Summary
हम जल्दी माउस भ्रूण में microRNAs प्रोफाइलिंग के लिए एक तकनीक का वर्णन । यह प्रोटोकॉल कम सेल इनपुट और छोटे आरएनए संवर्धन की चुनौती पर काबू पा रहा है। इस परख का उपयोग प्रारंभिक माउस भ्रूण के विभिन्न सेल वंश में समय के साथ मिरना अभिव्यक्ति में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
माइक्रोआरएनए (miRNAs) सेल भाग्य निर्णयों और विकास के समय के जटिल विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं। प्रारंभिक विकास के दौरान मीनरना के योगदान के वीवो अध्ययन में सीमित सेल संख्या के कारण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं। इसके अलावा, कई दृष्टिकोणों को उत्तरी ब्लॉटिंग, माइक्रोएरी और क्यूपीसीआर जैसे परखों में परिभाषित करने के लिए ब्याज के मिरना की आवश्यकता होती है। इसलिए, प्रारंभिक विकास के दौरान कई मीन्रानों और उनके आइसोफॉर्म की अभिव्यक्ति का अध्ययन नहीं किया गया है। यहां, हम प्रारंभिक माउस भ्रूण से सॉर्ट कोशिकाओं के छोटे आरएनए अनुक्रमण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं ताकि तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं की प्रारंभिक आबादी में मिरनास की अपेक्षाकृत निष्पक्ष प्रोफाइलिंग को सक्षम किया जा सके। हम प्रवर्धन और जेल आधारित शुद्धिकरण का उपयोग कर पुस्तकालय तैयारी के दौरान कम सेल इनपुट और आकार चयन की चुनौतियों को दूर करते हैं। हम प्रतिकृति और मंच मिलान माउस भ्रूण के बीच भिन्नता के लिए एक चर लेखांकन के रूप में भ्रूण की पहचान जैविक प्रतिकृति में सही प्रोफ़ाइल miRNAs के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । हमारे परिणाम बताते हैं कि इस विधि को कोशिकाओं के अन्य वंशों से मीनरना की अभिव्यक्ति को प्रोफ़ाइल करने के लिए मोटे तौर पर लागू किया जा सकता है। संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे miRNAs प्रारंभिक माउस भ्रूण के विभिन्न सेल वंश में विकास कार्यक्रमों को विनियमित करते हैं।
Introduction
विकासात्मक जीव विज्ञान का एक केंद्रीय प्रश्न यह है कि कैसे एक भी अविभेदित कोशिका कई जटिल कोशिका प्रकारों के साथ एक पूरे जीव को जन्म दे सकती है। भ्रूणजीन के दौरान, कोशिकाओं की विकासात्मक क्षमता उत्तरोत्तर प्रतिबंधित हो जाती है क्योंकि जीव विकसित होता है। एक उदाहरण तंत्रिका क्रेस्ट वंश है, जो उत्तरोत्तर एक बहुपेंट सेल आबादी से विभिन्न टर्मिनल डेरिवेटिव में अलग करता है, जैसे परिधीय न्यूरॉन्स, ग्लिया, कपाल हड्डी और उपास्थि। तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं को गैस्ट्रेशन के दौरान एकोडोडर्म से निर्दिष्ट किया जाता है और फिर मेसेंकिमल संक्रमण के लिए एक एपीथेलियल से गुजरना पड़ता है और भ्रूण के माध्यम से पूरे शरीर में असतत स्थानों पर स्थानांतरित हो जाता है जहां वे मरणासन्न अंतरकरेंगे 1। काम के दशकों में एक प्रतिलेखन जीन नियामक नेटवर्क का पर्दाफाश किया है, लेकिन अभी तक कम के बाद ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन है कि तंत्रिका शिखा विकास के समय को नियंत्रित करने के तंत्र के बारे में जाना जाता है ।
पिछले कार्य से पता चलता है कि माइक्रोआरएनए (एमआईआरएन) उचित विकासात्मक समय और कोशिका भाग्य निर्णयों के लिए जीन अभिव्यक्ति का दमन करता है2,3,4,5,,6. तंत्रिका शिखा विकास में मिरनस के अध्ययन काफी हद तक क्रैनियोफेशियल विकास के बाद के चरणों पर केंद्रित हैं। उदाहरण के लिए, माउस और जेब्राफिश में क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान पैलेटोजेनेसिस के लिए एमआईआर-17 ~ 92 और एमआईआर-140 क्रमशः7,,8हैं। भ्रूण के शुरुआती तंत्रिका शिखा भाग्य निर्णयों में मिर्ना के योगदान की पूरी तरह से जांच नहीं की गई है । प्रारंभिक भाग्य निर्णयों में miRNAs के अध्ययन तकनीकी चुनौतियों जैसे कम सेल संख्या जल्दी भ्रूण में मौजूद द्वारा सीमित किया गया है ।
MiRNAs को प्रारंभिक माउस विकास9मॉडल के लिए विभेदन के विभिन्न चरणों में भ्रूणीय निकायों का उपयोग करके सेल लाइनों से विट्रो में प्रोफाइल किया गया है। प्रारंभिक स्तनधारी विकास के दौरान वीवो में छोटे आरएनए की जांच अपेक्षाकृत सीमित रही है । मियार्ना को प्रोफाइल करने के पिछले तरीकों ने पूर्वाग्रह का नेतृत्व किया है क्योंकि क्यूपीसीआर, माइक्रोएरे और उत्तरी ब्लॉट्स10जैसे तरीकों में एक विशिष्ट मिरना की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए एक ज्ञात अनुक्रम का उपयोग किया जाता है। अगली पीढ़ी अनुक्रमण और कभी आणविक उपकरणों में सुधार अब जल्दी स्तनधारी विकास और सेल भाग्य निर्णयों के लिए उनके योगदान का अध्ययन करने के लिए miRNA अभिव्यक्ति के अपेक्षाकृत निष्पक्ष विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं ।
यहां, हम बोई फसल और अनुक्रम छोटे आरएनए को बुजेजनेसिस (E9.5) की शुरुआत तक गैस्ट्रुलेशन (E7.5) में फैले शुरुआती माउस भ्रूण से तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं में व्यक्त करने के लिए एक तकनीक की रिपोर्ट करते हैं। यह तकनीक सीधी है और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए कोशिकाओं की एक न्यूनतम संख्या से छोटे आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों को तैयार करने के लिए वंश ट्रेसिंग, सेल छंटाई, और जेल आधारित आकार चयन को जोड़ती है। हम प्रारंभिक विकास के तेजी से परिवर्तन के दौरान miRNAs के एक व्यापक दृश्य प्राप्त करने के लिए 6 घंटे के समय अंतराल को हल करने के लिए भ्रूण के सख्त somite मंच मिलान के लिए महत्व पर प्रकाश डाला । इस विधि को व्यापक रूप से आनुवंशिक और विकासात्मक अध्ययनों के लिए लागू किया जा सकता है और भ्रूण के पूलिंग से बचा जाता है। हम जेल आधारित शुद्धिकरण, पुस्तकालय मात्राकरण का उपयोग करके मिरना संवर्धन जैसी वर्तमान तरीकों की चुनौतियों से उबरने के तरीके का वर्णन करते हैं, और पीसीआर से शुरू किए गए पूर्वाग्रह को कम करते हैं। इस विधि का उपयोग समय के साथ मिरना अभिव्यक्ति पैटर्न की पहचान करने के लिए किया गया है ताकि यह अध्ययन किया जा सके कि मिरनास माउस भ्रूण के तंत्रिका क्रेस्ट वंश में विकासात्मक समय को कैसे नियंत्रित करता है।
Protocol
सभी अनुसंधान और पशु देखभाल प्रक्रियाओं को बायलोर कॉलेज ऑफ मेडिसिन इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी द्वारा मंजूरी दी गई थी और बायलोर कॉलेज ऑफ मेडिसिन में प्रयोगशाला पशु देखभाल-अनुमोदित पशु सुविधा के मूल्यांकन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन में रखे गए थे । C57BL6 पृष्ठभूमि पर सभी उपभेदों को बनाए रखा गया था।
1. भ्रूण विच्छेदन (E7.5-E9.5)
- एक गर्भवती मादा माउस से गर्भाशय सींग निकालें, पेट को 70% इथेनॉल के साथ स्टरलाइज करें जहां चीरा लगाया जाना है।
- फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ कुल्ला करके गर्भाशय को साफ करें। गर्भाशय को बाँझ प्लास्टिक 10 सेमी डिश में रखें।
- माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके, प्रत्येक डिकिडुआ युक्त क्षेत्र को एक दूसरे से अलग करें। गर्भाशय की मांसपेशी को छील लें और सभी दशकुका का पर्दाफाश करें। एक-एक करके प्रत्येक भ्रूण से डिमीगुआ निकालें।
- प्रत्येक भ्रूण से जर्दी थैली निकालें और जीनोटाइपिंग के लिए बचाएं।
- इमेजिंग के लिए ताजा PBS की एक नई डिश में सभी भ्रूण ले जाएँ।
- पूरे कूड़े की एक छवि ले लो। प्रत्येक भ्रूण को व्यक्तिगत रूप से छवि करें और प्रत्येक भ्रूण के सोमाइट्स की संख्या गिनें। प्रयोगों के बीच आवर्धन और एक्सपोजर (फ्लोरेसेंस के लिए) समान रखें।
नोट: हम पाते हैं कि फ्लोरेसेंस के लिए 50-200 एमएस एक्सपोजर पर्याप्त है और उज्ज्वल क्षेत्र की स्थापना के लिए 20 एमएस पर्याप्त है।
2. भ्रूण वियोजन और कोशिका छंटाई
- प्रत्येक भ्रूण से हल करने के लिए, निम्नलिखित करें।
- E8.0 से पुराने भ्रूण के लिएोटिक प्लेटकोड के ठीक ऊपर decapitate (यदि केवल कपाल क्षेत्र की कोशिकाओं लेबल वांछित हैं)। E7.5 भ्रूण के लिए, एक्स्ट्राब्रूनिक संरचनाओं को हटा दें (यदि केवल भ्रूण उचित वांछित है)।
- पीबीएस की न्यूनतम मात्रा में सिर को 48-अच्छी प्लेट के साफ कुएं में ले जाएं। पापिन के 250 μL जोड़ें (27 यू/ एक p200 का उपयोग करके धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें।
- माइक्रोस्कोप के नीचे की जांच करें और झुरमुट और एकल कोशिकाओं की तलाश करें।
- एक एकल सेल निलंबन प्राप्त होने तक कोमल पिपटिंग को दोहराएं (आमतौर पर तीन राउंड ऊपर और नीचे जो E7.5-E9.5 के लिए 30 s से 1 मिनट के बीच समानता चाहिए)।
- भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 250 μL के साथ बुझाने।
- प्रत्येक भ्रूण को हल करने के लिए 2.1.1-2.1.5 चरणों को दोहराएं।
- झुरमुट को हटाने के लिए 35 माइक्रोन नायलॉन जाल फिल्टर कैप ट्यूब के माध्यम से सेल निलंबन के 500 माइक्रोन फ़िल्टर करें।
- फिलट्रेट लें और नई 1.5 एमएल ट्यूब पर जाएं और 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर स्पिन करें। सुपरनेट को ध्यान से निकालें और नई ट्यूब में स्थानांतरित करें (जब तक जीवित कोशिकाओं को गोली में नहीं जाना जाता है तब तक बचाएं)।
- 0.5-1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन युक्त पीबीएस के 300 माइक्रोन में सेल पेलेट को फिर से रखना और छंटाई तक बर्फ पर रखें (अब और छंटाई के अंत के बीच के समय को कम करें)।
- यदि वांछित है, तो सेल निलंबन के 10 माइक्रोन लें और ट्राइपैन ब्लू (0.4%) और एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके गिनती करें ताकि अनुमानित कोशिका मात्राकरण और व्यवहार्यता की पहचान की जा सके क्योंकि ट्राइपैन ब्लू केवल मृत कोशिकाओं को दाग देता है।
- छंटाई से ठीक पहले, प्रत्येक नमूने को फिर से फ़िल्टर कैप ट्यूब के माध्यम से फ़िल्टर करें और लाइव कोशिकाओं के लिए डीएपीआई दाग जोड़ें।
- प्रत्येक नमूने को 70 माइक्रोन नोजल के साथ सेल सॉर्टर पर आरएनए निष्कर्षण लाइसिस समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) के 500 माइक्रोन में क्रमबद्ध करें।
- मिश्रण और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जब तक सभी नमूनों काटा जाता है। इस बिंदु से तभी आगे बढ़ें जब किसी प्रयोग के लिए आवश्यक सभी नमूनों को पुस्तकालय की तैयारी के दौर के बीच तकनीकी भिन्नता को कम करने के लिए काटा जाता है।
3. आरएनए निष्कर्षण
नोट: प्रोटोकॉल आरएनए आइसोलेशन किट से अनुकूलित है; सामग्री की तालिका देखें।
- कुल मात्रा 1000 माइक्रोन बनाने के लिए प्रत्येक नमूने में आरएनए निष्कर्षण लाइसिस समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) के 500μL जोड़ें।
- कमरे के तापमान पर प्रत्येक नमूना गल।
- भंवर प्रत्येक नमूना 1.5 मिनट के लिए, सुनिश्चित करें कि टोपी समरूपता शुरू करने से पहले प्रत्येक ट्यूब पर सुरक्षित रूप से है। कमरे के तापमान (15-25 डिग्री सेल्सियस) पर समरूप को 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- क्लोरोफॉर्म के 140 माइक्रोन जोड़ें, सुरक्षित रूप से कैप ट्यूब और 15 एस के लिए सख्ती से हिलाएं। 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x ग्राम पर 15 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। ऊपरी जलीय चरण को बर्फ पर एक नए संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें। किसी भी इंटरफेज या किसी भी कार्बनिक चरण को स्थानांतरित न करें। गुलाबी कार्बनिक चरण के पास आते समय, ट्यूब को साइड में टिप करें और छोटे एलिकोट्स को हटा दें जब तक कि कोई स्पष्ट जलीय चरण एकत्र नहीं किया जा सकता है।
- अगले चरण में सही गणना के लिए प्रत्येक नमूने से एकत्र जलीय चरण युक्त आरएनए की मात्रा को मापें।
- 1.5 वॉल्यूम जोड़ें (आमतौर पर 525 माइक्रोन लेकिन थोड़ा कम या ज्यादा हो सकता है) 100% इथेनॉल का और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
- 2 एमएल संग्रह ट्यूब में कॉलम में किसी भी तेज़ी सहित 700 माइक्रोन नमूना तक पिपेट। कमरे के तापमान पर 15 एस के लिए ≥8,000 x g पर ढक्कन और अपकेंद्रित्र बंद करें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
- नमूने के शेष का उपयोग करके चरण 3.8 दोहराएं।
- निर्माता निर्देशों के अनुसार कॉलम धोएं। 1 मिनट के लिए पूरी गति से कताई करके कॉलम को सुखा लें। कॉलम को एक नए 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
- झिल्ली के केंद्र पर नाभिक मुक्त पानी के पिपेट 11 माइक्रोन। 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने दें। कॉलम को बंद करने के लिए 1 मिनट के लिए अधिकतम गति स्पिन करें।
- एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और एक समानांतर केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण(सामग्री की तालिका) काउपयोग करके आरएनए एकाग्रता को मापें।
4. पुस्तकालय की तैयारी
नोट: प्रोटोकॉल छोटे आरएनए पुस्तकालय तैयारी किट पुस्तिका से अनुकूलित है; सामग्री की टेबलदेखें .
- 3 ' एडाप्टर के 1/4 कमजोर पड़ने का उपयोग कर छोटे आरएनए पुस्तकालय तैयारी किट पुस्तिका में कहा गया है के रूप में denaturation और 3 ' एडाप्टर बंधन को पूरा करें ।
- अतिरिक्त 3 'एडाप्टर हटाने के लिए जारी रखें।
- एडाप्टर कमी को पूरा करें जैसा कि छोटे आरएनए पुस्तकालय तैयारी किट हैंडबुक में कहा गया है। मनका सफाई के लिए ताजा तैयार 80% इथेनॉल का उपयोग करना सुनिश्चित करें और सभी अतिरिक्त इथेनॉल को मोतियों को अधिक सुखाने के बिना नाभिक मुक्त पानी में पुनर्प्राप्ति से ठीक पहले हटा दिया जाता है (मनका गोली का टूटना अधिक सूखने पर मनाया जाता है)।
- अतिरिक्त एडाप्टर निष्क्रियता के लिए सीधे आगे बढ़ें।
- अतिरिक्त एडाप्टर निष्क्रियता को पूरा करें जैसा कि छोटे आरएनए पुस्तकालय तैयारी किट हैंडबुक में कहा गया है कि बर्फ पर सभी अभिकर् चर को कोडांतरण करें।
- 5 ' 4N एडाप्टर लिगेशन जारी रखें ।
- 5 ' एडाप्टर ligation पूरा के रूप में छोटे आरएनए पुस्तकालय तैयारी किट पुस्तिका में कहा गया है कि 5 ' एडाप्टर के एक 1/4 कमजोर पड़ने का उपयोग करें और बर्फ पर सभी अभिकर्दे कोडांतरण सुनिश्चित किया जा रहा है ।
- ट्रांसक्रिप्शन रिवर्स करने के लिए आगे बढ़ें।
- पूर्ण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पहले स्ट्रैंड संश्लेषण जैसा कि छोटे आरएनए पुस्तकालय तैयारी किट हैंडबुक में कहा गया है और बर्फ पर सभी अभिकर् थों को इकट्ठा करने और एंजाइम को समय की विस्तारित अवधि के लिए फ्रीजर से बाहर नहीं रखने का ख्याल रखना।
नोट: इस बिंदु पर, प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है, नमूनों के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। वैकल्पिक रूप से पीसीआर प्रवर्धन जारी रखें। - छोटे आरएनए पुस्तकालय तैयार किट हैंडबुक में कहा गया है और पीसीआर चक्र की संख्या को कम करने के रूप में अभिकर्मकों को कोडांतरण करके पीसीआर प्रवर्धन पूरा करें। पीसीआर चक्रों की संख्या प्रत्येक आवेदन के लिए प्रायोगिक रूप से निर्धारित की जानी चाहिए और चक्रों की न्यूनतम संख्या का उपयोग किया जाना चाहिए। यहां हमने अपने छोटे आरएनए पुस्तकालयों को सफलतापूर्वक बढ़ाने के लिए 16 चक्रों का उपयोग किया।
- आकार चयन के लिए सीधे आगे बढ़ें।
5. आकार चयन
- प्रत्येक नमूने में, मिश्रण करने के लिए 6x जेल लोडिंग डाई और पिपेट के 5 माइक्रोल जोड़ें।
- जेल के पहले कुएं में सीढ़ी के 10 माइक्रोन लोड करें, जिससे कुएं को तुरंत सही खाली कर दिया जाए। स्टेप 5.1 से सभी उत्पाद को 6% ट्रिस/बोरेट/एथिलेंडियामाइनेट्रेसेटिक एसिड पर लोड करें - पॉलीएक्रीलामाइड जेल (एफबीई-पेज) और प्रत्येक नमूने के बीच में 1 लेन छोड़ दें।
नोट: कंटेनर रखें कि जेल बाद के चरणों के लिए आया था। - 0.5x TBE रनिंग बफर में लगभग 30-40 मिनट के लिए 150 वी पर जेल चलाएं (जब तक कि निचले डाई बैंड जेल के नीचे, 0.5-1 सेमी के पास न हो जाएं)।
- जेल चलने के दौरान धुंधला समाधान के 1 एल बनाओ: SYBR गोल्ड 0.5x टीबीई में 1:10,000 पतला ।
- जब जेल चल रहा है (यानी, कम डाई बैंड जेल के नीचे के पास है), ध्यान से ग्लास प्लेटों से जेल को हटा दें, जेल के अभिविन्यास को ध्यान में रखते हुए।
- अपनी मूल पैकेजिंग की ट्रे में जेल रखें। 0.5x TBE निकालें और चरण 5.5 से धुंधला समाधान के साथ बदलें। 15 मिनट के लिए दाग जेल। धुंधला समय बढ़ाने की आवश्यकता हो सकती है।
- जेल को एक यूवी ट्रांसिल्यूमिनेटर पर रखें, जेल को चीर न देने और ऊपर नोट किए गए अभिविन्यास को बनाए रखने के लिए ध्यान रखें (सीढ़ी के बैंड को स्पष्ट रूप से नहीं देखा जा सकता है तो अतिरिक्त समय के लिए फिर से दाग)।
- छवि जेल एक बार धुंधला एक कैमरे के साथ यूवी ट्रांसल्यूमिनेटर पर पूरा हो गया है ।
- यदि बेहतर छवि की आवश्यकता है, तो सबसे पहले यूवी ट्रांसिल्यूमिनेटर पर बैंड को काटने से पहले जेल की छवि को कैप्चर करने के लिए यूवी ट्रांसिल्यूमिनेटर के अलावा एक इमेजिंग उपकरण का उपयोग करें क्योंकि यूवी ट्रांसिल्यूमिनेटर पर सीधे इमेजिंग पृष्ठभूमि के चर रंग का कारण बनता है जैसा कि चित्र 3ए-बीमें दिखाया गया है। जेल को भी कई बार न ले जाएं क्योंकि यह नाजुक है और आंसू आ सकता है।
- एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग करके ~ 150 बीपी बैंड को पहचानें और हटा दें और साफ 1.5 एमएल ट्यूब में रखें। ~ 130 बीपी बैंड (एडाप्टर डिमर उत्पाद) को न काटें।
- प्रलेखन उद्देश्यों के लिए पुस्तकालय उत्पाद युक्त स्लाइस को हटाने के बाद जेल को फिर से छवि करें।
- प्रत्येक ट्यूब के नीचे स्लाइस इकट्ठा करने के लिए 30 एस के लिए अधिकतम गति से जेल स्लाइस युक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब स्पिन करें।
- जेल के स्लाइस को सबसे छोटे बिट्स में कुचलने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए एक p200 टिप का उपयोग करें। प्रत्येक ट्यूब में प्रत्येक टिप को बाहर निकालें।
- प्रत्येक ट्यूब में, 300 μL एल्यूशन बफर जोड़ें, ट्यूब के किनारे से जेल बिट्स धोने और p200 टिप को फिर से संलग्न करने और प्रत्येक नमूने के लिए टिप को धोने का ख्याल रखना।
- एल्यूटिंग नमूनों को एक झटकों वाले इनक्यूबेटर सेट में 25 डिग्री सेल्सियस तक रखें। 1000 आरपीएम मिलाते हुए रात भर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेटर से ट्यूब निकालें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अधिकतम गति से स्पिन।
- पुस्तकालय उत्पाद वाले सुपरनेट को 2 एमएल आरएनएसई फ्री 96 वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। किसी भी जेल को स्थानांतरित न करने का ध्यान रखें।
- प्रत्येक नमूने में 50 μL सफाई मोती जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिलाएं। तुरंत, आइसोप्रोपेनॉल के 350 माइक्रोन जोड़ें और पिपटिंग द्वारा मिलाएं। कमाल के साथ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
- पल्स स्पिन प्लेट को पैलेट मोतियों से और फिर 2 मिनट के लिए चुंबकीय करें। सुपरनेट को ध्यान से हटा दें और त्यागें।
- 80% इथेनॉल के 950 माइक्रोन जोड़ें। 30 एस के लिए इनक्यूबेट । सभी सुपरनेट को हटा दें। कुल दो इथेनॉल वॉश के लिए दोहराएं।
- 3 मिनट के लिए नमूना सूखी। इस कदम पर किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने का ख्याल रखते हैं जो प्रत्येक कुएं के तल पर एकत्र होता है (एक से अधिक बार नहीं) और मोतियों को अधिक सूखने के लिए (अधिक सुखाने के परिणामस्वरूप मनका गोली का टूटना होगा)।
- कुएं के तल पर सभी अवशिष्ट तरल निकालें। प्लेट को मैग्नेटिक स्टैंड से हटा दें।
- पुनः 13 माइक्रोन में गोली को फिर से खर्च करें। सजातीय होने तक पिपेट द्वारा मिलाएं। 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट और फिर 3 मिनट के लिए चुंबकीय।
- बाद के भंडारण के लिए एक साफ ट्यूब या साफ प्लेट के कुएं में सुपरनेट के 12 माइक्रोन स्थानांतरित करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस लंबी अवधि में सभी नमूनों को स्टोर करें।
- केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस उच्च संवेदनशीलता डीएनए परख का उपयोग करके प्रत्येक पुस्तकालय में मौजूद टुकड़ों के आकार और एकाग्रता की जांच करें। एक से अधिक विधि से एकाग्रता की पुष्टि करें।
नोट: हमने कभी-कभी केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस को ओवरलोड करने से बचने के लिए मानक संवेदनशीलता किट का उपयोग किया है।
Representative Results
यहां प्रदर्शित प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हमने E7.5, E8.5 और E9.5 पर भ्रूण काटा है। सभी भ्रूणों से एक्सपेरिमेंटल संरचनाओं को हटा दिया गया और फिर भ्रूण को 6 घंटे के समय अंतराल(चित्रा 1-1B)को हल करने के लिए सोमाइट का मंचन कियागया। समानता के आधार पर समूह के नमूनों के लिए सिद्धांत घटक विश्लेषण का उपयोग करना, हम पाते हैं कि नमूने उम्र के अनुसार क्लस्टर, भ्रूणीय उम्र के परिणामस्वरूप भिन्नता को उजागर करते हैं और जैविक प्रतिकृति(चित्रा 1C)के लिए सावधान सोमिट मिलान की आवश्यकता होती है। हमने E7.5 पर pluripotent एपीब्लास्ट को प्रोफाइल किया, वंश ने E8.5 पर WNT1-Cre का उपयोग करके प्रीमिगेटरी और प्रवासी तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं का पता लगाया और प्रवासी तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं को E9.5(चित्रा 1D)पर Sox10-Cre का उपयोग करके। यहां हम विशेष रूप से नीलक प्लेट के ठीक ऊपर भ्रूण को काटना द्वारा कपाल तंत्रिका शिखा फसल । दो क्रे-ड्राइवरों (Wnt1 और Sox10) की तुलना जो अक्सर तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं को लेबल करने के लिए उपयोग की जाती हैं, वे शुरुआती माउस भ्रूण(चित्रा 1E)में विभिन्न आबादी को चिह्नित करते हैं। गेटिंग रणनीतियों का उपयोग लाइव सिंगल आरएफपी सकारात्मक कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए किया गया था जिन्हें सीधे आरएनए निष्कर्षण लाइसिस समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) में क्रमबद्ध किया गया था और -80 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 1F)पर संग्रहीत किया गया था। प्रत्येक नमूने से कितनी कोशिकाओं को काटा गया था, इसका ट्रैक रखना महत्वपूर्ण है।
आरएनए आइसोलेशन आरएनए किट प्रोटोकॉल के संशोधित संस्करण का उपयोग करके किया गया था। विशेष रूप से, हम मिनी आरएनए कॉलम का उपयोग करते हैं जिन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना है। ये कॉलम नमूनों से आरएनए की उच्चतम संभव एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एक छोटी मात्रा (11 माइक्रोन) में eluting के लिए उपयोगी हैं, जहां सेल इनपुट सीमित है। इसी कारण से, फिनॉल क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के बाद सभी जलीय चरण प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। धीमी गति से पाइपिंग और एक तरफ ट्यूब झुकाव जबकि इकट्ठा उपज को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस प्रक्रिया में, हम नमक/प्रोटीन संदूषण के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए, और एकाग्रता(चित्रा 2)को मापने के लिए एक केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस दोनों का उपयोग करके आरएनए की मात्रा निर्धारित करते हैं। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर ट्रेस से पता चलता है कि आरएनए को कोई दूषित प्रोटीन नहीं था लेकिन इसमें नमक की उच्च मात्रा(चित्रा 2ए-2B)है । आदर्श रूप से 260/280 अनुपात ~1.8 होना चाहिए और 260/230 अनुपात >2.0 होना चाहिए। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा मापा गया कुल आरएनए यील्ड E8.5-E9.5 के बीच उम्र के साथ नहीं बढ़ा। यह स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के संकल्प के कारण है जो हम कटाई कर रहे कोशिकाओं की संख्या से आरएनए एकाग्रता में परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं है, और हम केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस(चित्रा 2C)से प्राप्त एकाग्रता जानकारी का उपयोग करने की सलाह देते हैं। केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस ट्रेस का उपयोग आरएनए टुकड़ों की एकाग्रता और आकार का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। चोटियां और एलटी;1000 न्यूक्लियोटाइड गिरावट के संकेत हैं। प्रतिनिधि ट्रेस आरएनए के अनुरूप है जो अपमानित नहीं है। 2000 न्यूक्लियोटाइड और 5100 न्यूक्लियोटाइड में चोटियां क्रमशः 18s और 28s आरएनए हैं। छोटा आरएनए क्षेत्र ~ 150 न्यूक्लियोटाइड्स(चित्रा 2डी)पर स्थित है।
सामग्री की तालिका में वर्णित छोटे आरएनए पुस्तकालय तैयारी किट का उपयोग करके छोटे आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयोंको प्रस्तुत किया गया था। यहां हम प्रत्येक नमूने से प्राप्त आरएनए के आधे से भी कम का उपयोग करते हैं (11 माइक्रोन एल्यूशन के 4 माइक्रोन, ~ 80-120 एनजी) जो आरएनए-अनुक्रमण पुस्तकालयों को प्रत्येक नमूने से शेष आरएनए से संश्लेषित करने में सक्षम बनाता है। यहां हम मौजूद एडाप्टर डिमीटर की मात्रा को कम करने के लिए 3 ' और 5 ' छोटे आरएनए एडाप्टर 1/4 को कमजोर करते हैं और सुझाव देते हैं कि एडाप्टर लिगेशन, क्लीनअप और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन स्टेप्स को निरंतर तरीके से जितना संभव हो उतना पूरा किया जाता है । हमने पुस्तकालयों को बढ़ाने के लिए 16 पीसीआर चक्रों का उपयोग किया है और सुझाव दिया है कि किसी भी प्रयोग के लिए पीसीआर चक्रों की न्यूनतम संख्या अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जाए । अतिरिक्त पीसीआर चक्र को पूरा करके, एक कृत्रिम रूप से एक नीच व्यक्त miRNA की पढ़ें गिनती बढ़ सकता है ।
आकार चयन miRNAs के पुस्तकालयों के लिए समृद्ध करने के लिए जरूरी है और एडाप्टर dimers नहीं है, जो आम तौर पर मौजूद हैं । लाइब्रेरी प्रोडक्ट का साइज (150 बीपी) और एडाप्टर डिमर्स (130 बीपी) आकार में बहुत समान हैं। जेल निष्कर्षण का उपयोग एडाप्टर डिमीटर(चित्रा 3)से दूर छोटे आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों को अलग करने के लिए किया जाता है। एक्सिशन से पहले पेज जेल की एक छवि से पता चलता है कि प्रत्येक नमूने(चित्र 3 ए)में उत्पाद आकारों की एक भीड़ मौजूद है। किसी भी दो नमूनों या जेल पर लोड की जाने वाली सीढ़ी के बीच एक लेन को खुला छोड़ना महत्वपूर्ण है। जेल के तल पर माइग्रेशन फ्रंट थोड़ा घुमावदार है जो यह दर्शाता है कि धीमी गति से चलना आवश्यक हो सकता है यदि 150 बीपी बैंड सभी नमूनों के लिए अंतर करना मुश्किल है। इस प्रतिनिधि छवि को भी सकारात्मक नियंत्रण आरएनए (एक चूहे के मस्तिष्क से कुल आरएनए) है कि पुस्तकालय प्रस्तुत करने में चला गया है कि जो प्रत्येक भ्रूण के नमूने में चला गया की उच्च एकाग्रता से १५० बीपी उत्पाद की एक बहुतायत से पता चलता है । नकारात्मक नियंत्रण से पता चलता है कि अभिकर्षक नाभिक एसिड प्रजातियों(चित्रा 3A)को दूषित करने से मुक्त थे । 150 बीपी बैंड का एक्सिशन एक साफ रेजर ब्लेड से किया जाना चाहिए और एकत्र किए गए क्षेत्र को चित्र 3 बीमें दिखाया गया है। आकार चयन से पहले और बाद में केशिलरी इलेक्ट्रोफोरेसिस निशान जेल शुद्धिकरण(चित्रा 3सी-3 डी)के साथ 150 बीपी पुस्तकालय उत्पाद की शुद्धता में नाटकीय सुधार दिखाते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि चित्रा 3सी-3 डी में निशान में मार्कर की तुलना में नमूना चोटियां अधिक हैं, जो ओवरलोडिंग का संकेत है। इन मामलों में, टुकड़ों का आकार सटीक हो सकता है, हालांकि एकाग्रता नहीं हो सकती है। मार्कर की सीमा में पुस्तकालयों को कमजोर करके या वैकल्पिक तरीकों का उपयोग करके क्वांटिफिकेशन प्राप्त किया जा सकता है। हम पुस्तकालय मात्राकरण के वैकल्पिक तरीकों में कुछ भिन्नता पाते हैं और अनुशंसा करते हैं कि परिमाणीकरण के कई तरीकों का अनुभवजन्य परीक्षण किया जाए। एक समय में अनुक्रमित किए जाने वाले नमूनों की संख्या को अधिकतम करते समय एकाग्रता का सटीक मात्राकरण आवश्यक है। पुस्तकालयों अनुक्रमण के लिए 1.3 पीए नीचे पतला किया जाएगा और आम तौर पर कहीं भी 15-25 नमूनों से एक समय में अनुक्रम किया जा सकता है एक 150 चक्र अनुक्रमण किट है कि प्रदान करता है ~ 140 मिलियन पढ़ता है. इसके परिणामस्वरूप प्रति नमूना लगभग 5 मिलियन पढ़ता है। आम तौर पर मानचित्रण दरें 60-80% के बीच होती हैं।
चित्रा 1: छोटे आरएनए अनुक्रमण के लिए माउस भ्रूण से कोशिकाओं की कटाई। (A)E8.5 माउस भ्रूण जर्दी थैली और somites के हटाने को उजागर करने के लिए भ्रूण के चरण का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया(बी)माउस भ्रूण के Somite मचान तंत्रिका क्रेस्ट विकास के चरणों पर कब्जा करने के लिए(सी)पुस्तकालयों के सिद्धांत घटक विश्लेषण छंटित वाइल्डटाइप तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं से prepped दिखा रहा है कि उंर से नमूने समूह(डी)योजनाबद्ध दिखा कैसे नमूनों Wnt1-क्रे का उपयोग कर काटा गया E8.5 पर लेबल और प्रवासी तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं और Sox10-Cre E9.5 पर केवल प्रवासी तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं लेबल(ई)पुस्तकालयों के सिद्धांत घटक विश्लेषण छंटाई जंगलीटाइप तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं से एक साथ समूह दिखा क्रे चालक द्वारा एक साथ समूह दिखा उम्र की परवाह किए बिना(एफ)गेटिंग रणनीति E8.5 और E9.5 भ्रूण से RFP + तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: E7.5-E9.5 माउस भ्रूण से आरएनए अलगाव । (A)भ्रूण के सबसे कम उम्र के चरण से आरएनए अलगाव का प्रतिनिधि स्पेक्ट्रोफोटोमीटर ट्रेस है कि हमने यह प्रोटोकॉल लागू किया है । (ख)स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से प्राप्त आरएनए गुणवत्ता के प्रतिनिधि मूल्यों को दिखाने वाली तालिका । (ग)आरएनए का उदाहरण प्रत्येक उम्र के भ्रूण से सॉर्ट किए गए तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं से काटा गया(D)केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस अच्छी गुणवत्ता वाले आरएनए को दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: आकार चयन से पहले और बाद में मिरना पुस्तकालय। (A)TBE-PAGE जेल चार नमूनों के लिए प्रतिनिधि छोटे आरएनए पुस्तकालयों दिखा रहा है और पहले नियंत्रण और(बी)१५० बीपी बैंड उत्तेजना के बाद । तीर 150 बीपी बैंड का प्रतिनिधित्व करते हैं जो आकार चयन के बाद छोटे आरएनए पुस्तकालय के(सी)केशिलरी इलेक्ट्रोफोरेसिस ट्रेसकियाजाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
विकासात्मक प्रक्रियाएं तेजी से आगे बढ़ सकती हैं, और कोशिकाएं कई अनुक्रमिक विनिर्देशों से गुजर रही हैं जैसे कि प्रारंभिक भाग्य निर्णयों में योगदान देने वाले मिरनास के व्यापक दृष्टिकोण को पकड़ने के लिए, व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले आधे दिन की वेतन वृद्धि की तुलना में अधिक विशिष्ट मंचन की आवश्यकता है। हाल ही में हुए एक अध्ययन में थेलर स्टेज 12 भ्रूणों से आरएनए अनुक्रमण किया गया है जो 3 से 6 सोमाइट्स11तक है । हम पाते हैं कि इस अवधि के दौरान, तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं को निर्दिष्ट किया जाता है (उम्र के 3 सोमेट्स), डेलामिनेट (उम्र के 4 सोमाइट्स), और माइग्रेट (उम्र के 5-6 सोमाइट्स)। हम यह भी पाते है कि क्रे-ड्राइवर के अलावा वंश का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया सेल आबादी, उंर जैविक नमूनों के बीच भिन्नता का सबसे बड़ा स्रोत है, और केवल somite मिलान भ्रूण प्रतिकृति के रूप में माना जाना चाहिए । ट्रांसजेनिक भ्रूण की तुलना वाइल्डटाइप कंट्रोल से करते समय इस पर भी ध्यान दिया जाना चाहिए ।
प्रारंभिक विकास के दौरान मीनएनए को प्रोफाइल करने के पिछले तरीकों ने छोटे आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालय तैयार करने के लिए आरएनए इनपुट के 10-100 एनजी के बीच उपयोग किया है और एक नमूना13,,14में कई भ्रूणों को एकत्र किया है। हम एक ही E7.5 भ्रूण से या E8.5 और E9.5 पर सॉर्ट तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं से इनपुट के रूप में कुल आरएनए के लगभग १०० एनजी का उपयोग कर आरएनए अलगाव और पुस्तकालय की तैयारी का प्रदर्शन करते हैं । जब छंटाई के लिए भ्रूण अलग, एक माइक्रोस्कोप के तहत वियोजन देखने के लिए और प्रतिक्रिया बुझाने के लिए निरीक्षण जब एकल कोशिकाओं को प्राप्त कर रहे है ध्यान रखना चाहिए । हम पाते हैं कि E8.5-E9.5 भ्रूण के कपाल क्षेत्र का वियोजन प्रोटोकॉल में वर्णित कोमल मैनुअल पिपटिंग के साथ लगभग तुरंत है। बड़े ऊतकों और तेजी से पुराने भ्रूण के लिए, वियोजन समय भ्रूण के हिस्से के आधार पर अब हो सकता है अलग किया जा रहा है । E7.5-E9.5 भ्रूण के लिए, कोशिकाओं के झुरमुट माइक्रोस्कोप के नीचे आसानी से दिखाई दे रहे हैं और वियोजन तब तक जारी रहना चाहिए जब तक कि कोई और झुरमुट दिखाई न दे। यदि आप 5-10x से कहीं भी समाधान के माध्यम से ध्यान केंद्रित करते हैं तो एकल कोशिकाएं समाधान में दिखाई देती हैं। पिछले तरीकों कोशिकाओं की एक कम संख्या से थोक आरएनए प्रस्तुत करने के लिए आरएनए अनुक्रमण के लिए सीधे लाइसिस बफर में कोशिकाओंतरह 14। यहां हम सीधे आरएनए निष्कर्षण लाइसिस समाधान में सॉर्ट करते हैं ताकि आरएनए को पुस्तकालय की तैयारी शुरू होने से पहले अलग किया जा सके। 11 माइक्रोन एल्यूशन वॉल्यूम के साथ मिनी कॉलम का उपयोग उच्च पर्याप्त आरएनए एकाग्रता के लिए अनुमति देता है ताकि एक भी आरएनए प्रेप को छोटे आरएनए और बल्क आरएनए अनुक्रमण के बीच विभाजित किया जा सके।
सबसे छोटे आरएनए अनुक्रमण विधियों की एक वर्तमान सीमा परिवर्तित सीडीएनए की पीसीआर प्रवर्धन है। हमारी विधि इस सीमा को दूर नहीं करती है, लेकिन हम पीसीआर चक्रों की संख्या को 25-अधिकतम अनुशंसित से 16 चक्रों तक कम करने में सक्षम थे। प्रवर्धन में यह कमी पीसीआर द्वारा शुरू किए गए कृत्रिम प्रवर्धन पूर्वाग्रह को कम कर देती है। पूर्वाग्रह का एक अन्य स्रोत एडाप्टर का बंधन है, जहां यह ज्ञात है कि एडाप्टर और मीन्राए के सिरों पर स्थित विशिष्ट दृश्य अन्य दृश्यों की तुलना में अधिक दक्षता के साथ एक साथ लिगेट कर सकते हैं। इससे बचने के लिए, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एडाप्टर में लिगाशन प्रतिक्रियाओं में पूर्वाग्रह को रोकने के लिए प्रत्येक एडाप्टर के अंत में 4 यादृच्छिक कुर्सियां शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, एक और आम मुद्दा एडाप्टर डिमर्स की मात्रा है जो आरएनए इनपुट कम होने पर बनती है। पुस्तकालय तैयारी किट में एडाप्टर डिमर गठन को कम करने के कदम शामिल हैं जैसे एडाप्टर निष्क्रियता और प्रत्येक लिगामेंट के बाद अतिरिक्त एडाप्टर को हटाने के लिए मनका सफाई। हमने 3 ' और 5 ' 4N एडाप्टर को 1/4 से पतला कर दिया ताकि एडाप्टर डाइमर की मात्रा को कम किया जा सके । हमने पाया कि जब पतला नहीं, १३० बीपी बैंड तीव्रता यह मुश्किल एक जेल पर वांछित छोटे आरएनए पुस्तकालयों युक्त १५० बीपी बैंड से अलग करने के लिए बना रही है ।
अनुक्रमण पुस्तकालयों को तैयार करने की एक और वर्तमान चुनौती अनुक्रमण से पहले उत्पाद का सटीक मात्राकरण है। हमने पाया है कि विभिन्न तरीकों से एक ही पुस्तकालय पर अलग-अलग परिणाम मिलते हैं। हमारा सुझाव है कि शोधकर्ता एकाग्रता का सटीक अनुमान प्राप्त करने के लिए परिमाणीकरण के कई तरीकों का उपयोग करते हैं।
इस प्रोटोकॉल को आनुवंशिक, विकासात्मक अध्ययनों या अन्य अनुप्रयोगों पर व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है जहां आरएनए को कम संख्या में कोशिकाओं से काटा जा रहा है। यह दृष्टिकोण भ्रूण के पूलिंग से बचने के द्वारा लौकिक अध्ययन को सरल बनाता है और आसानी से गैर-सॉर्ट और सॉर्ट कोशिकाओं दोनों पर लागू किया जा सकता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस परियोजना को एंड्रयू मैकडोनोफ बी + फाउंडेशन और एनआईएच (R01-HD099252, R01-HD098131 द्वारा समर्थित किया गया था। आर.जेपी कैंसर रिसर्च (RR150106) में एक CPRIT विद्वान और कैंसर अनुसंधान (वी फाउंडेशन) में वी विद्वान है। लेखक इस परियोजना के लिए आवश्यक उपकरण उपलब्ध कराने के लिए बीसीएम में साइटोमेट्री और सेल सॉर्टिंग कोर को भी स्वीकार करना चाहेंगे।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
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