Summary
Ici, nous décrivons une méthode simple, peu coûteuse et rapide de compensation pour résoudre la structure 3D de la souris et du tissu adipeux blanc humain en utilisant une combinaison de marqueurs pour visualiser la vascularisation, les noyaux, les cellules immunitaires, les neurones, et les protéines de couche de lipide-goutte par imagerie fluorescente.
Abstract
L’obésité est un problème majeur de santé publique dans le monde entier qui augmente le risque de développer des maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2 et des maladies du foie. L’obésité se caractérise par une augmentation de la masse de tissu adipeux (AT) due à l’hyperplasie d’adipocyte et/ou à l’hypertrophie, menant au remodelage profond de sa structure tridimensionnelle. En effet, la capacité maximale d’AT à se développer pendant l’obésité est essentielle au développement des pathologies associées à l’obésité. Cette expansion AT est un mécanisme homéostatique important pour permettre l’adaptation à un excès d’apport énergétique et pour éviter les retombées délétères lipidiques à d’autres organes métaboliques, tels que les muscles et le foie. Par conséquent, la compréhension du remodelage structurel qui conduit à l’échec de l’expansion AT est une question fondamentale avec une applicabilité clinique élevée. Dans cet article, nous décrivons une méthode de compensation simple et rapide qui est couramment utilisée dans notre laboratoire pour explorer la morphologie de la souris et du tissu adipeux blanc humain par imagerie fluorescente. Cette méthode de compensation AT optimisée est facilement réalisée dans n’importe quel laboratoire standard équipé d’une hotte chimique, d’un shaker orbital à température contrôlée et d’un microscope fluorescent. De plus, les composés chimiques utilisés sont facilement disponibles. Fait important, cette méthode permet de résoudre la structure 3D AT en tachant divers marqueurs pour visualiser spécifiquement les adipocytes, les réseaux neuronaux et vasculaires, et la distribution innée et adaptative des cellules immunitaires.
Introduction
L’obésité se caractérise par une augmentation de la masse tissulaire adipeuse et est devenue un problème majeur de santé publique dans le monde entier, étant donné que les personnes souffrant d’obésité ont un risque accru de développer des maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2, les maladies du foie et certains cancers.
Une fonction physiologique fondamentale du tissu adipeux est de moduler l’homéostasie du glucose entier du corps et des lipides1,2. Pendant la période d’alimentation, les adipocytes (c.-à-d. les principales cellules du tissu adipeux) stockent l’excès de glucose et de lipides fournis par un repas dans les triglycérides. Pendant le jeûne, les adipocytes décomposent les triglycérides en acides gras non estérifiés et en glycérol pour soutenir la demande énergétique du corps. Pendant le développement de l’obésité, les tissus adipeux se développent en augmentant la taille (hypertrophie) et/ou le nombre (hyperplasie) des adipocytes1,pour augmenter leur capacité de stockage. Lorsque l’expansion du tissu adipeux atteint sa limite, une constante très variable chez les patients, les lipides restants s’accumulent dans d’autres organes métaboliques, y compris les muscles et le foie3,4, conduisant à leur échec fonctionnel et l’initiation de l’obésité liées complications cardio-métaboliques1,5. Par conséquent, l’identification des mécanismes qui régissent l’expansion des tissus adipeux est un défi clinique clé.
Les modifications morphologiques documentées dans les tissus adipeux pendant l’obésité sont liées à son dysfonctionnement pathologique. Plusieurs procédures de coloration ont été utilisées pour décrire l’organisation tissulaire du tissu adipeux, y compris l’actine6, les marqueurs vasculaires7, les marqueurs de gouttelettes de lipides8, et les marqueurs spécifiques de cellules immunitaires9,10. Cependant, en raison de l’énorme diamètre des adipocytes (50 à 200 μm)11, il est essentiel d’analyser une grande partie du tissu entier en trois dimensions afin d’analyser avec précision les changements structurels dramatiques AT observés pendant l’obésité. Cependant, comme la lumière ne pénètre pas dans un tissu opaque, l’imagerie en 3D à l’intérieur d’un grand échantillon de tissus utilisant la microscopie par fluorescence n’est pas possible. Des méthodes de compensation des tissus pour les rendre transparentes ont été rapportées dans la littérature (pour un examen, voir12)permettant de dégager des tissus et d’effectuer en profondeur, la microscopie de fluorescence de tissu entier. Ces méthodes offrent des occasions sans précédent d’évaluer l’organisation cellulaire 3D dans les tissus sains et malades. Chacune des méthodes décrites présente des avantages et des inconvénients et doit donc être soigneusement sélectionnée en fonction du tissu étudié (pour un examen, voir13). En effet, certaines approches nécessitent une longue période d’incubation et/ou l’utilisation de matériaux ou de composés coûteux, toxiques ou difficiles à obtenir14,,15,16,17,18,19. Profitant de l’un des premiers composés utilisés il y a un siècle par Werner Spalteholz pour dégager les tissus20,nous avons mis en place un protocole convivial et peu coûteux qui est très bien adapté pour le nettoyage de tous les dépôts de tissus adipeux souris et humains dans n’importe quel laboratoire avec un équipement typique, y compris une hotte chimique, un shaker à température contrôlée et un microscope confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ce protocole a été testé et est validé pour tous les dépôts de tissus adipeux blancs et de souris. Les tissus adipeux humains et murins ont été recueillis en conséquence aux lois européennes et approuvés par les comités d’éthique Français et suédois.
1. Fixation de la souris et du tissu adipeux blanc humain
- Immerger la souris récoltée ou les tissus adipeux blancs humains dans au moins 10 ml de PBS contenant 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans un tube en plastique de 15 mL.
- Agiter le tube en plastique à température ambiante sur une plaque de roulement pendant 1 h.
- Laisser le tube en plastique à 4 °C sur une plaque de roulement pendant la nuit, pour compléter la fixation.
REMARQUE : Ce protocole est adapté pour les grands échantillons de tissus adipeux, tels que les graisses épididymiques entières obtenues à partir de souris nourries d’un régime alimentaire normal (≈250 mg - ≈0,6 cm3). Pour les échantillons plus grands comme les tampons épididymiques obtenus à partir de souris nourries à un régime riche en graisses (≈1,5 g - ≈4 cm3) ou des échantillons de tissus adipeux humains, bien que le protocole de compensation devrait parfaitement fonctionner pour l’ensemble de l’échantillon (en augmentant le PFA et les mélanges d’anticorps), en général, nous coupons des morceaux de tissu autour de 1 g (≈2,5 cm3) pour réserver les échantillons restants soit pour des taches supplémentaires ou des applications. Pour la PFA (étape 1.1.) nous recommandons d’utiliser environ 10 fois le volume du tissu. Pour les mélanges d’anticorps (étapes 3.1. et 3.4.), augmenter le volume pour immerger complètement le tissu, et utiliser un tube en plastique de 15 ml (voir tableau des matériaux)si le tissu est trop grand pour un microtube en plastique de 1,5 mL (voir tableau des matériaux).
2. Permeabilisation et saturation de la souris et du tissu adipeux blanc humain
- Rincer le tissu adipeux blanc fixe dans 10 mL de PBS pendant 5 min à température ambiante pour enlever toutes les traces de PFA.
- Immerger le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml de PBS complété par 0,3% de glycine (voir tableau des matériaux)et secouer le tube à température ambiante dans un shaker orbital pendant 1 h à 100 tours par minute (tr/min) pour étancher les groupes d’aldéhyde libre restants.
- Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 mL contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% de Triton X-100 (voir tableau des matériaux)et secouez le tube à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée pendant 2 h à 100 tr/min.
- Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% Triton X-100 et 20% DMSO (voir Tableau des matériaux)et secouez le tube à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant la nuit.
- Immerger le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml de PBS complété par 0,1% Tween-20 (voir tableau des matériaux),0,1% Triton X-100, 0,1 % de désoxycholate (voir tableau des matériaux)et 20 % de DMSO et secouez le tube à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant au moins 24 h.
- Rincer le tissu dans un tube en plastique de 15 mL contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% Triton X-100 et secouer le tube à température ambiante dans un shaker orbital à 100 tr/min pendant 1 h.
- Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 mL contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% Triton X-100, 10% DMSO et 3% BSA (voir Tableau des matériaux)et secouez le tube à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant 12 h, pour saturer tous les sites qui pourraient non spécifiquement lier les anticorps.
REMARQUE : À l’étape 2.7, le BSA peut être remplacé par le sérum sanguin des espèces de l’anticorps secondaire utilisé.
3. Procédure de coloration pour la souris et le tissu adipeux blanc humain
- Transférer le tissu dans un microtube en plastique de 1,5 mL contenant 300 μL de PBS complété par 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA et les anticorps primaires (10x plus concentrés que pour la coloration cryosection mais concentration optimale d’anticorps devrait être évalué pour chaque anticorps). Protégez le tube de la lumière en couvrant avec du papier d’aluminium et secouez le tube à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant au moins deux jours (voir la note à l’étape 1.1 et à l’étape 3.7.1).
- Rincer le tissu dans un tube en plastique de 15 mL contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% Triton X-100, 10% DMSO et 3% BSA et secouer le tube protégé de la lumière à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant 5 h. Effectuez cette étape deux fois.
- Rincer le tissu dans un tube en plastique de 15 mL contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% Triton X-100, 10% DMSO et 3% BSA et secouer le tube, protégé de la lumière, à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant une nuit à deux jours.
- Transférer le tissu à un microtube en plastique de 1,5 mL contenant 300 μL de PBS complété par 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA et les anticorps secondaires (10x plus concentrés que pour la coloration cryosection). Protégez le tube de la lumière en couvrant avec du papier d’aluminium et secouez le tube à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant au moins deux jours (voir la note à l’étape 1.1 et à l’étape 3.7.1).
- Rincer le tissu dans un tube en plastique de 15 mL contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% triton X-100, 10% DMSO, et 3% BSA et secouer le tube, protégé de la lumière, à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant 5 h. Effectuez cette étape deux fois.
- Rincer le tissu dans un tube en plastique de 15 mL contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, et 3% BSA et secouer le tube, protégé de la lumière, à 37 °C dans un shaker à température contrôlée orbitale à 100 tr/min pendant une nuit à deux jours.
- Rincer le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml de PBS et secouer le tube, protégé de la lumière, à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant 2 h.
REMARQUE : Pour l’étiquetage de structures spécifiques telles que les noyaux ou l’actine, ajouter 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI ou équivalent) et/ou la phalloïdine fluorescente étiquetée à l’étape 3.1. lorsque seuls les anticorps primaires étiquetés fluorescents sont utilisés, ou à l’étape 3.4. lorsque des anticorps secondaires sont utilisés.
NOTE: Pour la procédure de coloration, les anticorps primaires déjà conjugués avec les fluorochromes (comme ceux utilisés pour la cytométrie de flux) peuvent être utilisés et nous le recommandons pour le gain de temps et de spécificité. En effet, même si les anticorps primaires de souris peuvent être utilisés suivis d’anticorps anti-souris secondaires, comme nous l’avons démontré ici, nous avons souvent observé des taches non spécifiques des vaisseaux sanguins en raison de la circulation de l’immunoglobuline. Par conséquent, pour éviter ce problème, les anticorps primaires qui sont déjà étiquetés sont fortement recommandés et ici nous fournissons la preuve que les anticorps utilisés dans la cytométrie de flux sont compatibles avec notre procédure. Toutefois, dans le cas spécifique d’un antigène qui est exprimé à de faibles niveaux, une étape d’amplification du signal par l’intermédiaire d’anticorps secondaires est obligatoire; lorsque le seul anticorps primaire disponible est fabriqué chez la souris, une perfusion cardiaque des souris avec PBS pendant au moins 5 min au sacrifice peut enlever une grande proportion de l’immunoglobuline circulante et donc la coloration non spécifique.
4. Procédure de compensation pour la souris et le tissu adipeux blanc humain
- Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml d’éthanol à 50 % et secouez le tube, protégé de la lumière, à température ambiante dans un shaker orbital à 100 tr/min pendant 2 h.
- Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml d’éthanol à 70 % et secouez le tube, protégé de la lumière, à température ambiante dans un shaker orbital à 100 tr/min pendant 2 h.
- Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml d’éthanol à 95 % et secouez le tube, protégé de la lumière, à température ambiante dans un shaker orbital à 100 tr/min pendant 2 h.
- Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml d’éthanol à 100 % et secouez le tube, protégé de la lumière, à température ambiante dans un shaker orbital à 100 tr/min pendant 2 h.
- Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml d’éthanol à 100 % et secouez le tube, protégé de la lumière, à température ambiante dans un shaker orbital à 100 tr/min pendant la nuit.
- Plonger le tissu dans une bouteille en verre de 20 ml avec un bouchon en plastique (voir tableau des matériaux) contenant 5 ml de salicylate de méthyle (voir tableau des matériaux)sous une hotte chimique et secouer le récipient en verre, protégé de la lumière, à température ambiante dans un shaker orbital à 100 tr/min pendant au moins 2 h.
REMARQUE : La procédure de compensation pourrait être considérablement accélérée (si nécessaire) en évitant les étapes 4.3. et 4.5., bien que la qualité finale de compensation serait légèrement réduite.
Imagerie .3D confocale du tissu adipeux blanc dégagé
- Transférer le tissu dans une chambre d’imagerie métallique équipée d’un fond de verre (voir tableau des matériaux)sous une hotte chimique et remplir la chambre de salicylate de méthyle frais.
REMARQUE : Pour fixer le tissu en place, et ainsi pour l’empêcher de flotter ou de se déplacer latéralement dans la chambre, appliquez plusieurs couvercles de verre ronds de 18 mm (voir tableau des matériaux)sur le dessus du tissu lors du montage dans la chambre. - Placez la chambre d’imagerie sur un microscope confocal inversé.
- Imager le tissu à l’aide d’un objectif de grossissement faible (p. ex., objectif 4x) pour générer quelques cm3 cartes 3D de l’ensemble du tissu adipeux ou de l’échantillon de tissu humain.
- Sélectionnez plusieurs zones pour l’échantillonnage des tissus à un grossissement plus élevé. En règle générale, utilisez un objectif d’air longue distance 20x qui fournit un bon rapport entre la résolution et la profondeur. Nous acquérons de grandes images de mosaïque avec des piles z entre 600 et 2000 μm de profondeur.
REMARQUE : Utilisez un objectif à longue distance pour l’image plus profondément dans le tissu.
6. Extraction des résultats quantitatifs des images de tissus adipeux 3D
REMARQUE : La segmentation des différentes structures et l’extraction ultérieure des informations quantitatives à partir de la pile d’images 3D générées au point 5 peuvent être effectuées à l’aide de l’une des nombreuses options logicielles d’analyse d’images existantes, commerciales ou freeware. Dans les points suivants, nous décrivons une stratégie qui est couramment utilisée dans notre laboratoire pour extraire des informations quantitatives à partir d’images de tissus adipeux 3D à l’aide de logiciels commerciaux (voir tableau des matériaux).
- Convertissez les piles 3D sur le format logiciel en espace mémoire libre.
- Segmenter les cellules.
- Ouvrez le module Cellule du logiciel.
- Modifiez le paramètre de détection cellulaire en coloration de membrane plasmatique.
- Choisissez le canal fluorescent du marqueur utilisé pour délimiter la périphérie cellulaire (phalloïdine qui étiquette l’actine corticale ou les marqueurs de membrane plasmatique tels que F4/80 pour le macrophage, le TCR-β pour les lymphocytes T, ou un faisceau de protéines CD de différenciation spécifiques aux sous-types de cellules immunitaires).
- Définissez les seuils et fournissez une plage de la taille prévue des cellules (c.-à-d. 1 à 200 μm pour la détection cellulaire).
- Exécutez la segmentation. Un volume correspondant à la pile z sera généré avec les cellules segmentées codées par couleur avec une couleur différente pour chacune des cellules voisines.
- Appliquer des filtres statistiques (taille, rondeur, circularité, etc.) dans l’onglet statistique pour exclure les artefacts de segmentation et/ou pour affiner les cellules segmentées à la cellule d’intérêt en fonction de leur taille (c.-à-d. 20-200 μm pour les adipocytes; 5-25 μm pour les macrophages; 1-3 μm pour les lymphocytes).
- Extraire les mesures et les données quantitatives (volume, nombre, taille, diamètre, etc.) de l’onglet statistiques.
- Segmenter les composants cellulaires (noyaux, vésicules, etc.) ou les vaisseaux en tant que structure.
REMARQUE : Bien que la segmentation des filaments soit très utile pour étudier la connectivité des navires, nous utilisons la segmentation du module de surface pour extraire des données sur la taille, le volume et le diamètre des navires. En effet, la quantification des tailles des vaisseaux est perdue lors de l’utilisation du module filaments.- Ouvrez le module Surface du logiciel.
- Sélectionnez le canal fluorescent du marqueur utilisé pour étiqueter spécifiquement le composant subcellulaire pour le reconstruire en 3D.
- Établir les seuils et fournir une plage de la taille prévue du diamètre de la structure (c.-à-d. 0,5 à 5 μm pour les noyaux; 0-100 μm pour les navires; etc.).
- Exécutez la segmentation. Un volume avec la structure cellulaire segmentée sera généré. Les mesures et les données quantitatives (volume, nombre, taille, diamètre, etc.) peuvent être extraites de l’onglet statistiques.
- Segmenter les vaisseaux comme un continuum tubulaire.
REMARQUE : Bien que la segmentation des filaments soit très utile pour étudier la connectivité des navires, nous utilisons la segmentation du module de surface pour extraire des données sur la taille, le volume et le diamètre des navires. En effet, la quantification des tailles des vaisseaux est perdue lors de l’utilisation du module filaments.- Ouvrez le module Filaments du logiciel.
- Sélectionnez le canal fluorescent correspondant à la coloration du navire.
- Définissez les seuils de l’intensité de fluorescence et sélectionnez le nombre approprié de nœuds de connexion attendus.
- Exécutez la segmentation. Les filaments représentant le réseau de navires seront générés en 3D. Les mesures peuvent être extraites de l’onglet statistiques, ce qui permet d’obtenir des données quantitatives, y compris la longueur du navire, le nombre de branchements des navires, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En utilisant la procédure décrite ici et résumée à la figure 1, nous avons été en mesure de tacher et optiquement clair l’homme et la souris blanc tissu adipeux tel que présenté à la figure 2A et figure 2B, respectivement. Le tissu effacé a été transféré à la chambre d’imagerie métallique pour effectuer l’imagerie confocale (figure 3A). La compensation a considérablement amélioré la profondeur des images tissulaires que nous avons pu acquérir (figure 3B et figure 3C). L’ensemble du tissu adipeux peut être acquis en 3D à faible grossissement en utilisant un objectif 4x (voir film supplémentaire 1), pour générer une carte 3D, permettant de sélectionner les différentes zones à acquérir à un grossissement élevé en utilisant un objectif de 20x (Figure 3D). Les images de grossissement élevé sont acquises en 3D avec une profondeur de 2 mm (Figure 3E).
Cette procédure permet l’étiquetage de nombreux marqueurs cellulaires généraux, y compris les noyaux à l’aide de DAPI et d’actine à l’aide de Phalloïdine étiquetée fluorescente. La coloration spécifique des gouttelettes de lipides et des adipocytes peut être réalisée en utilisant l’anticorps de perilipin (voir tableau des matériaux; Figure 4A) et anticorps anti-Glut4 (voir tableau des matériaux; Figure 4B) Respectivement. Les vaisseaux sanguins peuvent être détectés à l’aide de l’anticorps CD31 (voir tableau des matériaux; Figure 4C) ou par injection intraveineuse de lectine-DyLight649 peu avant le sacrifice de la souris (voir tableau des matériaux; Figure 4D). Les macrophages et les lymphocytes T peuvent être visualisés à l’aide de l’anticorps anti-CD301-PhycoErythrin (voir tableau des matériaux; Figure 4D) et l’anticorps anti-TCR-β-Pacific Bleu (voir tableau des matériaux; Figure 4E). Le réseau nerveux périphérique peut être détecté à l’aide de l’anticorps anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) (voir tableau des matériaux; Figure 4F-G). En outre, ce protocole permet de déblayer le tissu adipeux épididymal de souris (figure 4A-B,E), tissu adipeux sous-cutané de souris (figure 4D,G),le tissu adipeux brun de souris (figure 4F), et le tissu adipeux humain (figure 4C). À l’aide d’une combinaison de ces étiquetages et d’un logiciel commercial (voir tableau des matériaux) pour segmenter ces marqueurs, nous pouvons déterminer dans le tissu adipeux i) les adipocytes de la taille moyenne et de la distribution de la taille(figure 5A-B) et ii) de la densité du réseau des vaisseaux sanguins (figure 5C).
Figure 1 : Résumé de la procédure de compensation pour les tissus adipeux blancs. Les tissus adipeux blancs de souris ou humains sont fixes, perméabilisés, saturés, tachés et déblayés. Les images sont ensuite acquises en 3D et analysées à l’aide d’un logiciel commercial. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Photographies de tissu adipeux blanc. (A) Photographie du tissu adipeux blanc humain d’abdominopelvic avant et après la procédure de compensation. (B) Photographie du tissu adipeux blanc épididymal de souris avant et après la procédure de compensation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Amélioration de la profondeur d’imagerie grâce à la compensation des tissus adipeux. (A) Montage de la chambre d’imagerie métallique équipée d’un fond de verre. (B) Images de série Z du tissu adipeux blanc épididymal de souris taché de phalloïdien-Alexa488 (vert) avant et après le dégagement. (C) Projections XZ correspondant aux lignes pointillées blanches à travers le panneau B z-stack. (D) Projection Z de 0,4 cm z-pile de tissu adipeux blanc sous-cutané de souris taché pour l’actine à l’aide de Phalloidin-Alexa488 et acquis à faible grossissement avec un objectif 4x. Les petites images sur la droite ont été acquises à la position de tissu sélectionné en utilisant un objectif 20x. (E) Vue latérale du rendu de volume 3D de l’image z-stack à partir de tissu adipeux blanc de souris effacée tachée de Phaloidin-Alexa488 acquis de la même manière que les images 20x de (D). La profondeur d’imagerie 3D obtenue par notre procédure de grossissement élevé est démontrée ici et soulignée par un codage de couleur z-profondeur (bleu foncé pour z=0 mm au rouge foncé pour z=2 mm). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Tissus adipeux blancs et muraux humains tachés pour plusieurs marqueurs. (A)Image plane unique du tissu adipeux blanc épididymal de souris taché pour les gouttelettes de lipides utilisant l’anticorps anti-perilipin1 et l’anticorps conjugué anti-souris-alexa647. (B) Image monomédia de plan de souris épididymal tissu adipeux blanc taché pour les noyaux et les adipocytes à l’aide de DAPI, anticorps anti-Glut4 et anticorps anti-souris-alexa647-conjugué. (C) Projection Z de 600 μm z-pile de tissu adipeux blanc humain taché pour les vaisseaux utilisant l’anticorps conjugué CD31-alexa647. (D) Projection Z de 600 μm z-pile de tissu adipeux blanc sous-cutané de souris taché pour les vaisseaux et les macrophages à l’aide d’injections intraveineuses lectine-DyLight649 et d’anticorps anti-CD301-alexa555. L’encart inférieur droit est une image zoomée de la boîte en pointillés blanches. (E) Image plane unique du tissu adipeux blanc épididymal de souris taché pour l’actine et les lymphocytes T utilisant la phalloïdin-Alexa488 et anti-TCRβ-Pacific bleu-conjugué. L’encart inférieur droit est une image zoomée de la boîte en pointillés blanches. (F) Projection Z de 50 μm z-pile de tissu adipeux brun souris taché pour les noyaux et le réseau neuronal à l’aide de DAPI, anticorps anti-TH et anticorps conjugés anti-lapin-alexa647. (G) Projection Z de 600 μm z-pile de tissu adipeux blanc sous-cutané de souris taché pour les noyaux et le réseau neuronal utilisant DAPI, anticorps anti-TH et anticorps anti-rabbit-alexa647-conjugué. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Analyse des images 3D à l’aide de logiciels disponibles dans le commerce (voir tableau des matériaux). (A) rendu en volume 3D des adipocytes humains segmentés en 3D par des logiciels disponibles dans le commerce. Chaque adipocyte a une couleur différente de ses adipocytes adjacents de contact. Les navires sont représentés en rouge. (B) Quantification de la taille et distribution des adipocytes à partir du rendu en volume 3D du panneau A, qui contient environ 20 000 adipocytes. (C) Rendu de volume 3D des vaisseaux sanguins segmentés en 3D à l’aide de logiciels disponibles dans le commerce et représentés en rouge ou jaune pour les grands et les petits vaisseaux, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film supplémentaire 1 : rendu en volume 3D de l’ensemble du tissu adipeux blanc sous-cutané montré dans la figure 3D. La boîte blanche représente un cube de 2 cm3. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les modifications qui se produisent dans le tissu adipeux au cours de la progression pathologique, comme celle de l’obésité, est fondamentale pour la compréhension des mécanismes derrière la pathologie. Des études pionnières qui ont révélé de tels mécanismes dans les tissus adipeux ont été basées sur des approches globales telles que la protéomique tissulaire adipeuse entière21, cytométrie de flux22,23, et transcriptomics24,25. En outre, des efforts ont été faits pour explorer les changements structurels qui se produisent dans les tissus adipeux à l’aide d’analyses histologiques26,27,28,29. Cependant, l’analyse des sections adiposes de 5 à 10 μm, en raison de la taille limitée de la section, limite la capacité d’apprécier les caractéristiques structurelles importantes. Tout d’abord, seuls quelques noyaux d’adipocytes sont détectables par section puisque chaque section ne représente qu’une petite partie des adipocytes (1/10e). Deuxièmement, la taille des adipocytes estimés à partir de sections de tissus adipeux est inexacte parce que la plupart des adipocytes sont coupés en dessous ou derrière leur équateur, ce qui conduit à une mesure biaisée (sous)de leur taille moyenne. Troisièmement, le vaisseau sanguin et le continuum des fibres nerveuses sont perdus pendant la section physique. Quatrièmement, la distribution de chaque sous-types de cellules immunitaires dans le tissu est difficile à établir parce que les coordonnées tridimensionnelles sont perdues. Dans ce contexte, la méthodologie que nous proposons ici permet à n’importe quel laboratoire standard d’imager les tissus adipeux blancs et humains et de souris en trois dimensions, d’une manière simple et peu coûteuse.
Cette méthode a certaines limites. Tout d’abord, le temps nécessaire pour préparer le tissu (fixation, perméabilisation, coloration, compensation) est long (plus d’une semaine). Cela serait difficile à réduire parce que la majorité de ce temps est nécessaire pour tacher le tissu. La pénétration d’anticorps dans de tels échantillons de tissus importants nécessite de longs temps d’incubation. La diminution du temps d’incubation augmenterait le risque d’avoir une pénétration non homogène des anticorps, ce qui conduirait à la coloration des artefacts. Par conséquent, la seule fenêtre possible pour gagner du temps et raccourcir la procédure est le temps consacré à effacer le tissu, qui prend environ un jour lorsque des résultats optimaux sont nécessaires, mais cela peut être diminué à une demi-journée sans une baisse spectaculaire de la qualité. La deuxième limitation est le rétrécissement probable du tissu. En effet, dans tout protocole qui déshydrate les tissus à l’aide de solvants, il est probable que les tissus rétrécissent en raison de l’enlèvement de l’eau. L’estimation de ce rétrécissement est toujours difficile, et il est presque impossible ici parce que le bord du tissu devient transparent lorsque les lipides commencent à être extraits pendant le processus de déshydratation. Par conséquent, les estimations de taille des tissus dédouanés doivent être interprétées avec prudence. Toutefois, la comparaison des changements dans la taille des adipocytes ou la longueur des vaisseaux entre les tissus dérivés de souris avec différents génotypes et/ou soumis à différentes conditions environnementales restent informatifs11. La dernière limitation est liée au grand volume du tissu adipeux entier de souris ou d’un grand échantillon chirurgical de tissu adipeux humain. En effet, bien que le protocole soit parfaitement adapté pour effacer ces grands échantillons, l’imagerie d’un organe entier est difficile avec un microscope confocal. La stratégie pour surmonter ce problème et d’exploiter le plein potentiel de l’ensemble de la procédure de compensation des organes, est d’acquérir une carte de grossissement 3D faible de l’organe en utilisant un objectif 4x, et de sélectionner des zones spécifiques aléatoirement dispersées dans le tissu où le grossissement des images 3D plus élevé en utilisant un objectif 20x longue distance peut être acquise. La configuration « grossissement élevé » permet d’imagerier le volume tissulaire d’environ 45 mm3 (4,7 x 4,7 x 2 mm). Bien que ce volume soit limité par rapport au volume de l’organe entier (0,5 à plus de 4 cm3),répéter les acquisitions à plusieurs positions dans le tissu nous permet d’obtenir un bon échantillonnage du tissu à la résolution cellulaire à sous-cellulaire. Notez que l’imagerie de grands tissus générera une quantité importante de données d’imagerie qui devront être stockées.
La procédure a des différences significatives par rapport aux méthodes qui ont déjà été décrites pour effacer le tissu adipeux14,30. Tout d’abord, contrairement à AdipoClear, qui utilise du méthanol, du dichlorométhane et du dibenzylether14, la méthode présentée ici utilise l’éthanol pour la déshydratation et le salicylate de méthyle pour le compensation. Par conséquent, la procédure est plus sûre parce qu’elle tire parti des solvants de compensation moins toxiques qui sont souvent utilisés par les industries de transformation des aliments et des boissons (éthanol et méthylsalicylate), par rapport à la toxicité élevée du dichlorométhane, du méthanol et du dibenzylether. En outre, la préparation du tissu selon le protocole est deux jours plus rapide que le protocole AdipoClear14. Plus récemment, une autre méthode a été proposée par Li et ses collègues pour effacer les morceaux de tissu adipeux en les immergeant dans le glycérol30. Ce protocole est très simple même par rapport à cette procédure, et la qualité des images est bonne, même à grossissement élevé. Cependant, ce protocole de compensation ne fonctionne efficacement que lorsque vous utilisez des morceaux de tissu adipeux de 2 mm3. La section du tissu dans ces échantillons minuscules avant la procédure de compensation empêche l’imagerie des volumes de tissus supérieurs à 2 mm3, même à faible grossissement. La procédure présentée ici permet la cartographie du tissu entier en 3D à faible grossissement et l’acquisition de piles 3D d’images autour de 45 mm3 à plusieurs positions connues dans l’ensemble du tissu adipeux dégagé à un grossissement élevé.
Cette procédure peut avoir plusieurs applications futures. Comme pour toute méthode, la procédure décrite ici peut être simplifiée et/ou optimisée. Une avancée intéressante pour la procédure pourrait venir de la combinaison du processus de compensation, nous avons décrit, avec des approches d’imagerie supplémentaires. Par exemple, des configurations d’imagerie spécifiques, telles que la tomographie de projection optique (OPT), la microscopie de fluorescence de la réflexion interne totale (TIRF), la microscopie d’illumination à régime sélectif (SPIM) ou la microscopie d’épuisement des émissions stimulées (STED) sont en principe compatibles avec la procédure, bien que cela limite son applicabilité aux laboratoires équipés de ces systèmes. Alternativement, en utilisant un objectif avec un indice d’ouverture numérique élevé et un système d’acquisition qui est capable d’acquérir des centaines d’images par seconde, ce qui se trouve dans de nombreux laboratoires, on pourrait effectuer des analyses de super-résolution en utilisant la Super Résolution Radial Fluctuations (SRRF) post-traitement analyse d’image freeware31. Fait intéressant, les fluorochromes classiques sont adaptés pour l’analyse SRRF, ce qui permettrait des analyses 3D de super-résolution des tissus adipeux humains et murins blancs entiers.
De nombreuses étapes critiques du protocole sont liées au traitement des tissus avant la compensation elle-même. Tout d’abord, et comme pour les analyses histologiques classiques, l’étape de fixation est fondamentale. Dans le cas d’une fixation faible, les caractéristiques structurelles ne sont pas préservées, tandis que la fixation prolongée conduit au croisement et au blocage de sites spécifiques d’antigènes et à l’immuno tache non homogène qui en résulte. Une autre étape sensible est la coloration du tissu, qui présente plusieurs points critiques que nous allons décrire ci-dessous. Tout d’abord, les anticorps doivent être validés en les testant sur des sections cryostat pour confirmer qu’ils sont fonctionnels et pour déterminer leur concentration optimale. La concentration finale utilisée pour la procédure de compensation est dix fois la concentration optimale pour les sections cryostat. Deuxièmement, le temps d’incubation est également critique en raison de la taille du tissu. Un temps d’incubation trop court produira une immunostaining faible ou non homogène (p. ex., coloration correcte à la périphérie du tissu, mais pas de coloration interne). De même, les étapes de lavage qui sont trop courtes empêcheront les anticorps non spécifiquement liés d’être retirés du tissu menant à la coloration non spécifique. À notre connaissance, l’incubation prolongée du tissu avec des anticorps n’altère pas la coloration. Par conséquent, nous recommandons fortement de longues périodes d’incubation et de lavage. Troisièmement, le choix du fluorochrome doit être adapté au signal d’intérêt. Dans les échantillons de tissus en général, et en particulier les tissus adipeux blancs, l’autofluorescence non négligeable est détectable à 488 nm et 555 nm. Pour les protéines fortement exprimées ce n’est pas un problème et la coloration fonctionnera bien dans ces canaux. Cependant, pour les protéines à faible expression, nous recommandons fortement l’utilisation de fluorochromes bien-rouges. Pour la compensation, il n’y a pas d’étapes critiques puisque la méthodologie est très simple. Gardez à l’esprit que le salicylate de méthyle n’est pas compatible avec les matériaux plastiques, c’est pourquoi nous recommandons des bouteilles en verre pour les étapes de compensation et une chambre métallique équipée d’un fond de verre pour effectuer l’imagerie. Il existe des alternatives pour cette procédure de montage à l’aide de i) une lame de verre normale, de résine dentaire et de couvercles en verre (pour générer une petite chambre en verre), ou ii) un plat de pétri en verre (pour les configurations de microscopes droits).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont pas de conflits à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l’INSERM, Université Côte d’Azur, et grâce à des subventions de l’Agence nationale de la recherche Français (ANR) par le biais des Investissements pour le futur Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), le programme UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via l’Académie 2 « Systèmes Complexes » et l’Académie 4 « Complexité et diversité du vivant », Fondation pour la Recherche Médicale (Équipe FRM DEQ20180839587) et programme des jeunes chercheurs à J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Nous remercions également le Centre d’imagerie de C3M financé par le Conseil Départemental des Alpes-Maritimes et la Région PACA, et qui est également soutenu par la Plate-forme de microscopie et d’imagerie IBISA Côte d’Azur (MICA). Nous remercions Marion Dussot pour son aide technique dans la préparation des tissus. Nous remercions Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, pour la lecture de la preuve du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
References
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
- Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 1049-1052 (2005).
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
