Summary
Målet med denne protokol er at genotype havanemone Nematostella vectensis under gastrulation uden at ofre embryonet.
Abstract
Beskrevet her er en PCR-baseret protokol til genotype gastrula Stage embryo af anthozoan cnidarian Nematostella vectensis uden at ofre dyrets liv. Efter in vitro befrugtning og de-jellyve, zygoter har lov til at udvikle sig til 24 h ved stuetemperatur for at nå den tidlige-til midten af gastrula fase. Gastrula-embryonerne anbringes derefter på en agrose gel-seng i en Petri skål, der indeholder havvand. Under den dissekere mikroskop, en wolfram nål bruges til kirurgisk adskille en aboral væv fragment fra hvert embryo. Efter operation embryoner får derefter lov til at helbrede og fortsætte udviklingen. Genomisk DNA udvindes fra det isolerede vævs fragment og anvendes som skabelon for locus-specifik PCR. Genotypen kan bestemmes ud fra størrelsen af PCR-produkter eller tilstedeværelse/fravær af allel-specifikke PCR-produkter. Efter operationen sorteres embryoner i henhold til genotypen. Varigheden af hele genotypebestemmelse processen afhænger af antallet af embryoner, der skal screenes, men det minimalt kræver 4 – 5 h. Denne metode kan bruges til at identificere knockout-mutanter fra en genetisk heterogene population af embryoner og muliggør analyser af fænotyper under udvikling.
Introduction
Cnidarians repræsenterer en mangfoldig gruppe af dyr, der omfatter vandmænd, koraller og søanemoner. De er diploblaster, sammensat af ectoderm og endoderm, der er adskilt af en ekstracellulær matrix (mesoglea). CNIDARIA er en søster gruppe til speciose Bilateria, som traditionelle dyremodeller som Drosophila og mus tilhører1. Desuden, CNIDARIA-Bilateria divergens menes at have fundet sted i præ-Cambrian periode2. Som sådan, sammenlignende undersøgelser af cnidarians og bilaterians er afgørende for at få indsigt i biologi af deres seneste fælles forfader. For nylig har Komparativ genomforskning afsløret, at cnidarer og bilaterianere deler mange udviklingsmæssige Toolkit-gener såsom notch og bhlh, hvilket antyder, at deres fælles forfader allerede havde disse gener3. Men, rollen af disse udviklingsmæssige Toolkit gener i den sidste fælles forfader af CNIDARIA og Bilateria er sammenligneligt mindre godt forstået. For at løse dette problem, er det afgørende at studere, hvordan disse dybt bevaret gener fungerer i cnidarians.
En af de spirende cnidariske genetiske modeller er anthozoan Nematostella vectensis. Dens genom er blevet sekvenseret3, og en række genetiske værktøjer, herunder morpholino-mediated gen Knockdown, meganuclease-mediated transgenesis, og crispr-Cas9-mediated gen knockins og Knockouts, er nu tilgængelige for brug i dette dyr. Desuden er Nematostella udvikling relativt godt forstået. Under embryogenese sker gastrulation ved indkrængning4, og embryonet udvikler sig til en frisvømning planula Larva. Planula omdannes derefter til en sessile polyp med en mund og circumoral tentakler. Polyp derefter vokser og når seksuel modenhed.
Crispr-Cas9-medieret målrettet mutagenese anvendes nu rutinemæssigt til at studere genfunktion i nematostella vectensis5,6,7,8,9. At generere knockout mutanter i nematostella, en cocktail, der indeholder locus-specifikke enkelt-guide RNAs og endonuklease Cas9 protein er først injiceres i ubefrugtede eller befrugtede æg til at producere F0 grundlægger dyr, der typisk viser mosaisme. F0 dyr er efterfølgende hævet til seksuel modenhed og krydses med hinanden for at producere en F1 befolkning, en delmængde af som kan være knockout mutanter6. Alternativt kan seksuelt modne F0 dyr krydses med vilde-type dyr til at generere F1 heterozygot dyr, og F1 heterozygoter, der bærer en knockout allel i locus af interesse kan derefter krydses med hinanden for at producere F2 afkom, en fjerdedel heraf forventes at være knockout mutanter5. Begge tilgange kræver en metode til at identificere knockout-mutanter fra en genetisk heterogene population. Polyp tentakler kan anvendes til at udtrække genomisk DNA til genotypebestemmelse6,7. Men i tilfælde, hvor den udviklingsmæssige funktion af det gen af interesse er ved at blive undersøgt, og mutant embryoner ikke når polyp-stadiet (dvs. på grund af larve dødelighed forbundet med mutationen), skal knockout mutanter identificeres tidligt i ontogeny. Beskrevet her er en PCR-baseret protokol til genotype individuelle dyr på gastrula scenen uden at ofre dyret, hvilket gør det muligt at identificere knockout-mutanter fra en genetisk heterogene population af embryoner. Varigheden af hele genotypebestemmelse processen afhænger af antallet af embryoner, der skal screenes, men det minimalt kræver 4-5 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. induktion af gydning, in vitro -befrugtning og de-jellyve
- Vedligehold Nematostella vectensis i havvand med en saltholdighed på 12 dele pr. tusind (PPT) i mørke ved 16 °c, fodring artemia dagligt.
- Placer dyrene i en temperatur-og lyskontrolleret inkubator dagen før gyde induktion. Programmer inkubator, så dyrene udsættes for 8 h lys ved 25 °C. Valgfrit: foder et lille stykke (< 1 mm3) østers til de enkelte dyr, før de placeres i inkubator for at forbedre gydningen.
- Lad dyrene stå i inkubator i 1 time ved 16 °C.
- Fjern dyrene fra inkubatoren og lad dem stå på en bordplade med lys ved stuetemperatur (RT) for at tillade gydningen. Gydningen opstår normalt inden for de næste 1,5 – 2 timer.
- Hvis hanner og hunner er i separate beholdere, skal du anbringe ægpakker fra den kvindelige beholder i en sædcelle beholder med en overførings pipette, hvis spids er skåret for at forstørre åbningen, så æggene ikke beskadiges af mekanisk belastning under Overføre. Lad æggene befrugtet ved at efterlade dem i den mandlige beholder i mindst 15 minutter.
- De-Jelly ægpakkerne i havvand indeholdende 3% cystein (pH 7,4) på en Petri skål eller i et 15 mL rør. Rystes forsigtigt på en shaker i 12 minutter.
- Brug en plastik pipette til at bryde op klumper og fortsætte med at agitere for en anden 2-3 min indtil helt de-jellied.
- Fjern cystein ved at udskifte mediet med fersk havvand i mindst 5x.
- Opbevar de befrugtede æg på en Glaspetri skål ved 16 °C eller RT.
2. kirurgisk fjernelse af et aboralsk væv fra et gastrula-embryon
- Der fremstilles en DNA-ekstraktions buffer bestående af 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 og 1 mg/mL proteinase K. Brug 20 mL ekstraktions buffer pr. embryo. Bland godt af vortexning og alikvot bufferen i PCR-rør.
- 1% agopstået i havvand opløses og hældes i en Petri skål for at dække bunden. Afkøles på en bordplade for at lave en gel seng. Hæld frisk havvand til at dække gel sengen i Petri skålen.
- Overfør 24 timer efter befrugtning (HPF) embryoner (tidligt-til midten af gastrula fase) i Petri skålen indeholdende en agopstået gel seng.
- Indsæt en wolfram nål i en nål holder og sterilisere ved at dyppe nålen spidsen i alkohol (70% eller højere) og placere den i flamme til at brænde af alkohol.
- Under en dissekere mikroskop (ved 20x til 40x forstørrelse), bruge wolfram nål til at gøre en depression på den agerede seng ved at fjerne et stykke overflade agopstået om størrelsen af et foster, der skal manipuleres, og placere embryonet på depression med sin laterale side nedad for at begrænse embryoens bevægelser til mikrokirurgi.
- Brug wolfram nålen til kirurgisk punktafgiftspligtige et stykke aboral væv placeret modsat den mundtlige blastoporal åbning. En aboral en tredjedel til en fjerdedel af embryonvæv langs den orale-aborale akse er normalt tilstrækkelig.
- Brug en P20-pipette til at overføre det isolerede aborale væv (i < 2 mL) til et PCR-rør, der indeholder 20 mL DNA-ekstraktions buffer.
- Efter operationen overføres til en brønd, der indeholder mindst 500 mL fersk havvand i en 24-eller 96-brønd plade.
- Gentag trin 2.4-2,8 for antallet af embryoner efter behov.
- Den brønd plade, der indeholder efter kirurgiske embryoner, placeres i en inkubator ved 16 °C eller RT, indtil genotypebestemmelse er afsluttet.
3. genomisk DNA-ekstraktion og genotypebestemmelse PCR
- Spin kort de PCR-rør, der indeholder DNA-ekstraktions bufferen, og isolerede embryonale væv ved hjælp af en mini-centrifuge (f. eks. ved 2.680 x g i 10 s).
- For at udtrække genomisk DNA fra enkelte embryoner inkuberes PCR-rørene ved 55 °C i 3 h. vortex i 30 s hver 30 min for at sikre opløsning af celle klumper og forbedre celle lysis.
- PCR-rørene skal inkuberes ved 95 °C i 5 minutter for at inaktivere proteinase K.
- Hold gDNA-ekstrakterne ved 4 °C eller på is, og Fortsæt straks til PCR.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her ved at placere gDNA-ekstrakter i a-20 °C fryser. - Konfigurer en PCR-reaktion ved hjælp af ekstraheret gDNA som en skabelon for at forstærke den genomiske locus af interesse.
- Hvis forskellige alleler på locus af interesse afviger i størrelse, således at Størrelsesforskellen kan påvises ved agrose gel elektroforese, designe et enkelt sæt af primere til at forstærke hele locus.
- Alternativt kan du bruge allel-specifikke primere, der genererer PCR-produkter kun i nærværelse af den specifikke allel; for eksempel ved at designe primer, der binder sig til en region, der indeholder indsættelse/sletning mutationer.
- Der anvendes en typisk 20 mL PCR-reaktionsblanding som følger: 5 mL gDNA-ekstrakter, 8 mL nuklease frit vand, 4 mL PCR-buffer, 0,2 mL 10mM dNTPs, 0,6 mL DMSO, 1 mL 10 mM frem primer, 1 mL 10 mM omvendt primer og 0,2 mL DNA-Polymerase (Se tabel over materialer).
Bemærk: flere primere kan bruges i en PCR-reaktion. F. eks. kan en Universal Forward primer og to allel-specifikke omvendte primere kombineres, så længe de to omvendte primere er konstrueret til at generere PCR-produkter af forskellige størrelser, således at tilstedeværelsen/fraværet af de to alleler utvetydigt kan bestemmes af gel elektroforese (Se afsnittet om repræsentative resultater).
- Kør agrose gel elektroforese for at bestemme størrelsen og tilstedeværelsen/fraværet af PCR-produkter. Juster tilstanden af agrose gel elektroforese (f. eks. agrose gel procent, V/cm og varighed) afhængigt af den forventede størrelse af PCR-produkter.
- Brug resultaterne fra PCR vedrørende størrelse og tilstedeværelse/fravær af PCR-produkter til at tildele en genotype til hvert embryo efter operationen. Hvis det for eksempel forventes, at forskellige alleler genererer PCR-produkter af forskellig størrelse, skal du bruge størrelses oplysningerne til at tildele genotypen for hvert embryo. Hvis der anvendes allel-specifikke primere, bør der anvendes data om tilstedeværelse/fravær af PCR-produkter til at tildele hvert embryo en genotype.
- Sorter embryoner efter genotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nematostella genom har en enkelt locus, der koder et prækursorprotein for neuropeptidglwamid. Tre knockout-mutant alleler på denne locus (GLW-a, GLW-bog GLW-c) er tidligere blevet rapporteret5. Fire heterozygot mænd med en vildtype allel (+) og knockout allel GLW-cved glwamide locus (genotype: +/GLW-c) blev krydset med en heterozygot kvinde, der bar en vild-type allel og forskellige knockout allel GLW-a på samme locus (genotype: +/GLW-a) for at generere et afkom. Der er fire mulige genotyper i Progeny: GLW-a/GLW-c, +/GLW-c, GLW-a/+ og +/+. Ud af alle afkom blev otte embryoner udvalgt tilfældigt til denne repræsentative genotypebestemmelse. For genotype PCR blev en Universal Forward primer og to allel-specifikke omvendte primere designet5. Den omvendte primer, som er specifik for GLW-a , binder sig til et område, der indeholder indsætnings mutationer, og den forventede størrelse af PCR-produktet er 151 BP. Den omvendte primer, som er specifik for GLW-c , binder sig til et område, der indeholder både indsætnings-og sletnings mutationer, og den forventede størrelse af PCR-produktet er 389 BP. Hverken reverse primer kan binde sig til vildtype sekvensen, og der vil således ikke blive genereret PCR-produkter fra vildtype embryoner. Figur 1 viser et repræsentativt resultat af PCR-analysen. Embryoer 1 og 2 viser et enkelt PCR-bånd i overensstemmelse med den forventede størrelse af GLW-a. Embryoner 3 og 6 viser to PCR-bands, der svarer til de forventede størrelser for alleler GLW-aog GLW-c. Embryoner 4, 7 og 8 viser et enkelt PCR-bånd i overensstemmelse med den forventede størrelse af GLW-c. Embryo 5 viser ingen bands, hvilket tyder på manglen på primer binding.
For at udelukke muligheden for gDNA-ekstraktions svigt blev en anden PCR kørt ved hjælp af en omvendt primer, der kan binde sig til Wild-type sekvensen, som viste et PCR-produkt af en forventet størrelse (1290 BP; Figur 2). Det skal bemærkes, at i figur 2viste en af prøverne (angivet med *) ingen PCR-produkter, hvilket tyder på en fejl i gDNA-ekstraktionen.
På grundlag af ovenstående resultater fortolkes genotypen for hvert embryo som følger: embryo 1: +/GLW-a, embryo 2: +/GLW-a, embryo 3: GLW-a/GLW-c, embryo 4: +/GLW-c, embryo 5: +/+, embryo 6: GLW-a/GLW-c, embryo 7: +/GLW-cog embryo 8: +/GLW-c.
Figur 1: repræsentative resultater af en genotypebestemmelse PCR-analyse. 1-8 repræsentere Geno Typing PCR resultater fra tilfældigt udtagne embryoner blandt afkom af en F1 heterozygot mutant Kors mellem en +/GLW-a kvindelige og +/GLW-cmænd. gDNA blev ekstraheret fra et embryon vævs fragment og anvendt som PCR-skabelon. GLWamide locus var målrettet til PCR-forstærkning, og der blev anvendt en Universal Forward primer og to allel-specifikke omvendte primere (tabel over materialer). Den omvendte primer, der er specifik for GLW-a , genererer et 151 BP PCR-bånd (1, 2, 3, 6), mens den omvendte primer, der er specifik for GLW-c , genererer et 389 BP PCR-bånd (3, 4, 6, 7, 8). Hverken reverse primer kan binde sig til vildtype sekvensen, og der vil således ikke blive genereret PCR-produkter fra vilde embryoner (5). 1,5% agopstået gel blev kørt ved 128 V i 25 min. En 100 BP DNA stigen blev brugt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative resultater af locus-specifik PCR for at bekræfte tilstedeværelsen af gDNA. Ti gDNA-uddrag, der ikke genererede PCR-produkter i GLW mutant allele-specifikke PCR-eksperimenter, herunder embryo 5 fra figur 1 (' 5 '), blev anvendt som PCR-skabeloner til det viste PCR-eksperiment. En universel frem-og bagside-Glwamid-locus-specifik primere blev brugt til at generere et 1290 BP PCR-produkt fra en vildtype-allel. Ni ud af ti DNA-ekstrakter (med undtagelse af den viste *) viste et PCR-bånd af forventet størrelse, herunder embryo 5 fra figur 1 (' 5 '). Dette tyder på, at den manglende generering af PCR-produkter fra embryo 5 ikke skyldtes manglen på en tilstrækkelig gDNA-skabelon. 1,5% agopstået gel blev kørt ved 128 V i 25 min. 1 kb DNA stigen blev brugt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her en PCR-baseret protokol til genotype et enkelt havanemone embryo uden at ofre dyret. Efter gyde og de-jellyve, de befrugtede æg får lov til at udvikle sig til gastrulae. Den aborale region af hvert gastrula-embryon fjernes kirurgisk, og det isolerede aborale væv anvendes til efterfølgende genomisk DNA-ekstraktion, mens de resterende embryoner fra efter operationen heler og fortsætter udviklingen. GDNA-ekstrakterne anvendes derefter til en PCR-analyse for at bestemme genotypen for hvert embryo. Denne metode udnytter den evne, som de mundtlige halvdele af Sea anemone embryo har til at regulere og udvikle10,11, og størstedelen af embryonerne (> 90%) typisk overleve operationen og udvikle sig normalt under passende kulturforhold. Det vævs beløb, der kræves til denne genotypebestemmelse, er mindre end halvdelen af et helt gastrula-embryon, og negative resultater på grund af gDNA-ekstraktions svigt er sjældne (< 5%). Da kun en lille mængde væv er nødvendig, er det sandsynligt muligt at anvende præ-gastrula Stage embryoner til denne genotypebestemmelse; selv om, dette er endnu ikke afprøvet. Denne metode kan udføres effektivt, så længe dyret ikke har nået en fase af aktiv svømning (dvs. før fri-svømning planula fase). Denne genotype metode er særlig fordelagtig i tilfælde, hvor der kræves udførelse af phenotypeanalyser under udviklingen.
En begrænsning af denne protokol er, at antallet af embryoer, der kan screenes, er begrænset. Især, kirurgisk fjernelse af en aboral væv kan tage en til to minutter pr embryo, især for uindviede. En erfaren forsker bør kunne fuldføre hele genotype analysen for mindst 80 embryoner pr. dag, men undersøgelser, der involverer hundreder eller tusinder af embryoner, er sandsynligvis for tidskrævende at fuldføre på én dag.
Forskerne skal også være opmærksomme på, at Fænotypen observeret i post-kirurgi mutanter kan være anderledes end i intakte mutanter, for eksempel på grund af effekten af gen knockout på healing og/eller embryonale regulering i gastrulae. Denne mulighed bør testes ved at undersøge, om fænotype, der findes i post-kirurgi mutanter er faktisk observerbare i intakt mutanter.
Der er flere alternative tilgange til den beskrevne metode til genotypebestemmelse. For det første kan immun farvning med et antistof mod et protein, hvis udtryk er tabt i knockout mutanter, udføres for at identificere knockout mutant individer fra en genetisk heterogene population af dyr, der udvikler sig. For det andet kan in situ -hybridisering anvendes til dette formål, hvis riboprobe kan udformes således, at det ikke hybridiserer til mutant mRNAs. For eksempel, hvis de mutante alleler af et knockout-dyr bærer store sletnings mutationer i samme region af genet, kan riboprobe designes til at hybridisere til den region af genet, der udgår i knockout-mutanterne. I begge tilfælde, knockout mutanter forventes at vise nogen mærkning, mens heterozygot og vildtype individer bør vise mærkning. Dyrene skal dog ofres på grund af vævs fiksering, der kræves til farvning. Endelig kan knockout mutanter hæves til seksuel modenhed og krydses med hinanden for at generere en afkom, som alle bør være knockout mutanter, og analyser af udviklingsmæssige fænotype kan udføres ved hjælp af denne afkom6. Denne metode kræver, at udskærings dyrene er levedygtige og i stand til reproduktion og dermed begrænses i anvendelsen til ikke-essentielle gener.
Selv om den beskrevne genotypebestemmelse er designet til havanemone embryoner, er det muligt at anvende denne metode sammen med andre cnidarer, hvor både genominformation og embryoner er tilgængelige (f. eks. koraller12 og vandmænd13), så længe embryonerne er i stand til helbredelse og regulering ved kirurgisk fjernelse. Vellykkede forsøg med crispr-medieret genmodificering er allerede blevet rapporteret i koraller14 samt hydrozoan vandmænd15,16. Fremtidige anvendelser af denne genotype protokol til ikke-Sea anemone cnidarians vil være vigtige for undersøgelser af det genetiske grundlag for deres udvikling. Dette vil igen være nøglen til at få mekanistisk indsigt i udviklingen af bemærkelsesværdigt forskelligartet cnidarisk udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker anonyme anmeldere for kommentarer til den tidligere version af manuskriptet, som forbedrede manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af midler fra University of Arkansas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G.
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
