Summary
Qui, descriviamo un metodo semplice, economico e veloce per risolvere la struttura 3D del tessuto adiposo bianco e topo umano utilizzando una combinazione di marcatori per visualizzare vascolatura, nuclei, cellule immunitarie, neuroni e proteine del mantello di goccia lipidi mediante imaging fluorescente.
Abstract
L'obesità è un importante problema di salute pubblica a livello mondiale che aumenta il rischio di sviluppare malattie cardiovascolari, diabete di tipo 2 e malattie del fegato. L'obesità è caratterizzata da un aumento della massa del tessuto adiposo (AT) a causa dell'iperplasia adipocita e/o dell'ipertrofia, che porta a una profonda ristrutturazione della sua struttura tridimensionale. Infatti, la massima capacità di AT di espandersi durante l'obesità è fondamentale per lo sviluppo di patologie associate all'obesità. Questa espansione AT è un importante meccanismo omeostatico per consentire l'adattamento a un eccesso di assunzione di energia e per evitare la fuoriuscita di lipidi deleteri ad altri organi metabolici, come il muscolo e il fegato. Pertanto, comprendere il rimodellamento strutturale che porta al fallimento dell'espansione AT è una questione fondamentale con un'elevata applicabilità clinica. In questo articolo, descriviamo un metodo di compensazione semplice e veloce che viene regolarmente utilizzato nel nostro laboratorio per esplorare la morfologia del topo e del tessuto adiposo bianco umano mediante imaging fluorescente. Questo metodo di compensazione AT ottimizzato è facilmente eseguibile in qualsiasi laboratorio standard dotato di una cappa chimica, uno shaker orbitale a temperatura controllata e un microscopio fluorescente. Inoltre, i composti chimici utilizzati sono prontamente disponibili. È importante sottolineare che questo metodo consente di risolvere la struttura 3D AT colorando vari marcatori per visualizzare specificamente gli adidociti, le reti neuronali e vascolari e la distribuzione innata e adattiva delle cellule immunitarie.
Introduction
L'obesità è caratterizzata da un aumento della massa dei tessuti adiposa ed è diventata un importante problema di salute pubblica in tutto il mondo, dato che le persone con obesità hanno aumentato il rischio di sviluppare malattie cardiovascolari, diabete di tipo 2, malattie epatiche e alcuni tumori.
Una funzione fisiologica fondamentale del tessuto adiposo è quella di modulare il glucosio di tutto il corpo e l'omeostasilipido 1,2. Durante il periodo di alimentazione, gli adipociti (cioè le cellule principali del tessuto adiposo) immagazzinano l'eccesso di glucosio e lipidi forniti da un pasto in trigliceridi. Durante il digiuno, gli adipociti scomporsino i trigliceridi in acidi grassi non esterificati e glicerolo per sostenere la domanda di energia del corpo. Durante lo sviluppo dell'obesità, il tessuto adiposo si espande aumentando le dimensioni (ipertrofia) e/o il numero (iperplasia) degli adipociti1, per aumentare la loro capacità di stoccaggio. Quando l'espansione del tessuto adiposo raggiunge il suo limite, una costante altamente variabile tra i pazienti, i lipidi rimanenti si accumulano in altri organi metabolici tra cui muscoli efegato 3,4, portando al loro fallimento funzionale e avviando complicazioni cardio-metaboliche legate all'obesità1,5. Pertanto, identificare i meccanismi che regolano l'espansione del tessuto adiposo è una sfida clinica chiave.
Le modifiche morfologiche documentate all'interno dei tessuti adiposo durante l'obesità sono legate alla sua disfunzione patologica. Diverse procedure di colorazione sono state utilizzate per descrivere l'organizzazione dei tessuti del tessuto adiposo, tra cui actin6, marcatori vascolari7, marcatori lipidico-droplet8e specifici marcatori di cellule immunitarie9,10. Tuttavia, a causa dell'enorme diametro degli adipociti (da 50 a 200 m)11, è essenziale analizzare gran parte dell'intero tessuto in tre dimensioni al fine di analizzare con precisione i drammatici cambiamenti strutturali di AT osservati durante l'obesità. Tuttavia, poiché la luce non penetra in un tessuto opaco, l'imaging in 3D all'interno di un grande campione di tessuto utilizzando la microscopia a fluorescenza non è possibile. I metodi di compensazione dei tessuti per renderli trasparenti sono stati riportati nella letteratura (per una revisione,vedi 12) che consente di eliminare i tessuti e di eseguire una microscopia a fluorescenza dell'intero tessuto in profondità. Questi metodi offrono opportunità senza precedenti per valutare l'organizzazione cellulare 3D in tessuti sani e mationali. Ciascuno dei metodi descritti presenta vantaggi e svantaggi e pertanto deve essere selezionato attentamente a seconda del tessuto studiato (per una revisione, vedere13). Infatti, alcuni approcci richiedono un lungo periodo di incubazione e/o l'uso di materiali o composti che sono costosi, tossici o difficili daottenere 14,15,16,17,18,19. Approfittando di uno dei primi composti utilizzati un secolo fa da Werner Spalteholz per ripulire i tessuti20, abbiamo istituito un protocollo user-friendly ed economico che è molto ben adattato per la pulizia di tutti i depositi di topi e tessuti adiposo umani in qualsiasi laboratorio con attrezzature tipiche tra cui una cappa chimica, uno shaker orbitale a temperatura controllata e un microscopio confocale.
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Protocol
Questo protocollo è stato testato ed è convalidato per tutti i depositi di tessuto adiposo bianco e topo umano. I tessuti adiposo umano e topo sono stati raccolti di conseguenza alle leggi europee e approvati dai comitati etici francesi e svedesi.
1. Fissazione del tessuto adiposo bianco e topo umano
- Immergere il topo raccolto o i tessuti adiposa bianchi umani in almeno 10 mL di PBS contenenti 4% di paraformaldeide (PFA) in un tubo di plastica da 15 mL.
- Agitare il tubo di plastica a temperatura ambiente su una piastra di rotolamento per 1 h.
- Lasciare il tubo di plastica a 4 gradi centigradi su una piastra di rotolamento durante la notte, per completare la fissazione.
NOTA: Questo protocollo è adattato per grandi campioni di tessuto adiposo, come tamponi di grasso epidididimal interi ottenuti da topi alimentati da una dieta normale (≈250 mg - ≈0,6 cm3). Per campioni più grandi come tamponi di grasso epididymal ottenuti da topi alimentati con una dieta ad alto contenuto di grassi (≈1,5 g - ≈4 cm3) o campioni di tessuto adiposo umano, anche se il protocollo di compensazione dovrebbe funzionare perfettamente per l'intero campione (aumentando il PFA e le miscele di anticorpi), in generale, tagliamo pezzi di tessuto intorno a 1 g (≈2,5 cm3) per riservare i campioni rimanenti sia per ulteriori colorazione o applicazioni. Per il PFA (punto 1.1.) si consiglia di utilizzare circa 10 volte il volume del tessuto. Per le miscele anticorpale (punti 3.1. e 3.4.), aumentare il volume per immergere completamente il tessuto e utilizzare un tubo di plastica da 15 mL (vedi Tabella dei materiali) se il tessuto è troppo grande per un microtubo di plastica da 1,5 mL (vedi Tabella dei materiali).
2. Permeabilizzazione e saturazione del tessuto adiposo bianco e topo umano
- Sciacquare il tessuto adiposo bianco fisso in 10 mL di PBS per 5 min a temperatura ambiente per rimuovere tutte le tracce di PFA.
- Immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con glicina dello 0,3% (vedi Tabella dei materiali)e agitare il tubo a temperatura ambiente in uno shaker orbitale per 1 h a 100 giri al minuto (rpm) per placare i restanti gruppi di aldeidi liberi.
- Immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100 (vedi Tabella dei Materiali)e agitare il tubo a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata per 2 h a 100 giri/min.
- Immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100 e 20% DMSO (vedi Tabella dei Materiali)e agitare il tubo a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min durante la notte.
- Immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,1% Tween-20 (vedi Tabella dei materiali),0,1% Tritone X-100, 0,1% deossicholate (vedi Tabella dei materiali) e 20% DMSO e scuotere il tubo a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per almeno 24 h.
- Sciacquare il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100 e agitare il tubo a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 100 giri/min per 1 h.
- Immergere il tessuto in un tubo di plastica di 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA (vedi Tabella dei Materiali) e scuotere il tubo a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per 12 h, per saturare qualsiasi sito che potrebbe non legare specificamente gli anticorpi.
NOTA: Al punto 2.7, il BSA può essere sostituito dal siero sanguigno delle specie dell'anticorpo secondario utilizzato.
3. Procedura di colorazione per il topo e il tessuto adiposo bianco umano
- Trasferire il tessuto in un microtubo di plastica da 1,5 mL contenente 300 L di PBS integrato con 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA e anticorpi primari (10 volte più concentrati rispetto alla colorazione della criosezione, ma la concentrazione ottimale degli anticorpi deve essere valutata per ogni anticorpo). Proteggere il tubo dalla luce coprendo con un foglio di alluminio e scuotere il tubo a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per almeno due giorni (vedere la nota al punto 1.1 e al punto 3.7.1).
- Sciacquare il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e agitare il tubo protetto dalla luce a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per 5 h. Eseguire questo passaggio due volte.
- Risciacquare il tessuto in un tubo di plastica di 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e scuotere il tubo, protetto dalla luce, a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri per una notte o due giorni.
- Trasferire il tessuto in un microtubo di plastica da 1,5 mL contenente 300 L di PBS integrato con 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA e anticorpi secondari (10 volte più concentrati rispetto alla colorazione della criosezione). Proteggere il tubo dalla luce coprendo con un foglio di alluminio e scuotere il tubo a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per almeno due giorni (vedere la nota al punto 1.1 e al punto 3.7.1).
- Sciacquare il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e agitare il tubo, protetto dalla luce, a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per 5 h. Eseguire questo passaggio due volte.
- Sciacquare il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e agitare il tubo, protetto dalla luce, a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per una notte o due giorni.
- Sciacquare il tessuto in un tubo di plastica di 15 mL contenente 10 mL di PBS e agitare il tubo, protetto dalla luce, a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per 2 h.
NOTA: per l'etichettatura di strutture specifiche come nuclei o actin, aggiungere al punto 3.1 la licazione (DAPI o equivalente) e/o il phalloidin etichettato in fluorescente. quando vengono utilizzati solo anticorpi primari etichettati in modo fluorescente, o al punto 3.4. quando vengono utilizzati anticorpi secondari.
NOTA: Per la procedura di colorazione, possono essere utilizzati anticorpi primari già coniugati con fluorocromi (come quelli utilizzati per la citometria di flusso) e lo consigliamo per il guadagno di tempo e specificità. Infatti, anche se gli anticorpi primari del topo possono essere utilizzati seguiti da anticorpi anti-topo secondari, come lo abbiamo dimostrato qui, abbiamo spesso osservato una colorazione non specifica dei vasi sanguigni a causa dell'immunoglobulina circolante. Pertanto, per evitare questo problema, gli anticorpi primari che sono già etichettati sono altamente raccomandati e qui forniamo la prova che gli anticorpi utilizzati nella citometria di flusso sono compatibili con la nostra procedura. Tuttavia, nel caso specifico di un antigene espresso a bassi livelli, è obbligatorio un passaggio di amplificazione del segnale tramite anticorpi secondari; quando l'unico anticorpo primario disponibile è fatto nel topo, una perfusione cardiaca dei topi con PBS per almeno 5 minuti al sacrificio può rimuovere una grande percentuale di immunoglobulina circolante e quindi la colorazione non specifica.
4. Procedura di compensazione per il topo e il tessuto adiposo bianco umano
- Immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di etanolo del 50% e agitare il tubo, protetto dalla luce, a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 100 giri/min per 2 h.
- Immergere il tessuto in un tubo di plastica di 15 mL contenente 10 mL di etanolo del 70% e agitare il tubo, protetto dalla luce, a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 100 giri/min per 2 h.
- Immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di etanolo del 95% e agitare il tubo, protetto dalla luce, a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 100 giri/min per 2 h.
- Immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di etanolo al 100% e agitare il tubo, protetto dalla luce, a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 100 giri/min per 2 h.
- Immergere il tessuto in un tubo di plastica di 15 mL contenente 10 mL di etanolo al 100% e agitare il tubo, protetto dalla luce, a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 100 giri/min durante la notte.
- Immergere il tessuto in una bottiglia di vetro da 20 mL con un tappo di plastica (vedi tavolo di materiali) contenente 5 mL di salicilato metile (vedi Tabella dei materiali) sotto una cappa chimica e agitare il contenitore di vetro, protetto dalla luce, a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 100 rpm per almeno 2 h.
NOTA: La procedura di compensazione potrebbe essere notevolmente accelerata (se necessario) evitando i punti 4.3. e 4,5,, anche se la qualità finale di compensazione sarebbe leggermente ridotta.
5.3D-confocale del tessuto adiposo bianco eliminato
- Trasferire il tessuto in una camera di imaging metallico dotata di fondo di vetro (vedi Tabella dei Materiali) sotto un cappuccio chimico e riempire la camera con salicilato metilo fresco.
NOTA: Per fissare il tessuto in posizione, e quindi per evitare che esso fluttua o si muove lateralmente nella camera, applicare più coperture di vetro rotondo da 18 mm (vedi Tabella dei materiali) sulla parte superiore del tessuto quando lo si monta nella camera. - Posizionare la camera di imaging su un microscopio confocale invertito.
- Immagine del tessuto utilizzando un obiettivo di basso ingrandimento (ad esempio, obiettivo 4x) per generare qualche cm3D mappe dell'intero tessuto adiposo o del campione di tessuto umano.
- Selezionare diverse aree per il campionamento del tessuto con un ingrandimento più elevato. In genere, utilizzare un obiettivo di aria lunga distanza 20 volte superiore che fornisce un buon rapporto tra risoluzione e profondità. Acquisiamo grandi immagini a mosaico con stack z tra 600 e 2000 m di profondità.
NOTA: Utilizzare un obiettivo a lunga distanza per visualizzare più in profondità nel tessuto.
6. Estrazione dei risultati quantitativi dalle immagini del tessuto adiposo 3D
NOTA: la segmentazione delle diverse strutture e la successiva estrazione delle informazioni quantitative dallo stack di immagini 3D generate nel punto 5 possono essere eseguite utilizzando una qualsiasi delle molte opzioni software di analisi delle immagini esistenti, sia commerciali che freeware. Nei punti seguenti, descriviamo una strategia che viene regolarmente utilizzata nel nostro laboratorio per estrarre informazioni quantitative da immagini di tessuto adiposo 3D utilizzando un software commerciale (vedi Tabella dei materiali).
- Convertire le pile 3D nel formato software per liberare spazio di memoria.
- Segmentare le celle.
- Aprire il modulo Cell del software.
- Modificare l'impostazione Rilevamento celle in colorazione membrana plasmatica.
- Scegliere il canale fluorescente del marcatore utilizzato per delineare la periferia cellulare (phalloidin che etichetta l'actina corticale o i marcatori di membrana plasmatica come F4/80 per il macrofago, TCR-β per le cellule T o un cluster di proteine CD di differenziazione specifiche per i sottotipi di cellule immunitarie).
- Impostare le soglie e fornire un intervallo di dimensioni di cella previste (ad esempio, da 1 a 200 m per il rilevamento delle cellule).
- Eseguire la segmentazione. Un volume corrispondente allo z-stack verrà generato con le celle segmentate codificate a colori con un colore diverso per ciascuna delle celle vicine.
- Applicare filtri statistici (dimensioni, rotondità, circolarità, ecc.) nella scheda statistica per escludere gli artefatti di segmentazione e/o per rifinire le celle segmentate alla cella di interesse in base alle loro dimensioni (cioè, 20-200 m per gli adidociti; 5-25 m per i macrofagi; 1-3 m per i linfociti).
- Estrarre le misurazioni e i dati quantitativi (volume, numero, dimensioni, diametro, ecc.) dalla scheda delle statistiche.
- Segmentare i componenti cellulari (nuclei, vesicles, ecc.) o i vasi come una struttura.
NOTA: Anche se la segmentazione del filamento è molto utile per studiare la connettività dei vasi, usiamo la segmentazione del modulo di superficie per estrarre i dati sulle dimensioni, il volume e i diametri dei vasi. Infatti, la quantificazione delle dimensioni dei vasi viene persa quando si utilizza il modulo filamenti.- Apri il modulo Superficie del software.
- Selezionare il canale fluorescente del marcatore utilizzato per etichettare in modo specifico il componente subcellulare per ricostruirlo in 3D.
- Impostare le soglie e fornire un intervallo della dimensione prevista del diametro della struttura (ad esempio, 0,5-5 m per i nuclei; 0-100 m per i vasi; ecc.).
- Eseguire la segmentazione. Verrà generato un volume con la struttura cellulare segmentata. Le misurazioni e i dati quantitativi (volume, numero, dimensione, diametro, ecc.) possono essere estratti dalla scheda delle statistiche.
- Segmentare i vasi come continuum tubolare.
NOTA: Anche se la segmentazione del filamento è molto utile per studiare la connettività dei vasi, usiamo la segmentazione del modulo di superficie per estrarre i dati sulle dimensioni, il volume e i diametri dei vasi. Infatti, la quantificazione delle dimensioni dei vasi viene persa quando si utilizza il modulo filamenti.- Aprire il modulo Filamenti del software.
- Selezionare il canale fluorescente corrispondente alla colorazione del recipiente.
- Impostare le soglie per l'intensità della fluorescenza e selezionare il numero appropriato di nodi di connessione previsti.
- Eseguire la segmentazione. I filamenti che rappresentano la rete navale saranno generati in 3D. Le misurazioni possono essere estratte dalla scheda delle statistiche, consentendo di ottenere dati quantitativi, tra cui la lunghezza della nave, il numero di ramificazioni della nave, ecc.
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Representative Results
Utilizzando la procedura descritta di seguito e riepilogata nella Figura 1, siamo stati in grado di macchiare e cancellare otticamente il tessuto adiposo bianco e umano, come illustrato nella Figura 2A e nella Figura 2B, rispettivamente. Il tessuto eliminato è stato trasferito alla camera di imaging metallico per eseguire l'imaging confocale (Figura 3A). La compensazione ha migliorato drasticamente la profondità delle immagini tisss in tessuto che siamo stati in grado di acquisire (Figura 3B e Figura 3C). L'intero tessuto adiposo può essere acquisito in 3D a basso ingrandimento utilizzando un obiettivo 4x (vedere Supplementary Movie 1), per generare una mappa 3D, consentendo di selezionare le diverse aree da acquisire ad alto ingrandimento utilizzando un obiettivo 20x (Figura 3D). Le immagini ad alto ingrandimento vengono acquisite in 3D con una profondità di 2 mm (Figura 3E).
Questa procedura consente l'etichettatura di numerosi marcatori cellulari generali, tra cui nuclei utilizzando DAPI e actin utilizzando Phalloidin fluorescentemente etichettato. La colorazione specifica delle goccioline di lipidi e degli adidociti può essere ottenuta utilizzando l'anticorpo perilipina (vedi tabella dei materiali; Figura 4A) anticorpi anti-Glut4 (c'è la tabella dei materiali; Figura 4B) Rispettivamente. I vasi sanguigni possono essere rilevati utilizzando l'anticorpo CD31 (vedi tabella dei materiali; Figura 4C) o mediante un'iniezione endovenosa di lectina-DyLight649 poco prima del sacrificio del topo (vedi tabella dei materiali; Figura 4D). I macrofagi e le cellule T possono essere visualizzati utilizzando l'anticorpo anti-CD301-PhycoErythrin (vedi tabella dei materiali; Figura 4D) e l'anticorpo anti-TCR-β-Pacific Bleu (c'è la tabella dei materiali; Figura 4E). La rete nervosa periferica può essere rilevata utilizzando l'anticorpo anti-tirosilesi (TH) (vedi tabella dei materiali; Figura 4F-G). Inoltre, questo protocollo consente la compensazione del tessuto adiposo epididymal del topo (Figura 4A-B,E), tessuto adiposo sottocutaneo del topo (Figura 4D,G), tessuto adiposo marrone topo ( Figura4F) e tessuto adiposo umano (Figura 4C). Utilizzando una combinazione di queste etichette e un software commerciale (vedi tabella dei materiali) per segmentare questi marcatori, possiamo determinare all'interno del tessuto adiposo i) adipociti mediano dimensione e dimensione distribuzione (Figura 5A-B) e ii) densità di rete dei vasi sanguigni (Figura 5C).
Figura 1: Riepilogo della procedura di compensazione per il tessuto adiposo bianco. I tessuti adiposo bianco o topo umano sono fissi, permeabili, saturi, macchiati e cancellati. Le immagini vengono poi acquisite in 3D e analizzate utilizzando un software commerciale. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fotografie di tessuto adiposo bianco. (A) Fotografia del tessuto adiposo abdominopelvico bianco umano prima e dopo la procedura di compensazione. (B) Fotografia del tessuto adiposo bianco epidididiadimale del topo prima e dopo la procedura di compensazione. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Migliorata la profondità di imaging con la compensazione del tessuto adiposo. (A) Montaggio della camera di imaging metallico dotato di fondo di vetro. (B) Immagini della serie z del tessuto adiposo bianco epididymal del topo macchiato di phalloidin-Alexa488 (verde) prima e dopo la pulizia. (C) Proiezioni X , corrispondenti alle linee tratteggiate bianche lungo il pannello B z-stack. (D) Proiezione z di 0,4 cm z-stack di topo sottocutaneo tessuto adiposo bianco macchiato per actin utilizzando Phalloidin-Alexa488 e acquisito a basso ingrandimento con un obiettivo 4x. Le piccole immagini a destra sono state acquisite nella posizione del tessuto selezionato utilizzando un obiettivo 20x. (E) Vista laterale del rendering del volume 3D dell'immagine z-stack da cancellato mouse bianco adiposo tessuto macchiato con Phalloidin-Alexa488 acquisito in modo simile alle immagini 20x da (D). La profondità di imaging 3D ottenuta dalla nostra procedura di ingrandimento elevato è dimostrata qui e sottolineata da una codifica a colori a profondità z (blu scuro per z-0 mm al rosso scuro per z-2 mm). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Tessuti adiposo bianco e mouse umano macchiati per diversi marcatori. (A) Immagine a piano singolo del tessuto adiposo bianco epididymal del topo macchiato per goccioline lipidiche utilizzando anticorpi anti-perilipin1 e anticorpo anti-mouse-alexa647-coniugato. (B) Mosaico immagine a piano singolo del tessuto adiposo bianco epididymal del topo macchiato per nuclei e adipociti utilizzando DAPI, anticorpo anti-Glut4 e anticorpo anti-mouse-alexa647-coniugato. (C) Proiezione z di 600 m z-stack di tessuto adiposo abdominopelvico bianco umano macchiato per i vasi che utilizzano anticorpi CONiugati CD31-alexa647. (D) Proiezione z di 600 m z-stack di tessuto adiposo bianco sottocutaneo del topo macchiato per vasi e macrofagi utilizzando iniezioni per via endovenosa lectina-DyLight649 e anticorpi anti-CD301-alexa555. L'interno in basso a destra è un'immagine ingrandita della casella punteggiata bianca. (E) Immagine a piano singolo del tessuto adiposo bianco epididymal del topo macchiato per le cellule actina e T utilizzando phalloidin-Alexa488 e anti-TCRβ-Pacifico blu-coniugato. L'interno in basso a destra è un'immagine ingrandita della casella punteggiata bianca. (F) Proiezione z di 50 m z-stack di tessuto adiposo marrone topo macchiato per nuclei e rete neuronale utilizzando DAPI, anticorpo anti-TH e anticorpo anti-coniglio-alexa647-coniugato. (G) Proiezione z di 600 m z-stack di tessuto adiposo bianco sottocutaneo del topo macchiato per nuclei e rete neuronale utilizzando DAPI, anticorpo anti-TH e anticorpo anti-coniglio-alexa647-coniugato. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi delle immagini 3D utilizzando software disponibile in modo commerciale (vedere tabella dei materiali). (A) rendering del volume 3D degli adidociti umani segmentati in 3D da software disponibili in modo commerciale. Ogni adipocite ha un colore diverso dai suoi adipotici adiacenti di contatto. Le navi sono rappresentate in rosso. (B) Quantificazione delle dimensioni e distribuzione degli adidociti dal rendering del volume 3D del pannello A, che contiene circa 20.000 adidociti. (C) rendering del volume 3D dei vasi sanguigni segmentati in 3D utilizzando software disponibili in modo commerciale e rappresentati in rosso o giallo rispettivamente per i vasi grandi e piccoli. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Filmato supplementare 1: rendering del volume 3D dell'intero tessuto adiposo bianco sottocutaneo mostrato nella figura 3D. La scatola bianca rappresenta un cubo di 2 cm3. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Le modifiche che si verificano all'interno del tessuto adiposo nel corso della progressione patologica, come quella dell'obesità, sono fondamentali per la comprensione dei meccanismi alla base della patologia. Studi pionieristici che hanno rivelato tali meccanismi nel tessuto adiposo sono stati basati su approcci globali come la proteomica del tessuto adiposointero 21, la citometria di flusso22,23e la trascrittomica24,25. Inoltre, sono stati compiuti sforzi per esplorare i cambiamenti strutturali che si verificano nel tessuto adiposo utilizzando analisi itologiche26,27,28,29. Tuttavia, l'analisi di sezioni di tessuto adiposo da 5 a 10 m, a causa delle dimensioni limitate della sezione, limita la capacità di apprezzare importanti caratteristiche strutturali. In primo luogo, solo pochi nuclei di adipociti sono rilevabili per sezione poiché ogni sezione rappresenta solo una piccola parte degli adidociti (1/10th). In secondo luogo, la dimensione degli adipociti stimati dalle sezioni di tessuto adiposo è imprecisa perché la maggior parte degli adipociti sono tagliati sotto o dietro il loro equatore, portando ad una misurazione di parte (sotto) della loro dimensione media. In terzo luogo, il vaso sanguigno e il continuum della fibra nervosa vengono persi durante il sezionamento fisico. In quarto luogo, la distribuzione di ogni sottotipo di cellule immunitarie all'interno del tessuto è difficile da stabilire perché le coordinate tridimensionali vengono perse. In questo contesto, la metodologia che proponiamo qui permette a qualsiasi laboratorio standard di immagine del tessuto adiposo bianco umano e topo in tre dimensioni, in modo semplice ed economico.
Questo metodo presenta alcune limitazioni. In primo luogo, il tempo necessario per preparare il tessuto (fissazione, permeabilizzazione, colorazione, compensazione) è lungo (più di una settimana). Questo sarebbe difficile da ridurre perché la maggior parte di questo tempo è necessario per macchiare il tessuto. La penetrazione di anticorpi all'interno di tali campioni di tessuto di grandi dimensioni richiede lunghi tempi di incubazione. Diminuire il tempo di incubazione aumenterebbe il rischio di avere una penetrazione anticorpale non omogenea, che porterebbe a artefatti di colorazione. Pertanto, l'unica finestra possibile per guadagnare tempo e accorciare la procedura è il tempo dedicato per cancellare il tessuto, che richiede circa un giorno quando sono necessari risultati ottimali, ma questo può essere ridotto a mezza giornata senza un drastico calo di qualità. La seconda limitazione è il probabile restringimento del tessuto. Infatti, in qualsiasi protocollo che disidrata il tessuto utilizzando solventi, è probabile che i tessuti si restringano a causa della rimozione dell'acqua. Stimare questo restringimento è sempre impegnativo, ed è quasi impossibile qui perché il bordo del tessuto diventa trasparente quando i lipidi iniziano ad essere estratti durante il processo di disidratazione. Di conseguenza, le stime delle dimensioni dei tessuti eliminati devono essere interpretate con cautela. Tuttavia, il confronto delle variazioni delle dimensioni degli adipocito o della lunghezza del recipiente tra i tessuti derivati dal topo con genotipi diversi e/o sottoposti a diverse condizioni ambientali rimaneinformativo 11. L'ultima limitazione è legata al grande volume dell'intero tessuto adiposo del topo o di un grande campione chirurgico di tessuto adiposo umano. Infatti, anche se il protocollo è perfettamente adattato per cancellare questi grandi campioni, l'imaging di un intero organo è impegnativo con un microscopio confocale. La strategia per superare questo problema e sfruttare appieno il potenziale dell'intera procedura di pulizia degli organi, è quella di acquisire una mappa di ingrandimento 3D basso dell'intero organo utilizzando un obiettivo 4x, e di selezionare aree specifiche disperse casualmente all'interno del tessuto in cui è possibile acquisire immagini 3D di ingrandimento più elevato utilizzando un obiettivo 20x a lunga distanza. La configurazione "alto ingrandimento" consente di imaging il volume del tessuto di circa 45 mm3 (4.7 x 4.7 x 2 mm). Anche se questo volume è limitato rispetto al volume dell'intero organo (da 0,5 a più di 4 cm3), ripetere le acquisizioni in diverse posizioni all'interno del tessuto ci permette di ottenere un buon campionamento del tessuto a risoluzione cellulare a subcelleletto. Si noti che l'imaging di tessuti di grandi dimensioni genererà una quantità significativa di dati di imaging che dovranno essere archiviati.
La procedura presenta differenze significative rispetto ai metodi che sono stati precedentemente descritti per cancellare il tessuto adiposo14,30. Prima di tutto, a differenza di AdipoClear, che utilizza metanolo, diclorometano e dibenzylether14, il metodo qui presentato utilizza l'etanolo per la disidratazione e il salicilato metile per la pulizia. Pertanto, la procedura è più sicura perché sfrutta i solventi di compensazione meno tossici che sono spesso utilizzati dalle industrie di trasformazione alimentare/bevande (etanolo e metilsalicylate), rispetto all'elevata tossicità di diclorometano, metanolo e dibenzylether. Inoltre, la preparazione del tessuto secondo il protocollo è di due giorni più veloce del protocollo AdipoClear14. Più di recente, un altro metodo è stato proposto da Li e colleghi per cancellare i pezzi di tessuto adiposo immergendoli nel glicerolo30. Questo protocollo è molto semplice anche rispetto a questa procedura, e la qualità delle immagini è buona anche ad alto ingrandimento. Tuttavia, questo protocollo di compensazione funziona solo in modo efficiente quando si utilizzano pezzi di tessuto adiposo 2 mm3. Il sezionamento del tessuto in questi piccoli campioni prima della procedura di compensazione impedisce di imaging volumi di tessuto superiori a 2 mm3 anche a basso ingrandimento. La procedura qui presentata consente la mappatura dell'intero tessuto in 3D a basso ingrandimento e acquisizione di pile 3D di immagini intorno a 45 mm3 in diverse posizioni note all'interno dell'intero tessuto adiposo eliminato ad alto ingrandimento.
Questa procedura può avere diverse applicazioni future. Come con qualsiasi metodo, la procedura qui descritta può essere semplificata e/o ulteriormente ottimizzata. Un interessante progresso per la procedura potrebbe venire dalla combinazione del processo di compensazione, abbiamo descritto, con ulteriori approcci di imaging. Ad esempio, configurazioni specifiche di imaging, come la tomografia a proiezione ottica (OPT), la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF), la microscopia a illuminazione del piano selettivo (SPIM) o la microscopia a esaurimento delle emissioni stimolate (STED) sono in linea di principio compatibili con la procedura, anche se ciò limiterà la sua applicabilità ai laboratori dotati di questi sistemi. In alternativa, utilizzando un obiettivo con un indice di apertura numerica elevato e un sistema di acquisizione in grado di acquisire centinaia di immagini al secondo, che si trova in molti laboratori, si potrebbe eseguire analisi super-risoluzione utilizzando il super resolution Radial Fluttuazioni (SRRF) analisi immagine post-elaborazione freeware31. È interessante notare che i fluorocroromi classici sono adattati per l'analisi SRRF, che consentirebbe analisi 3D di super-risoluzione di interi tessuti adiposa bianchi umani e topi.
Molti passaggi critici nel protocollo sono correlati all'elaborazione del tessuto prima della compensazione stessa. Prima di tutto, e per quanto riguarda le analisi istologiche classiche, la fase di fissazione è fondamentale. Nel caso di fissazione debole, le caratteristiche strutturali non vengono conservate, mentre la fissazione estesa porta al collegamento incrociato e al blocco di specifici siti di antigene e alla conseguente immuno-macchiazione non omogenea. Un altro passo sensibile è la colorazione del tessuto, che presenta diversi punti critici che descriveremo di seguito. In primo luogo, gli anticorpi devono essere convalidati testandoli su sezioni criostati per confermare che sono funzionali e per determinare la loro concentrazione ottimale. La concentrazione finale utilizzata per la procedura di compensazione è dieci volte la concentrazione ottimale per le sezioni criostati. In secondo luogo, il tempo di incubazione è anche critico a causa delle dimensioni del tessuto. Un tempo di incubazione troppo breve produrrà un'immunostaining debole o non omogenea (ad esempio, una corretta colorazione alla periferia del tessuto, ma nessuna colorazione interna). Allo stesso modo, i passaggi di lavaggio troppo brevi impediranno la rimozione di anticorpi non specificamente legati dal tessuto che porta a una colorazione non specifica. Per la nostra conoscenza, l'incubazione estesa del tessuto con anticorpi non compromette la colorazione. Pertanto, consigliamo vivamente lunghi periodi di incubazione e lavaggio. In terzo luogo, la scelta del fluorochrome deve essere adattata al segnale di interesse. Nei campioni di tessuto in generale, e in particolare nel tessuto adiposo bianco, l'auto-fluorescenza non trascurabile è rilevabile a 488 nm e 555 nm. Per le proteine altamente espresse questo non è un problema e la colorazione funzionerà bene in questi canali. Tuttavia, per le proteine con bassa espressione consigliamo vivamente l'uso di fluorocromi rossi lontani. Per la compensazione, non ci sono passi critici poiché la metodologia è molto semplice. Tenete a mente che il salicilato metile non è compatibile con i materiali plastici, quindi si consiglia bottiglie di vetro per le fasi di compensazione e una camera metallica dotata di un fondo di vetro per eseguire l'imaging. Alternative per questa procedura di montaggio esistono utilizzando i) un normale scivolo di vetro, resina dentale e coperture di vetro (per generare una piccola camera di vetro), o ii) un vetro Petri-dish (per configurazioni al microscopio verticale).
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da INSERM, Università della Costa Azzurra, e con sovvenzioni dell'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR) attraverso gli investimenti per il futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), il programma UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) tramite Academy 2 "Systèmes Complexes" e Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical ('quipe FRM DEQ201839587), e il Programma Giovani Investigatori a J.G. (ANR18-CE14-0035-01-(ANSA) - EREARON. Ringraziamo anche l'Imaging Core Facility di C3M finanziato dal Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e dalla Région PACA, e che è supportato anche dalla piattaforma IBISA Microscopy and Imaging C'tzur (MICA). Ringraziamo Marion Dussot per l'aiuto tecnico nella preparazione dei tessuti. Ringraziamo Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, per la lettura a prova del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
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