MG
Insulin solution Millipore-Sigma I9278-5ML
Oil red O Millipore-Sigma O0625-100G
Pantothenic acid Millipore-Sigma P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution ThermoFisher 15240062 100ml
Permount Fisher SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution Millipore-Sigma P4006-100G/221856-100G
Primocin Invivogen ant-pm-1 Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone Millipore-Sigma R2408-10MG
TGFb1 Peprotech 100-21
Weigert's hematoxylin EKI 4880-100G

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References

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