Summary
Här beskriver vi en enkel, billig och snabb clearing metod för att lösa 3D-strukturen för både mus och mänskliga vita fettvävnad med hjälp av en kombination av markörer för att visualisera vasculature, kärnor, immunceller, nervceller och lipid-droplet coat proteiner genom fluorescerande imaging.
Abstract
Fetma är en stor världsomspännande folkhälsofråga som ökar risken för att utveckla hjärt-kärlsjukdomar, typ-2 diabetes, och leversjukdomar. Fetma kännetecknas av en ökning av fettvävnad (AT) massa på grund av adipocyte hyperplasi och/eller hypertrophia, vilket leder till djupgående remodeling av dess tredimensionella struktur. Faktum är att maximal kapacitet AT att expandera under fetma är avgörande för utvecklingen av fetma-associerade patologier. Detta AT expansion är en viktig homeostatisk mekanism för att möjliggöra anpassning till ett överskott av energiintag och för att undvika skadliga lipid spillover till andra metaboliska organ, såsom muskler och lever. Därför är förståelsen av den strukturella ombyggnad som leder till misslyckandet med AT-expansion en grundläggande fråga med hög klinisk tillämplighet. I den här artikeln beskriver vi en enkel och snabb clearing metod som rutinmässigt används i vårt laboratorium för att utforska morfologi av mus och mänskliga vita fettvävnad genom fluorescerande avbildning. Denna optimerade AT-clearingmetod utförs enkelt i alla vanliga laboratorium som är utrustade med en kemisk huva, en temperaturkontrollerad orbitalskaktor och ett fluorescerande mikroskop. Dessutom är de kemiska föreningar som används lätt tillgängliga. Viktigt, denna metod gör det möjligt för en att lösa 3D AT struktur genom färgning olika markörer för att specifikt visualisera adipocyter, neuronala och vaskulära nätverk, och den medfödda och adaptiva immunceller distribution.
Introduction
Fetma kännetecknas av en ökning av fettvävnad massa och har blivit en stor världsomspännande folkhälsofråga, med tanke på att personer med fetma har ökad risk att utveckla hjärt-kärlsjukdom, typ-2 diabetes, leversjukdomar och vissa cancerformer.
En grundläggande fysiologisk funktion av fettvävnad är att modulera hela kroppen glukos och lipid homeostas1,2. Under utfodringsperioden lagrar adipocyterna (dvs. de viktigaste cellerna i fettvävnaden) överskottet av glukos och lipider som en måltid tillhandahåller i triglycerider. Under fasta, adipocyterna bryta ner triglycerider till icke-förestrad fettsyror och glycerol att upprätthålla energibehovet av kroppen. Under utvecklingen av fetma, fettvävnad expandera genom att öka storleken (hypertrophia) och /eller antalet (hyperplasi) av adipocyter1, för att öka deras lagringskapacitet. När utbyggnaden av fettvävnad når sin gräns, en konstant mycket varierande bland patienter, de återstående lipider ackumuleras i andra metaboliska organ inklusive muskler och lever3,4, vilket leder till deras funktionella misslyckande och initierar fetma-relaterade hjärt-metaboliska komplikationer1,5. Därför är det en viktig klinisk utmaning att identifiera de mekanismer som styr fettvävnadsexpansion.
De morfologiska modifieringarna som dokumenteras inom fettvävnader under fetma är kopplade till dess patologiska dysfunktion. Flera färgningsprocedurer har använts för att beskriva vävnadsorganisationen av fettvävnaden, inklusive aktin6, kärlmarkörer7, lipid-droplet markörer8, och specifika immun cell markörer9,10. Men på grund av den enorma diametern av adipocyter (50 till 200 μm)11, är det viktigt att analysera en stor del av hela vävnaden i tre dimensioner för att exakt analysera de dramatiska strukturella AT förändringar som observerats under fetma. Men eftersom ljuset inte penetrerar en ogenomskinlig vävnad, är bildbehandling i 3D inom en stor vävnadsprover med hjälp av fluorescensmikroskopi inte möjligt. Metoder för vävnad clearing för att göra dem transparenta har rapporterats i litteraturen (för en översyn,se 12) tillåter en att rensa vävnader och att utföra djupgående, hela vävnad fluorescens mikroskopi. Dessa metoder erbjuder oöverträffade möjligheter att bedöma 3D cellulära organisationen i friska och sjuka vävnad. Var och en av de beskrivna metoderna har fördelar och nackdelar, och behöver därför väljas noggrant beroende på den studerade vävnaden (för en genomgång, se13). Vissa tillvägagångssätt kräver faktiskt en lång inkubationstid och/eller användning av material eller föreningar som antingen är dyra, giftiga eller svåra att fåtag på 14,15,16,17,18,19. Dra nytta av en av de första föreningarna som används för ett sekel sedan av Werner Spalteholz att rensa vävnader20, vi inrätta en användarvänlig och billig protokoll som är mycket väl anpassad för röjning av alla mus och mänskliga fettvävnad depåer i alla laboratorium med typisk utrustning inklusive en kemisk huva, en temperatur-kontrollerade orbital shaker och ett konfokalt mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll testades och är validerat för alla mus och mänskliga vita fettvävnad depåer. Human- och mus-fettvävnader samlades in i enlighet med europeiska lagar och godkändes av franska och svenska Etiska kommittéer.
1. Fixering av mus och human vit fettvävnad
- Sänk ned de skördade mus- eller humanvita fettvävnaderna i minst 10 mL PBS innehållande 4% paraformaldehyd (PFA) i ett 15 mL plaströr.
- Skaka plaströret i rumstemperatur på en rullande platta i 1 h.
- Låt plaströret vara i 4 °C på en rullande platta över natten, för att slutföra fixeringen.
OBS: Detta protokoll är anpassat för stora fettvävnadsprover, såsom hela epididymal fett kuddar som erhållits från möss matas en normal kost (≈250 mg - ≈0,6 cm3). För större prover som epididymal fett kuddar som erhållits från möss matas en fettrik kost (≈1,5 g - ≈4 cm3) eller mänskliga fettvävnadsprover, även om clearingprotokollet ska fungera perfekt för hela provet (genom att skala upp PFA och antikroppsblandningarna), i allmänhet skär vi vävnadsbitar runt 1 g (≈2,5 cm3) för att reservera de återstående proverna antingen för ytterligare färgning eller applikationer. För PFA (steg 1.1.) rekommenderar vi att du använder ungefär 10 gånger vävnadens volym. För antikroppsblandningarna (steg 3.1. och 3.4.), öka volymen för att helt sänka ned vävnaden, och använd ett 15 mL plaströr (se Tabell över material) om vävnaden är för stor för en 1,5 mL plast mikrorör (se Tabell av material).
2. Permeabilization och mättnad av mus och human vit fettvävnad
- Skölj den fasta vita fettvävnaden i 10 mL PBS i 5 min vid rumstemperatur för att avlägsna alla spår av PFA.
- Sänk ned vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL PBS kompletterat med 0,3% glycin (se Tabell över material) och skaka röret vid rumstemperatur i en orbitalskakare i 1 h vid 100 varv per minut (varv/min) för att släcka de återstående fria aldehydgrupperna.
- Sänk ned vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL PBS kompletterat med 0,2% Triton X-100 (se Tabell över material) och skaka röret vid 37 °C i en temperaturstyrd orbitalskakapparat i 2 h vid 100 rpm.
- Sänk ned vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL PBS kompletterat med 0,2% Triton X-100 och 20% DMSO (se Tabell of Materials) och skaka röret vid 37 °C i en temperaturkontrollerad orbitalskakner vid 100 rpm över natten.
- Sänk ned vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL PBS kompletterat med 0,1% Tween-20 (se Tabell of Materials), 0.1% Triton X-100, 0,1 % deoxicholat (se Tabell of Materials) och 20 % DMSO och skaka röret vid 37 °C i en temperaturstyrd orbitalskaktor vid 100 rpm i minst 24 h.
- Skölj vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL PBS kompletterat med 0,2% Triton X-100 och skaka röret vid rumstemperatur i en orbitalskakapparat vid 100 rpm i 1 h.
- Sänk ned vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL PBS kompletterat med 0,2% Triton X-100, 10% DMSO och 3% BSA (se Tabell av material) och skaka röret vid 37 °C i en temperaturkontrollerad orbitalskakapparat vid 100 rpm i 12 h, för att mätta eventuella platser som skulle kunna icke specifikt binda antikroppar.
OBS: I steg 2.7 kan BSA ersättas med blodserum av arten av den sekundära antikropp som används.
3. Färgningsprocedur för mus- och humanvit fettvävnad
- Överför vävnaden i ett 1,5 mL plastmikrorör som innehåller 300 μL PBS kompletterat med 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA och de primära antikropparna (10x mer koncentrerade än för kryosektionsfärgning men optimal antikroppskoncentration bör utvärderas för varje antikropp). Skydda röret mot ljus genom att täcka med aluminiumfolie och skaka röret vid 37 °C i en temperaturstyrd omloppsshakare med 100 varv/min i minst två dagar (se anmärkningen i steg 1.1 och steg 3.7.1).
- Skölj vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL PBS kompletterat med 0,2% Triton X-100, 10% DMSO och 3% BSA och skaka röret skyddas från ljus vid 37 °C i en temperaturkontrollerad orbitalskakapparat vid 100 rpm i 5 h. Utför det här steget två gånger.
- Skölj vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL PBS kompletterat med 0,2% Triton X-100, 10% DMSO och 3% BSA och skaka röret, skyddat från ljus, vid 37 °C i en temperaturkontrollerad orbitalskakapparat vid 100 rpm under en natt till två dagar.
- Överför vävnaden till ett 1,5 mL plastmikrorör innehållande 300 μL PBS kompletterat med 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA och de sekundära antikropparna (10x mer koncentrerade än för kryosektionsfärgning). Skydda röret mot ljus genom att täcka med aluminiumfolie och skaka röret vid 37 °C i en temperaturstyrd omloppsshakare med 100 varv/min i minst två dagar (se anmärkningen i steg 1.1 och steg 3.7.1).
- Skölj vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL PBS kompletterat med 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, och 3% BSA och skaka röret, skyddat från ljus, vid 37 °C i en temperaturkontrollerad orbitalskakapparat vid 100 rpm för 5 h. Utför det här steget två gånger.
- Skölj vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL PBS kompletterat med 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, och 3% BSA och skaka röret, skyddat från ljus, vid 37 °C i en temperaturkontrollerad orbitalskakapparat vid 100 rpm under en natt till två dagar.
- Skölj vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL PBS och skaka röret, skyddat från ljus, vid 37 °C i en temperaturstyrd orbitalskakner vid 100 rpm i 2 h.
OBS: För märkning av särskilda strukturer som atomkärnor eller aktin, tillsätt 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI eller motsvarande) och/eller fluorescently märkt-phalloidin måste läggas till vid steg 3.1. när endast fluorescerande märkta primära antikroppar används, eller vid steg 3.4. när sekundära antikroppar används.
OBS: För färgningsproceduren kan primära antikroppar redan konjugerade med fluorokromer (som de som används för flödescytometri) användas och vi rekommenderar det för den lyckoenhet och specificitet. Även om mus primära antikroppar kan användas följt av sekundära anti-mus antikroppar, som vi visat det här, har vi ofta observerat icke-specifika färgning av blodkärl på grund av cirkulerande immunglobulin. Därför, för att undvika denna fråga, primära antikroppar som redan är märkta rekommenderas starkt och här vi ger bevis för att de antikroppar som används i flödescytometri är förenliga med vårt förfarande. I det specifika fallet med ett antigen som uttrycks på låga nivåer är emellertid ett signalförstärkningssteg via sekundära antikroppar obligatoriskt; när den enda tillgängliga primära antikroppen görs i mus, kan en hjärt-perfusion av mössen med PBS i minst 5 min vid offret ta bort en stor andel cirkulerande immunglobulin och därmed den icke-specifika färgningen.
4. Clearing förfarande för mus och mänskliga vita fettvävnad
- Sänk ned vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL 50% etanol och skaka röret, skyddat från ljus, vid rumstemperatur i en orbitalskaker vid 100 rpm i 2 h.
- Sänk ned vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL 70% etanol och skaka röret, skyddat från ljus, vid rumstemperatur i en orbitalskakare vid 100 rpm i 2 h.
- Sänk ned vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL 95% etanol och skaka röret, skyddat från ljus, vid rumstemperatur i en orbitalskakare vid 100 rpm i 2 h.
- Sänk ned vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL 100% etanol och skaka röret, skyddat från ljus, vid rumstemperatur i en orbitalskakare vid 100 rpm i 2 h.
- Sänk ned vävnaden i ett 15 mL plaströr som innehåller 10 mL 100% etanol och skaka röret, skyddat från ljus, vid rumstemperatur i en orbitalskakare vid 100 rpm över natten.
- Doppa ned vävnaden i en 20 mL glasflaska med en plastlock (se tabell över material) som innehåller 5 mL metylsaliylat (se Tabellöver material ) under en kemisk huva och skaka glasbehållaren, skyddad från ljus, vid rumstemperatur i en orbitalskakare vid 100 rpm i minst 2 h.
OBS: Clearingförfarandet skulle kunna påskyndas avsevärt (om det behövs) genom att man undviker steg 4.3. och 4.5., även om den slutliga clearingkvaliteten skulle minskas något.
5.3D-confocal avbildning av rensad vit fettvävnad
- Överför vävnaden till en metallisk avbildningskammare utrustad med en glasbotten (se Tabell över material) under en kemisk huva och fyll kammaren med färskt metylsalicylat.
OBS: För att säkra vävnaden på plats, och därmed för att förhindra att den flyter eller rör sig i sidled i kammaren, applicera flera 18 mm runda glaskåpor (se Tabell av material) ovanpå vävnaden när du monterar den i kammaren. - Placera bildbehandlingskammaren på ett inverterat konfokalmikroskop.
- Avbilda vävnaden med hjälp av ett mål med låg förstoring (t.ex. 4x objective) för att generera några få cm3 3D-kartor över hela fettvävnaden eller av det mänskliga vävnadsprovet.
- Välj flera områden för vävnadsprovtagningen vid högre förstoring. Typiskt, använd en 20x långdistans luft mål som ger ett bra förhållande mellan upplösning och djup. Vi förvärvar stora mosaikbilder med z-stackar mellan 600 och 2000 μm djup.
OBS: Använd en långväga målsättning för att avbilda djupare in i vävnaden.
6. Utvinning av kvantitativa resultat från 3D-fettvävnadsbilderna
OBS: Segmenteringen av de olika strukturerna och den efterföljande extraktionen av den kvantitativa informationen från 3D-bildstacken som genereras i punkt 5 kan utföras med hjälp av någon av de många befintliga alternativ bildanalys programvara, antingen kommersiella eller freeware. I följande punkter beskriver vi en strategi som rutinmässigt används i vårt laboratorium för att extrahera kvantitativ information från 3D-fettvävnadsbilder med hjälp av kommersiell programvara (se Table of Materials).
- Konvertera 3D-stackarna på programvaruformatet till fritt minnesutrymme.
- Segmentera cellerna.
- Öppna cellmodulen för programvaran.
- Ändra inställningen för cellidentifiering till plasmamembranfärgning.
- Välj fluorescerande kanal för markören som används för att avgränsa cellens periferi (phalloidin vilka etiketter när aktin eller plasma membran markörer såsom F4/80 för makrofag, TCR-β för T-celler, eller kluster av differentiering CD proteiner som är specifika för immun cell subtyper).
- Ställ in tröskelvärdena och ge ett intervall av förväntad cellstorlek (dvs. 1 till 200 μm för celldetektering).
- Kör segmenteringen. En volym som motsvarar z-stacken kommer att genereras med de segmenterade cellerna färgkodade med en annan färg för var och en av de angränsande cellerna.
- Tillämpa statistiska filter (storlek, rundhet, cirkuläritet etc.) i statistikfliken för att utesluta segmenteringsargefakter och/eller för att förfina de segmenterade cellerna till den cell av intresse som baseras på deras storlek (dvs. 20-200 μm för adipocyter; 5-25 μm för makrofager; 1-3 μm för lymfocyter).
- Extraktmätningar och kvantitativa data (volym, antal, storlek, diameter etc.) från statistikfliken.
- Segment cellulära komponenter (kärnor, vesiklar, etc.) eller fartyg som en struktur.
OBS: Även om glödtråden segmentering är mycket användbart för att studera anslutning av kärlen, använder vi ytmodulen segmentering för att extrahera data om storlek, volym och diametrar av kärlen. Kvantifieringen av fartygens storlekar går faktiskt förlorad när man använder glödtrådsmodulen.- Öppna Programvarans Surface-modul.
- Välj fluorescerande kanal för markören som används för att specifikt märka den subcellulära komponenten för att rekonstruera den i 3D.
- Ställ in tröskelvärdena och ge en räckvidd av strukturens förväntade diameterstorlek (dvs. 0,5–5 μm för kärnor; 0–100 μm för kärl, etc.).
- Kör segmenteringen. En volym med den segmenterade cellstruktur kommer att genereras. Mätningar och kvantitativa data (volym, antal, storlek, diameter etc.) kan extraheras från statistikfliken.
- Segmentera kärlen som ett rörformigt kontinuum.
OBS: Även om glödtråden segmentering är mycket användbart för att studera anslutning av kärlen, använder vi ytmodulen segmentering för att extrahera data om storlek, volym och diametrar av kärlen. Kvantifieringen av fartygens storlekar går faktiskt förlorad när man använder glödtrådsmodulen.- Öppna modulen Filaments i programvaran.
- Välj den lysrörskanal som motsvarar kärlets färgning.
- Ställ in tröskelvärdena för fluorescensintensiteten och välj lämpligt antal förväntade anslutningsnoder.
- Kör segmenteringen. Filament som representerar fartygsnätet kommer att genereras i 3D. Mätningar kan extraheras från statistikfliken, vilket gör det möjligt att få fram kvantitativa uppgifter inklusive fartygslängd, antal fartygsförgrening etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda förfarandet som beskrivs här och sammanfattas i figur 1, kunde vi fläcka och optiskt klart mänskliga och mus vit fettvävnad som presenteras i figur 2A och figur 2B, respektive. Den rensade vävnaden överfördes till metallisk bildbehandlingskammaren för att utföra konfokal avbildning (Bild 3A). Röjningen förbättrade drastiskt djupet på de vävnadsbilder som vi kunde skaffa (Figur 3B och Figur 3C). Hela fettvävnaden kan förvärvas i 3D vid låg förstoring med hjälp av en 4x målsättning (se Kompletterande Film 1), för att generera en 3D-karta, gör det möjligt att välja de olika områden som skall förvärvas vid hög förstoring med hjälp av en 20x mål (Figur 3D). Bilderna med hög förstoring förvärvas i 3D med ett djup av 2 mm (Bild 3E).
Detta förfarande möjliggör märkning av ett flertal allmänna cellmarkörer, inklusive kärnor genom att använda DAPI och aktin genom att använda fluorescentlymärkt Phalloidin. Specifik färgning av lipiddroppar och adipocyter kan uppnås genom att använda perilipinantikropp (se tabell över material; Bild 4A) och anti-Glut4-antikropp (se tabell över material; Bild 4B) Respektive. Blodkärl kan detekteras genom att använda antingen CD31-antikroppen (se tabell över material; Bild 4C) eller genom en intravenös injektion av lectin-DyLight649 strax före musoffer (se tabell över material; Bild 4D). Makrofager och T-celler kan visualiseras genom att anti-CD301-PhycoErythrin-antikroppen används (se tabell med material; Bild 4D) och anti-TCR-β-Pacific Bleu-antikroppen (se tabell över material; Bild 4E). Det perifera nervnätverket kan detekteras genom att antityrosin-hydroxyllas (TH) används (se tabell över material; Bild 4F-G). Dessutom tillåter detta protokoll röjning av mus epididymal fettvävnad (Figur 4A-B,E), mus subkutan fettvävnad (Figur 4D,G), mus brun fettvävnad ( Figur4F), och human fettvävnad (Figur 4C). Med hjälp av en kombination av dessa märkning och en kommersiell programvara (se tabell över material) för att segmentera dessa markörer, kan vi bestämma inom fettvävnaden i) adipocyter genomsnittlig storlek och storleksfördelning (Figur 5A-B) och ii) blodkärlens nätverkstäthet (Figur 5C).
Figur 1: Sammanfattning av clearingförfarandet för vit fettvävnad. Mus eller mänskliga vita fettvävnader är fasta, permeabiliserade, mättade, färgas och rensas. Bilder förvärvas sedan i 3D och analyseras med hjälp av en kommersiell programvara. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Fotografier av vit fettvävnad. (A) Fotografi av humant vitt abdominopelvic fettvävnad före och efter clearingförfarandet. (B) Fotografi av mus epididymal vit fettvävnad före och efter clearingförfarandet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Förbättrat bilddjup med fettvävnadsröjning. (A) Montering av metallisk avbildningskammaren utrustad med glasbotten. (B) Z-serien bilder av mus epididymal vit fettvävnad färgas med phalloidin-Alexa488 (grön) före och efter clearing. (C) XZ-projektioner som motsvarar de vita streckade linjerna tvärs över panelen B z-stack. (D) Z-projektion av 0,4 cm z-stapel av mus subkutan vit fettvävnad färgas för aktin med hjälp av Phalloidin-Alexa488 och förvärvas vid låg förstoring med en 4x objektiv. De små bilderna till höger förvärvades vid den valda vävnadspositionen med hjälp av ett 20x-mål. (E) Sidovy av 3D-volym återgivning av bild z-stack från rensas mus vit fettvävnad färgas med Phalloidin-Alexa488 förvärvas på liknande sätt till de 20x bilder från (D). Det 3D-bilddjup som uppnås genom vårt högförstoringsförfarande demonstreras här och understryks av en z-djupfärgskodning (mörkblå för z=0 mm till mörkrött för z=2 mm). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Vävnader för mus och humant vitt fettfärger som färgats för flera markörer. (A) Enda plan bild av mus epididymal vit fettvävnad färgas för lipiddroppar med anti-perilipin1 antikropp och anti-mus-alexa647-konjugerad antikropp. (B) Mosaik enda plan bild av mus epididymal vit fettvävnad färgas för kärnor och adipocyter med hjälp av DAPI, anti-Glut4 antikropp och anti-mus-alexa647-konjugerad antikropp. (C) Z-projektion av 600 μm z-stack av humant vitt abdominopelvic fettvävnad färgas för fartyg som använder CD31-alexa647-konjugerade antikroppar. (D) Z-projektion av 600 μm z-stapel av mus subkutan vit fettvävnad färgas för fartyg och makrofager med hjälp av lectin-DyLight649 intravenösa injektioner och anti-CD301-alexa555 antikropp. Den nedre högra infälld är en zoomad bild av den vita prickade rutan. (E) Enda plan bild av mus epididymal vit fettvävnad färgas för aktin och T-celler med hjälp av phalloidin-Alexa488 och anti-TCRβ-Pacific blå-konjugerad. Den nedre högra infälld är en zoomad bild av den vita prickade rutan. (F) Z-projektion av 50 μm z-stack av mus brun fettvävnad färgas för kärnor och neuronal nätverk med hjälp av DAPI, anti-TH antikropp och anti-kanin-alexa647-konjugerade antikropp. (G) Z-projektion av 600 μm z-stack av mus subkutan vit fettvävnad färgas för kärnor och neuronal nätverk med hjälp av DAPI, anti-TH antikropp och anti-kanin-alexa647-konjugerade antikropp. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Analys av 3D-bilder med hjälp av kommersiellt tillgänglig programvara (se tabellen över material). (A) 3D-volym återgivning av humana adipocyter segmenterade i 3D av kommersiellt tillgänglig programvara. Varje adipocyte har en annan färg till dess kontakt angränsande adipocyter. Fartyg är representerade i rött. (B) Storlekskvantifiering och fördelning av adipocyterna från 3D-volymåtergivningen av panel A, som innehåller omkring 20 000 adipocyter. (C) 3D-volymåtergivning av blodkärl som är segmenterade i 3D med användning av kommersiellt tillgänglig programvara och representerad i rött eller gult för de stora respektive små kärlen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande Film 1: 3D-volymåtergivning av hela den subkutana vita fettvävnaden som visas i figur 3D. Den vita rutan representerar en 2 cm3 kub. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De modifieringar som sker inom fettvävnaden under loppet av patologisk progression, såsom fetma, är grundläggande för förståelsen av mekanismerna bakom patologin. Banbrytande studier som avslöjade sådana mekanismer i fettvävnad har baserats på globala tillvägagångssätt såsom hela fettvävnaden proteomik21, flödescytometri22,23, och transkriptomik24,25. Dessutom har man gjort ansträngningar för att utforska de strukturella förändringar som sker i fettvävnad med hjälp av histologiska analyser26,27,28,29. Men, analysen av 5-10 μm fettvävnad sektioner, på grund av den begränsade storleken på avsnittet, begränsar förmågan att uppskatta viktiga strukturella funktioner. Först är endast ett fåtal adipocyte kärnor detekterbara per avsnitt eftersom varje avsnitt representerar endast en liten del av adipocyterna (1/10th). För det andra är storleken på de adipocyter som uppskattas från fettvävnadssektioner felaktig eftersom de flesta adipocyter skärs under eller bakom deras ekvatorn, vilket leder till en partisk (under)mätning av deras medelstorlek. För det tredje, blodkärlet och nerv fiber kontinuum går förlorade under fysisk snittning. För det fjärde är fördelningen av varje undertyper av immunceller inom vävnaden svår att fastställa eftersom de tredimensionella koordinaterna går förlorade. I detta sammanhang, den metod som vi föreslår här tillåter alla vanliga laboratorium för att bilden människa och mus vit fettvävnad i tre dimensioner, på ett enkelt och billigt sätt.
Den här metoden gör har något begränsningarna. Först är den tid som krävs för att förbereda vävnaden (fixering, permeabilisering, färgning, clearing) lång (mer än en vecka). Detta skulle vara svårt att minska eftersom majoriteten av denna tid krävs för att färga vävnaden. Genomträngning av antikroppar inom sådana stora vävnadsprover kräver långa inkubationstider. Minska inkubationstiden skulle öka risken för att ha icke-homogena antikroppar penetration, vilket skulle leda till färgning artefakter. Därför är det enda möjliga fönstret för att vinna tid och förkorta proceduren den tid som är dedikerad för att rensa vävnaden, vilket tar ungefär en dag då optimala resultat krävs, men detta kan minskas till en halv dag utan en dramatisk nedgång i kvalitet. Den andra begränsningen är den troliga krympningen av vävnaden. Faktum är att i alla protokoll som torkar vävnad med hjälp av lösningsmedel, är det troligt att vävnaderna krymper på grund av vattenborttagning. Att uppskatta denna krympning är alltid utmanande, och det är nästan omöjligt här eftersom kanten av vävnaden blir transparent när lipider börjar utvinnas under uttorkningsprocessen. Därav, storleken uppskattningar av de rensade vävnader måste tolkas med försiktighet. Att jämföra förändringar i adipocytestorlekar eller kärllängd mellan vävnader som härrör från mus med olika genotyper och/eller som lämnats till olika miljöförhållanden förblir emellertidinformativa 11. Den sista begränsningen är kopplad till den stora volymen av hela mus fettvävnad eller av en stor mänsklig fettvävnad kirurgiskt prov. Faktum är att även om protokollet är perfekt anpassad för att rensa dessa stora prover, imaging ett helt organ är utmanande med en confocal mikroskop. Strategin för att övervinna denna fråga och att utnyttja hela potentialen i hela förfarandet organ clearing, är att förvärva en 3D låg förstoring karta över hela organet genom att använda en 4x mål, och att välja ut specifika områden slumpmässigt spridda inom vävnaden där högre förstoring 3D-bilder med hjälp av en 20x långväga mål kan förvärvas. "Den höga förstoringen" setup tillåter avbildning av vävnadsvolymen på runt 45 mm3 (4,7 x 4,7 x 2 mm). Även om denna volym är begränsad jämfört med volymen av hela organet (0,5 till mer än 4 cm3), upprepa förvärven på flera positioner inom vävnaden tillåter oss att få en bra provtagning av vävnaden på cellulära till sub-cellulär upplösning. Observera att bildframställning stora vävnader kommer att generera en betydande mängd avbildningsdata som kommer att behöva lagras.
Förfarandet har betydande skillnader vid jämförelse med metoder som tidigare har beskrivits för att rensa fettvävnad14,30. Först av allt, till skillnad från AdipoClear, som använder metanol, diklormetan, och dibenzylether14, metoden som presenteras här använder etanol för uttorkning och metylsalicylat för clearing. Därför är förfarandet säkrare eftersom det drar fördel av mindre giftiga clearing lösningsmedel som ofta används av livsmedels-/dryck-bearbetning industrier (etanol och metylsalicylat), i jämförelse med den höga toxiciteten av dichlormetan, metanol och dibenzylether. Dessutom är framställningen av vävnaden enligt protokollet två dagar snabbare än AdipoClear-protokollet14. På senare tid har en annan metod föreslagits av Li och kollegor för att rensa fettvävnad bitar genom att fördjupa dem i glycerol30. Detta protokoll är mycket enkelt även jämfört med detta förfarande, och kvaliteten på bilderna är bra även vid hög förstoring. Detta clearingprotokoll fungerar dock bara effektivt vid användning av 2 mm3 fettvävnadsbitar. Den snittning av vävnaden i dessa små prover före clearingförfarandet hindrar en från avbildning vävnadsvolymer större än 2 mm3 även vid låg förstoring. Förfarandet som presenteras här möjliggör kartläggning av hela vävnaden i 3D vid låg förstoring och förvärv av 3D-travar av bilder runt 45 mm3 vid flera kända positioner inom hela rensas fettvävnad vid hög förstoring.
Den här proceduren kan ha flera framtida tillämpningar. Som med alla metoder, kan förfarandet som beskrivs här förenklas och / eller ytterligare optimeras. Ett intressant framsteg för förfarandet skulle kunna komma från kombinationen av clearingprocessen, beskrev vi, med ytterligare bildframställning metoder. Till exempel är specifika bildframställningar, såsom optisk projektionstomografi (OPT), total intern reflektionsfluorescensmikroskopi (TIRF), selektiv planbelysningsmikroskopi (SPIM) eller stimulerad utarmning av utsläpp (STED) i princip förenliga med förfarandet, även om detta kommer att begränsa dess tillämplighet till de laboratorier som är utrustade med dessa system. Alternativt, med hjälp av ett mål med en hög numerisk bländare index och ett förvärv system som kan förvärva hundratals bilder per sekund, som finns i många laboratorier, kan man utföra super-upplösning analyser genom att använda Super Resolution Radial Fluctuations (SRRF) efterbehandling bildanalys freeware31. Intressant nog är klassiska fluorokromer anpassade för SRRF-analysen, som skulle möjliggöra 3D-superupplösningsanalyser av hela human- och musvita fettvävnader.
Många kritiska steg i protokollet är relaterade till vävnadsbearbetningen före själva clearingen. Först och främst, och som för klassiska histologiska analyser, är fixeringssteget grundläggande. Vid svag fixering bevaras inte strukturella särdrag, medan utökad fixering leder till tvärlänkning och blockering av specifika antigenplatser och därav följande icke-homogena immunfärgning. Ett annat känsligt steg är färgningen av vävnaden, som presenterar flera kritiska punkter som vi kommer att beskriva nedan. Först måste antikropparna valideras genom att testa dem på kryostatsektioner för att bekräfta att de är funktionella och för att bestämma deras optimala koncentration. Den slutliga koncentration som används för clearingförfarandet är tio gånger den optimala koncentrationen för kryostatsektionerna. För det andra är tiden för inkubation också kritisk på grund av vävnadens storlek. En inkubationstid som är för kort kommer att ge svag eller icke-homogen immunfärgning (t.ex. korrekt färgning i vävnadens periferi men ingen inre färgning). På samma sätt kommer tvättsteg som är för korta att förhindra att icke-specifikt bundna antikroppar avlägsnas från vävnaden som leder till icke-specifik färgning. Vår kunskap, förlängd inkubation av vävnaden med antikroppar inte försämra färgningen. Därför rekommenderar vi starkt långa inkubations- och tvättperioder. För det tredje måste valet av fluorokromen anpassas till den signal som är intresserad. I vävnadsprover i allmänhet, och särskilt vit fettvävnad, är icke-försumbar auto-fluorescens detekterbara vid 488 nm och 555 nm. För högt uttryckta proteiner är detta inte en fråga och färgningen kommer att fungera bra i dessa kanaler. Men för proteiner med lågt uttryck rekommenderar vi starkt användning av långt-röda fluorokromer. För clearingen finns det inga kritiska steg eftersom metoden är mycket enkel. Tänk på att metylsalicylat inte är kompatibelt med plastmaterial, därför rekommenderar vi glasflaskor för clearingstegen och en metallisk kammare utrustad med en glasbotten för att utföra bildåtergivningen. Alternativ för denna montering förfarande finns med hjälp av i) en normal glasrutschbana, dental harts och glas coverslip (för att generera en liten glaskammare), eller ii) ett glas petriskål (för upprätt mikroskop uppställningar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av INSERM, Université Côte d'Azur, och genom bidrag från den franska nationella forskningsbyrån (ANR) genom Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), programmet UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 "Systèmes Complexes" och Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), och Young Investigator Program to J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Vi tackar också Imaging Core Facility of C3M som finansieras av Conseil Départemental des Alpes-Maritimes och Région PACA, och som också stöds av IBISA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA). Vi tackar Marion Dussot för teknisk hjälp vid vävnadsberedning. Vi tackar Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, för korrekturläsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
References
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
- Shields, K. J., Wu, C.
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W.
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
