Utforske fettvevsstruktur av Methylsalicylate Clearing og 3D Imaging
Summary
Her beskriver vi en enkel, billig og rask clearing metode for å løse 3D-strukturen av både mus og humant hvitt fettvev ved hjelp av en kombinasjon av markører for å visualisere vaskulatur, kjerner, immunceller, nevroner og lipid-dråpefrakkproteiner ved fluorescerende bildebehandling.
Abstract
Fedme er et stort verdensomspennende folkehelseproblem som øker risikoen for å utvikle hjerte-og karsykdommer, type-2 diabetes og leversykdommer. Fedme er preget av en økning i fettvev (AT) masse på grunn av adipocytt hyperplasi og / eller hypertrophia, noe som fører til dyp ombygging av sin tredimensjonale struktur. Faktisk er den maksimale kapasiteten til AT å utvide under fedme avgjørende for utviklingen av fedmerelaterte patologier. Denne AT-utvidelsen er en viktig homeostatisk mekanisme for å muliggjøre tilpasning til et overskudd av energiinntak og for å unngå skadelig lipidsøl til andre metabolske organer, som muskel og lever. Derfor er det et grunnleggende spørsmål med høy klinisk anvendelighet å forstå den strukturelle ombyggingen som fører til svikt i AT-utvidelse. I denne artikkelen beskriver vi en enkel og rask clearing metode som rutinemessig brukes i vårt laboratorium for å utforske morfologien til mus og menneskelig hvitt fettvev ved fluorescerende bildebehandling. Denne optimaliserte AT-ryddemetoden utføres enkelt i ethvert standardlaboratorium utstyrt med en kjemisk hette, en temperaturkontrollert orbital shaker og et fluorescerende mikroskop. Videre er de kjemiske forbindelsene som brukes lett tilgjengelige. Viktigere, denne metoden gjør det mulig å løse 3D AT-strukturen ved å farge ulike markører for å spesifikt visualisere adipocytter, de nevronale og vaskulære nettverkene, og den medfødte og adaptive immunceller distribusjon.
Introduction
Fedme er preget av en økning i fettvevsmasse og har blitt et stort verdensomspennende folkehelseproblem, gitt at personer med fedme har økt risiko for å utvikle kardiovaskulær sykdom, type-2 diabetes, leversykdommer og noen kreftformer.
En grunnleggende fysiologisk funksjon av fettvev er å modulere helkroppsglukose og lipid homeostase1,2. I fôringsperioden lagrer adipocytter (det vil si hovedcellene i fettvevet) overskuddet av glukose og lipider levert av et måltid i triglyserider. Under fasting bryter adipocytter ned triglyserider i ikke-forestret fettsyrer og glyserol for å opprettholde energibehovet i kroppen. Under utviklingen av fedme, fettvev utvide ved å øke størrelsen (hypertrophia) og / eller antall (hyperplasi) av adipocytter1, for å øke lagringskapasiteten. Når utvidelsen av fettvev når sin grense, en konstant svært variabel blant pasienter, de resterende lipider akkumuleres i andre metabolske organer, inkludert muskler og lever3,4, fører til deres funksjonelle svikt og initiere fedme-relaterte kardio-metabolske komplikasjoner1,5. Derfor er identifisering av mekanismene som styrer fettvevsutvidelse en viktig klinisk utfordring.
De morfologiske endringene dokumentert i fettvev under fedme er knyttet til sin patologiske dysfunksjon. Flere fargingsprosedyrer har blitt brukt til å beskrive vevsorganisering av fettvevet, inkludert actin6, vaskulære markører7,lipiddråpemarkører8og spesifikke immuncellemarkører9,10. Men på grunn av den enorme diameteren av adipocytter (50 til 200 μm)11, er det viktig å analysere en stor del av hele vevet i tre dimensjoner for å nøyaktig analysere de dramatiske strukturelle AT-endringene observert under fedme. Men fordi lyset ikke trenger inn i et ugjennomsiktig vev, er det ikke mulig å avbildning i 3D i en stor vevsprøve ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Metoder for vevrydding for å gjøre dem gjennomsiktige har blitt rapportert i litteraturen (for en gjennomgang,se 12) slik at man kan fjerne vev og utføre dyptgående, hele vev fluorescens mikroskopi. Disse metodene gir enestående muligheter til å vurdere 3D cellulær organisasjon i sunt og sykt vev. Hver av de beskrevne metodene har fordeler og ulemper, og må derfor nøye velges avhengig av det studerte vevet (for en gjennomgang, se13). Faktisk krever noen tilnærminger en lang inkubasjonsperiode og / eller bruk av materialer eller forbindelser som enten er dyre, giftige eller vanskelige å få14,15,16,17,18,19. Ved å dra nytte av en av de første forbindelsene som ble brukt for hundre år siden av Werner Spalteholz for å fjernevev 20,satte vi opp en brukervennlig og billig protokoll som er veldig godt tilpasset for rydding av alle mus- og menneskelige fettvevsdepoter i ethvert laboratorium med typisk utstyr, inkludert en kjemisk hette, en temperaturkontrollert orbital shaker og et konfokalt mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endringene som forekommer i fettvevet i løpet av patologisk progresjon, for eksempel fedme, er grunnleggende for forståelsen av mekanismene bak patologien. Banebrytende studier som avslørte slike mekanismer i fettvev har vært basert på globale tilnærminger som hele fettvev proteomics21, flyt cytometri22,,23,og transkripsjonsmikromikk24,25. I tillegg er det gjort forsøk på ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av INSERM, Université Côte d’Azur, og ved tilskudd fra det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR) gjennom Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), programmet UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 “Systèmes Complexes” og Academy 4 “Complexité et diversité duvant vi”, Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), og Young Investigator Program til J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Vi takker også Imaging Core Facility of C3M finansiert av Conseil Départemental des Alpes-Maritimes og Région PACA, og som også støttes av IBISA Microscopy and Imaging Platform Côte d’Azur (MICA). Vi takker Marion Dussot for teknisk hjelp i vevsforberedelse. Vi takker Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, for bevislesing av manuskriptet.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
References
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W., Hierzel, S. . Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. , (1911).
- Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
