Summary
Det er nå anerkjent at det tredimensjonale cellemiljøet kan spille en viktig rolle i deres oppførsel, modning og / eller differensiering. Denne protokollen beskriver en tredimensjonal cellekulturmodell designet for å studere virkningen av fysisk inneslutning og mekaniske begrensninger på megakaryocytter.
Abstract
3D-miljøet som fører til både innesperring og mekaniske begrensninger, blir i økende grad anerkjent som en viktig determinant for celleadferd. 3D-kultur er dermed utviklet for å bedre nærme seg in vivo-situasjonen. Megakaryocytter skiller seg fra hematopoietiske stamme- og stamceller (HSPCer) i benmargen (BM). BM er et av de mykeste vevene i kroppen, begrenset inne i beinet. Beinet er dårlig utvidbart i celleskalaen, megakaryocytter blir samtidig utsatt for en svak stivhet og høy innesperring. Denne protokollen presenterer en metode for gjenoppretting av mus avledning negative (Lin-) HSPCer ved immuno-magnetisk sortering og deres differensiering i modne megakaryocytter i et 3D-medium sammensatt av metylcellulose. Metylcellulose er ikke-reaktiv mot megakaryocytter, og stivheten kan justeres til normal benmarg eller økes for å etterligne en patologisk fibrotisk marg. Prosessen for å gjenopprette megakaryocyttene for videre celleanalyser er også detaljert i protokollen. Selv om proplateletforlengelse er forhindret i 3D-miljøet, er det beskrevet nedenfor hvordan du resuspenderer megakaryocyttene i flytende medium og for å kvantifisere deres evne til å forlenge proplatelets. Megakaryocytter dyrket i 3D hydrogel har høyere kapasitet til å danne proplater sammenlignet med de som vokser i et flytende miljø. Denne 3D-kulturen tillater i) å skille forfedre mot megakaryocytter som når en høyere modningstilstand, ii) for å rekapitulere fenotyper som kan observeres in vivo, men gå ubemerket i klassiske flytende kulturer, og iii) for å studere transduksjonsveier indusert av de mekaniske signalene som tilbys av et 3D-miljø.
Introduction
Celler i kroppen opplever et komplekst 3D-mikromiljø og blir utsatt for samspillet mellom kjemiske og mekanofysiske signaler, inkludert stivhet fra vevet og innesperring på grunn av nærliggende celler og omkringliggende matrise 1,2,3. Betydningen av stivhet og innesperring for celleadferd har bare blitt anerkjent de siste tiårene. I 2006 fremhevet det banebrytende arbeidet fra Engler et al. 4 viktigheten av det mekaniske miljøet for celledifferensiering. Forfatterne viste at variasjon i cellesubstratstivhet resulterte i orientering av stamceller mot ulike differensieringslinjer. Siden da har virkningen av mekaniske signaler på celle skjebne og oppførsel blitt stadig mer anerkjent og studert. Til tross for at det er et av organismens mykeste vev, har benmargen en 3D-strukturell organisasjon som er begrenset inne i beinet. Margstivhet, selv om det er teknisk vanskelig å måle nøyaktig, anslås å ligge mellom 15 og 300 Pa 5,6. Innenfor stromaen er cellene tett begrenset til hverandre. I tillegg migrerer de fleste av dem mot sinusoidkarene for å komme inn i blodsirkulasjonen. Disse forholdene skaper ytterligere mekaniske begrensninger på tilstøtende celler, som må tilpasse seg disse kreftene. Mekaniske signaler representerer en viktig parameter hvis konsekvenser på megakaryocyttdifferensiering og proplateletformasjon nylig har blitt utforsket. Selv om megakaryocytter kan skille in vitro i tradisjonell flytende kultur, når de ikke graden av modning observert in vivo, delvis på grunn av fraværet av de mekaniske signalene fra 3D-miljøet 7. Voksende forfedre innebygd i hydrogel bringer 3D mekaniske signaler som mangler i flytende miljø.
Hydrogeler har vært mye brukt i flere tiår i det hematologiske feltet, spesielt for å dyrke celler i koloni som danner analyser for å kvantifisere hematopoietiske forfedre. Imidlertid har slike hydrogeler sjelden blitt brukt til å utforske den biologiske effekten av det 3D-mekaniske miljøet på modning og differensiering av hematopoietiske celler. I løpet av de siste årene har vårt laboratorium utviklet en 3D-kulturmodell ved hjelp av en metylcellulosebasert hydrogel 8. Denne ikke-interaktive fysiske gelen er et nyttig verktøy for å etterligne de fysiske begrensningene i det opprinnelige megakaryocyttmiljøet. Den er avledet fra cellulose ved utskifting av hydroksylrester (-OH) av metoksydgrupper (-OCH3). Både graden av metylerstatning og metylcellulosekonsentrasjonen bestemmer hydrogelstivheten når den har geleidet. Under utviklingsstadiet av denne teknikken ble det demonstrert at en Youngs modulus i området 30 til 60 Pa er den optimale gelstivheten for megakaryocyttvekst 9.
Følgende protokoll beskriver en metode for å dyrke mus megakaryocytiske forfedre i en 3D metylcellulose hydrogel. Det har tidligere vist seg at sammenlignet med standard flytende kultur, øker denne hydrogelkulturen graden av megakaryocyttpolyploidisering, forbedrer modningen og intracellulær organisasjon, og øker kapasiteten til megakaryocytter for å utvide proplatelets når de er resuspendert i et flytende medium 9. Dette manuskriptet beskriver i detalj protokollen for isolering av musebenmarg Lin- celler og deres innbygging i en metylcellulosehydrgel for 3D-kultur, samt kvantifisering av deres evne til å produsere proplatelets og utvinning av cellene for videre analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter skal utføres i samsvar med institusjonelle retningslinjer for pleie og bruk av forsøksdyr. Alle protokoller som vises i videoen ble utført i henhold til den europeiske loven og anbefalingene fra review board i Etablissement Français du Sang (EFS). En første versjon av denne protokollen ble opprinnelig publisert i 2018 i Metoder i molekylærbiologi 8.
MERK: Figur 1 viser en skjematisk visning av hele prosessen. Denne prosessen inkluderer 1) ben disseksjon, marguthenting og mekanisk isolering av margceller, 2) magnetisk sortering av avstamning negative (Lin-) celler, 3) såing i flytende eller metylcellulose hydrogel, og 4) resuspension av megakaryocytter dyrket i 3D gel for undersøkelse av proplatelet formasjon i flytende medium.
1. Bensamling fra voksne mus
MERK: I denne delen er det viktig å minimere mikrobiell kontaminering.
- Forbered et 15 ml rør for beinoppsamling med Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) som inneholder 1% av det totale volumet av penicillin-streptomycin-glutamin (PSG) antibiotikablanding (penicillin 10000 U/ml, streptomycin 100000 μg/ml og L-glutamin 29,2 mg/ml).
MERK: Hvis alle musene som brukes har samme genotype, kan du samle alle bein i samme rør som inneholder 1 ml DMEM - PSG 1% per antall mus. Antibiotika er viktig for å forhindre mulig bakterieproliferasjon i løpet av tidspunktet for beinprøvetaking. - Fyll et 50 ml rør med etanol 70% for bendesinfeksjon og et annet for skylleinstrumenter under prosedyren. Bruk steriliserte disseksjonsinstrumenter.
- Bedøv musene ved hjelp av isofluraninnånding (4%) og fortsett raskt til livmorhalsdislokasjon for å avlive musene. Senk kroppen raskt ned i 70% etanol for å desinfisere og unngå mikrobiell forurensning.
- Disseker raskt ut tibias og lårben.
- Bruk en skalpell, kutt bort epifysene på ankelsidenden for tibia og hoftesidenden for lårbenet.
- Senk beinene i ett sekund i 70% etanol før du nedsenker dem i DMEM-medium som inneholder 1% PSG.
2. Marg dissosiasjon og Lin-celler isolasjon
MERK: Denne delen av protokollen utføres under en laminær strømningshette. For en kultur er alle brønnene en del av det samme eksperimentet og kan ikke betraktes som uavhengige biologiske repliker. Cellene fra alle mus er samlet sammen for å sikre homogeniteten til alle brønnene og for å kunne sammenligne dem med hverandre samtidig som de eliminerer mulig variasjon mellom individer. For uavhengige biologiske repliker må kulturen gjentas.
- Legg beinene i en Petri-tallerken og reis dem to ganger i sterile Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) for å fjerne potensielle forurensninger.
- Forbered DMEM - 1% PSG i et 50 ml rør.
MERK: Gi 2 ml DMEM - 1% PSG per mus som brukes til eksperimentet. - Fyll en 5 ml sprøyte utstyrt med en 21-gauge nål med DMEM - 1% PSG.
- Hold beinet med tang, innfør bare nålens skråkant i knesidenden.
MERK: Knesidens epifyse skal forbli intakt fra disseksjonen, og etterlate et lite hulrom i midten for å sette inn nålen. Den gjenværende epifysen vil opprettholde beinet festet til nålen under spyling. Vær forsiktig så du ikke introduserer mer enn skråkanten i beinet, da det kan knuse og skade margen. - Trykk raskt sprøytestempelet for å skylle margen ut i et 50 ml rør.
MERK: For å unngå sprut og lette margen flush og frigjøring plasser den frie enden av beinet på rørveggen, nedsenket i DMEM - 1% PSG. I praksis er et volum mellom 500 μL og 1 ml generelt tilstrekkelig til å utvise margen fra beinet. Når margen er fullstendig utvist, har beinet blitt hvitt. I tilfelle margen ikke har blitt helt utvist fra diafysen som dømt av noen gjenværende rød farge, er det mulig å gjenta flushen med friskt medium. - Gjenta trinn 2.4. og 2,5. for alle bein, etterfylling av 5 ml sprøyten med DMEM - 1% PSG om nødvendig.
- Bruk den samme 5 ml sprøyten med 21-gauge nålen for å overføre det totale volumet av medium som inneholder spylt marg i rundbunnede 10 ml rør.
MERK: Det er ikke absolutt nødvendig å bytte til et rundt bunnet 10 ml rør, men det gjør det lettere å gå videre til følgende dissosiasjonstrinn. Ikke nøl med å bytte sprøyte og/eller kanyle hvis det mistenkes risiko for kontaminering. - Fortsett til celledissosiasjon ved å aspirere og utvise medium- og margcellene suksessivt to ganger gjennom en 21-gauge nål, tre ganger gjennom en 23-gauge og en gang gjennom en 25-gauge nål.
MERK: Unngå luftbobler, da det kan være skadelig for cellene. - Overfør suspensjonen til 15 ml rør.
- Mål cellenummer og kontroller levedyktigheten ved hjelp av en automatisert celleteller eller et cellekammer for manuell telling i nærvær av trypanblå for å utelukke døde celler.
- Sentrifuger de 15 ml rørene i 7 min ved 300 x g. Bruk en 1 ml overføringspipette, rør forsiktig ut og kast supernatanten.
- Isoler stam- og stamceller ved negativ immunomgnetisk sortering ved hjelp av et hematopoietisk celleisolasjonssett med mus.
MERK: Målet med denne cellesorteringen er å hente cellene som er negative for alle seleksjonsantistoffene (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) og derfor eliminere cellene som allerede er engasjert i en annen differensieringslinje enn den megakaryocytiske. - Etter kit instruksjonene, resuspend cellulær pellet i nylaget M medium (PBS med 2% av det endelige volumet av foster bovint serum (FBS), EDTA 1 mM) til en konsentrasjon på 1 × 108 celler / ml og distribuere suspensjonen i runde bunnede 5 ml polystyrenrør til et maksimalt volum på 2 ml.
- Legg til polystyrenrørene: normalt rotteserum i en konsentrasjon på 50 μL / ml samt den biotinylerte antistoffblandingen (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) i en konsentrasjon på 50 μL blanding per ml og homogenisere ved å flikke rørene forsiktig.
MERK: Disse antistoffene vil binde seg til celler som allerede er engasjert i en differensieringsvei bortsett fra megakaryocytisk vei. - Inkuber rørene på is i 15 min.
- Tilsett streptavidinbelagte magnetiske perler i en konsentrasjon på 75 μL/ml og homogeniser ved å flikke rørene forsiktig.
- Inkuber igjen på is i 10 min.
- Juster om nødvendig til et endelig volum på 2,5 ml per rør med M-medium.
- Homogeniser suspensjonen ved å flikke forsiktig på røret like før du plasserer dem, uten hettene, inne i en magnet og vent i tre minutter.
MERK: Cellene som allerede er engasjert i en differensieringsvei og belagt med magnetiske perler, vil bli beholdt på veggen av røret inne i magneten. - Inverter magnet og rør for å overføre rørinnholdet til et nytt rundbunnet 5 ml polystyrenrør.
MERK: Ikke ta røret ut av magneten for overføringen; det gjøres ved å invertere magneten med røret fortsatt i. Bruk en jevn bevegelse og ikke rist røret. - Kast det første røret som inneholder uønskede magnetiske celler og plasser den nye, uten hetten, i magneten i tre minutter til.
- Når du fortsetter som i trinn 2.20, overfør de isolerte Lin-cellene til et nytt 15 ml rør.
MERK: Hvis flere 5 ml polystyrenrør har blitt brukt til de forrige trinnene, kan du samle alle cellene i samme 15 ml rør. Cellene gjenvunnet etter cellesorteringen er hematopoietiske stamceller og forfedre. Tilstedeværelsen av trombopoietin (TPO), den viktigste fysiologiske regulatoren av megakaryopoiesis 10, vil lede celledifferensiering mot megakaryocytisk cellelinje. - Mål Lin-cellenummeret og levedyktigheten som i trinn 2.10.
- Beregn det nødvendige volumet av celleoppheng til sentrifugering for å ha 1 x 106 levedyktige celler x brønnnummer, brønnnummer er antall brønner til frø per tilstand.
- Forbered ett rør per tilstand med riktig volum cellefjæring og sentrifugering ved 300 x g i 7 minutter.
- For flytende kulturer, kast den supernatante og resuspend cellepelleten i komplett kulturmedium (DMEM, PSG 1% av det endelige volumet, FBS 10% av det endelige volumet, hirudin 100 U / ml, TPO 50 ng / ml) for å oppnå den endelige konsentrasjonen på 2 × 106 levedyktige celler / ml (tilsvarer 1 × 106 celler per 500 μL brønn). Inkuber cellene ved 37 °C under 5 % CO2. (= dag 0 av kultur)
MERK: Se neste avsnitt for metylcellulosekulturer Som et eksempel, for å forberede komplett kulturmedium for en brønn, bruk 435 μL DMEM, 50 μL av 100% FBS for 10% finale, 5 μL av 100% PSG for 1% finale, 5 μL av 10 000 U / ml for 100 U / ml finale og 5 μL av 5 μg / ml TPO for 50 ng / ml finale. 4-brønns eller 24-brønns kulturplater brukes vanligvis, da brønndiameteren er en god passform for 500 μL som trengs per brønn.
3. Celleinnbygging i metylcellulosehydrgel
MERK: Vær oppmerksom på at følgende protokoll beskriver metoden for å oppnå en enkelt brønn av hydrogelcellekultur, tilpasse seg antall brønner som trengs.
- Tine 1 ml aliquots av 3% metylcellulose lagerløsning ved romtemperatur. Forbered en separat ekstra aliquot metylcellulose for sprøytebelegg.
MERK: Ved en konsentrasjon på 3% forblir metylcellulose flytende ved romtemperatur (20-25 °C). - Belegge en luerlåssprøyte på 1 ml utstyrt med en 18-gauge nål med metylcellulose ved å tegne 1 ml metylcellulose fra den ekstra aliquoten. Fullstendig utvise metylcellulose.
MERK: Dette beleggtrinnet sikrer at volumet av metylcellulose som samles inn i trinn 3.3, er nøyaktig. - Med samme sprøyte og nål, men ved hjelp av en ny metylcellulose aliquot, tegn riktig volum metylcellulose (Figur 2A).
MERK: For å oppnå en endelig konsentrasjon på 2% metylcellulose i et sluttvolum på 500 μL per brønn, er det nødvendig med 333 μL 3% metylcellulose. - Fjern kanylen forsiktig. Bruk steriliserte tang til å skru en Luer-låsekontakt på enden av sprøyten (Figur 2B-C).
- Fest en ekstra, ikke-belagt luerlåssprøyte på 1 ml til Luer-låsekontakten for å koble de to sprøytene sammen (figur 2D).
MERK: Det er ikke nødvendig å belegge denne andre sprøyten. - Fordel metylcellulosevolumet likt mellom de to sprøytene (figur 2E) og legg dem til side til trinn 3.11.
- Forbered det konsentrerte DMEM-kulturmediet for å oppnå i det endelige metylcellulosevolumet (trinn 3.11) en konsentrasjon som er identisk med det ene av det flytende kulturmediet for hver forbindelse (PSG 1% av det endelige volumet, FBS 10% av det endelige volumet, hirudin 100 U / ml, TPO 50 ng / ml).
- Forbered 167 μL konsentrert kulturmedium per siste brønn på 1 × 106 celler. Dette medievolumet beregnes for å oppnå en endelig metylcellulosekonsentrasjon på 2%. Det totale volumet i brønnen vil være 500 μL (167 μL celleoppheng i konsentrert kulturmedium + 333 μL metylcellulose) og alle komponentene vil ha en konsentrasjon som er identisk med den i flytende brønner.
- For eksempel, for å forberede komplett kulturmedium for en brønn, bruk 102 μL DMEM, 50 μL av 100% FBS for 10% finale, 5 μL av 100% PSG for 1% finale, 5 μL av 10 000 U / ml for 100 U / ml finale og 5 μL av 5 μg / ml TPO for 50 ng / ml finale. Det gir et volum på 167 μL som brukes til å resuspendere cellene, og med tilsetning av 333 μL metylcellulose vil det endelige volumet være 500 μL.
- Etter å ha fullført sentrifugeringstrinnet 2,26, kast supernatanten og resuspend cellepelleten i det konsentrerte kulturmediet med et forhold på 1 × 106 celler per 167 μL.
- Ta tilbake sprøytene og koble en av dem fra kontakten.
- Pipette 167 μL av celleopphenget.
- Tilsett celleopphenget direkte i sprøytekontakten (Figur 2F), og pass på at du ikke introduserer luftbobler.
MERK: Mens du legger til celleopphenget, tegner du sprøytestempeet langsomt samtidig for å frigjøre plass til celleopphenget. - Koble forsiktig til de to sprøytene (figur 2G) uten å miste suspensjon i skruegjengen.
MERK: Før du kobler til igjen, tegn stempelet for å la kontakten være halvtom og la det være nok plass til at den andre sprøyten kan kobles til uten at suspensjonen flyter over. - Homogeniser metylcellulosemediet langsomt med celleopphenget med ti frem og tilbake stempelbevegelser mellom de to sprøytene (figur 2H).
- Trekk det totale volumet i en sprøyte og koble fra de to sprøytene, og la kontakten stå på den tomme.
- Tøm innholdet i sprøyten i en brønn på en 4-brønnsplate (Figur 2I).
- Inkuber cellene ved 37 °C under 5 % CO2 (= kulturdag 0).
MERK: Det er mulig å tilberede to metylcellulosebrønner med ett par sprøyter. Øk med to volumet av metylcellulose og volumet av celle suspensjon å ha 2 x106 celler. Etter å ha fullført trinn 3.13. fordel volumet likt mellom de to sprøytene for å ha 500 μL i hver av dem. Koble dem fra og tøm den uten kontakten i en kulturbrønn. Koble sprøytene til igjen for å overføre volumet fra den som holdt kontakten til den andre. Koble fra sprøytene, den med 500 μL bør ikke ha kontakten festet, og frø cellene i en annen kulturbrønn. Metylcellulosen på 3 % kjøpes som lagerløsning i Iscoves Modified Dulbecco's Medium (IMDM) mens konsentrerte celler suspenderes i DMEM. Komparative tester har i utgangspunktet blitt gjort for å sikre at dette blandede mediet ikke hadde noen innvirkning på utfallet av eksperimentet, spesielt sammenlignet med væskekulturen i 100% DMEM.
4. Celle resuspension for proplatelet analyse
MERK: Analyse av kapasiteten til å danne proplatelets må utføres under sammenlignbare forhold mellom væske og metylcellulose dyrkede megakaryocytter. De fysiske begrensningene som utøves av metylcellulosehydrgel hemmer proplatelet forlengelse. Derfor blir metylcellulosevoksne celler resuspendert i friskt flytende medium på dag 3 av kulturen slik at de kan utvide proplatelets. Metylcellulose hydrogel er en fysisk hydrogel som lett fortynnes ved flytende medium tilsetning. Viktig, for å unngå artefakter fra resuspension og sentrifugering, må celler i kontrollvæske middels tilstand behandles samtidig på samme måte som metylcellulosevoksne celler. Se den skjematiske representasjonen av eksperimentet (figur 1).
- Forbered 10 ml DMEM - 1% PSG forvarmet ved 37 °C i et 15 ml rør for hver brønn å resuspendere.
- Forsiktig resuspend cellene fra hver brønn i 10 ml DMEM - 1% PSG.
MERK: Gjør forsiktig flere opp-og-ned-bevegelser for å fortynne metylcellulosen helt. For væskebrønnene må du samle alle cellene som er avsatt på bunnen av brønnen. - Sentrifuger rørene 5 min ved 300 × g.
- I mellomtiden forberede komplett kultur medium (DMEM, PSG 1% av det endelige volumet, FBS 10% av det endelige volumet, hirudin 100 U / ml, TPO 50 ng / ml).
MERK: På dette trinnet hentes hver brønn for å fortynnes med halvparten, og forbereder derfor 1 ml komplett kulturmedium per brønn. - Kast supernatanten og resuspend cellepellet i 1 ml kulturmedium for hvert rør.
- Reseed 500 μL celle suspensjon per brønn i en 4 eller 24-brønns plate og inkubere ved 37 °C under 5% CO2.
MERK: Fra en innledende brønn, få 2 brønner for proplatelet visualisering i duplikat. Vær oppmerksom på at siden disse duplikatene stammer fra samme eksempel, kan de ikke betraktes som uavhengige replikeringer. - 24 timer etter reseeding, på dag 4 av kulturen, tilfeldig skaffe 10 bilder per brønn ved hjelp av bright field mikroskopi og 20× mål.
MERK: Cellene har en tendens til å gruppere i midten av brønnen, sørg for ikke å ha for mange celler på feltet, da det kan gjøre proplatelet visualisering og kvantifisering vanskelig. Sørg for å fange minst 5 megakaryocytter per felt. - Tell totalt antall megakaryocytter og megakaryocytter som utvider proplatelets i hvert bilde og beregne andelen megakaryocytter som utvider proplatelets.
MERK: Kvantifiseringen er ikke automatisert; utføre celletelling manuelt. Telling kan forenkles ved bruk av celleteller-plugin av ImageJ for å klikke på cellene for å markere dem når de telles. 10 felt ervervet per brønn og brønner i duplikat representerer om lag 150-300 megakaryocytter per tilstand.
5. Cellefiksering og gjenfinning for fremtidige analyser
FORSIKTIG: Denne protokollen bruker festemidler som må håndteres under en avtrekkshette, iført verneutstyr.
MERK: Målet er å opprettholde de intakte gelbegrensningene som påføres cellene til de er helt festet. Derfor, og uavhengig av det fixative som brukes, må det legges i brønnen på toppen av metylcellulose, uten å forstyrre gelen. Den samme protokollen brukes på flytende kulturer.
- Tilsett et volum fikseringsløsning lik frøvolumet (500 μL i denne protokollen), på toppen av metylcellulosen uten å forstyrre gelen. Vent til riktig tid i henhold til fikseringsmiddelet som brukes (minst 10 min).
MERK: Den fixative diffusjonen gjennom gelen skal være veldig rask som avslørt av en rask endring i gelfargen (fra rosa til en gul-oransje nyanse). Paraformaldehyd (8% i DPBS, 500 μL per brønn) brukes vanligvis til immunisolering, mens glutaraldhehyd (5% i kaktokylatbuffer, 500 μL per brønn) brukes til elektronmikroskopianalyse. - Bruk en P1000 pipette forsiktig gjøre flere opp-og-ned pipetter med fixative og gel for å homogent fortynne metylcellulose.
- Bruk samme pipette og spiss, overfør alt volumet fra brønnen til et 15 ml rør som inneholder 10 ml DPBS og homogeniser.
- Sentrifuger blandingen ved 300 × g i 7 min.
MERK: Et nytt vasketrinn kan være nødvendig for å eliminere alle metylcellulose - Kast den supernatante og resuspend megakaryocyttpellet i riktig medium i henhold til ønsket analyse (immunisolering, strømningscytometri9, elektronmikroskopi ...) (for elektronmikroskopi se også papirmetoden "In situ-utforskning av de viktigste trinnene i megakaryopoiesis ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi" i dette JoVE-problemet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data innhentet ved hjelp av denne protokollen ble opprinnelig publisert i Blood i 20169.
I henhold til protokollen ble cellene sådd i enten flytende eller metylcellulose hydrogelmedium. Celler i flytende medium har alle sedimentert på bunnen av brønnen, i kontakt med den stive plastoverflaten og en gang med andre celler. I motsetning distribueres celler innebygd i metylcellulosehydrgel homogent i gelen og isoleres fra nærliggende celler (Figur 3A). Metylcellulosegel ved en endelig konsentrasjon på 2% øker veldig litt gjennomsnittlig megakaryocyttdiameter sammenlignet med væskekulturen (Figur 3B), i samsvar med den høyere rapporterte ploidy9. Til sammenligning svekker økende metylcellulosekonsentrasjon med 0,5% megakaryocyttdifferensiering som vist med en mindre gjennomsnittlig diameter (Figur 3B).
En merkbar forskjell i megakaryocytt ultrastruktur observeres mellom megakaryocytter differensiert i flytende kultur og de differensierte in vivo i benmargen. Et karakteristisk trekk ved modne megakaryocytter er et komplekst intracytoplasmisk membrannettverk, DMS (Avgrensningsmembransystemet) som fungerer som et reservoar for membranen til fremtidige blodplater. I modne megakaryocytter organiserer DMS å danne sammenflettede membranplater som opptar det meste av cytoplasma. Ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM) ser de ut til å være tett apposert og avgrense cytoplasmiske territorier (Figur 3C øvre panel) (for TEM-prosedyren, se papirmetoden "In situ-utforskning av de viktigste trinnene i megakaryopoiesis ved hjelp av overføringselektronmikroskopi" i samme JOVE-utgave). I flytende kultur har DMS-membraner for det meste utseendet på små runde, ovale eller langstrakte vesikler uten avgrensning av cytoplasmiske territorier (figur 3C midtpanel). Til sammenligning fremmer 2% metylcellulosekultur organiseringen av DMS i et flertall av megakaryocytter, med membraner tett apposert og avgrense cytoplasmiske territorier, som ligner den som ligner den som er in situ (Figur 3C nedre panel). Dette resultatet indikerer at den 2% metylcellulose hydrogelkulturen gir bedre megakaryocyttdifferensiering på grunn av miljømediets mekaniske begrensninger.
Etter celleoverføring til flytende medium på dag 3 begynner megakaryocytter å forlenge proplater etter 4 h 9. Figur 4 viser kvantifiseringen av andelen megakaryocytter som har utvidede proplater 24 timer etter resuspension i flytende miljø. Ti bilder ble tilfeldig anskaffet per brønn, ved hjelp av lysfeltmikroskopi og 20× målet (figur 4A). Kvantifiseringen ble utført blindt og manuelt ved hjelp av celleteller-plugin på Fiji (ImageJ) (Figur 4B). Fordi dette er primærcellekulturer, er det en variasjon mellom eksperimentene, men protokollen forblir robust og gir en god reproduserbarhet. I flytende prekulturtilstand bør proplatelet-andelen være mellom 10% og 20%, mens denne andelen dobles for hydrogelforkulturen.
Figur 1. Skjematisk representasjon av hele prosessen. Bein dissekeres ut, margen skylles ut og cellene mekanisk dissosieres. Stam- og stamceller av interesse (Lin-celler) er isolert av en immunomgnetisk negativ sorteringsprosedyre og frø i enten flytende eller hydrogelmedium (dag 0). På dag 3 av kulturen (som totalt representerer en varighet på 4 dager), blir begge forholdene resuspendert i separate friske flytende kulturmiljø. Dette andre kultiveringstrinnet utføres fra dag 3 til dag 4 av kulturen. Andelen MKs som utvider proplatelets måles på dag 4 av kulturen. For visuell klarhet er en celle skjemaertisert per brønn. Den blå sirkelen viser en enkelt celle med kjernen i lilla. I det siste trinnet er begge MK-ene representert med proplatelet. Andelen MKs som danner proplater varierer avhengig av væske eller metylcellulose prekultur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Celleinnbygging i metylcellulosehydrgel. Etter prebelegg sprøyteveggen, (A) tegne riktig volum av metylcellulose; (B, C) koble fra kanylen og skru en kontakt på sprøyten; (D) skyv metylcellulosen halvveis gjennom kontakten og fest en ny sprøyte. (E) fordele like mye metylcellulose mellom de to sprøytene og koble dem fra; (F) legg til celleopphenget i sprøyten som bærer kontakten. (G) koble til de to sprøytene igjen. (H) homogenisere ved å skyve hele volumet fra en sprøyte til den andre noen ganger; (I) frø cellene ved å utvise hele volumet i en kulturrett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Megakaryocyttegenskaper i henhold til kulturtilstand. (A) Representative bilder av megakaryocytter på dag 3 av kulturen i væske (venstre panel) eller 2% metylcellulose hydrogel medium (høyre panel). Skalastang = 50 μm (B) Gjennomsnittlig diameter på megakaryocytter dyrket i flytende medium, eller i 2% eller 2,5% metylcellulose hydrogel. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD i 3 uavhengige kulturer, med totalt minst 100 megakaryocytter undersøkt. *, P<0,05, ***P < 0,0001, ved hjelp av 1-veis variansanalyse (ANOVA) med Bonferronis multisammenligningstest. (graf tilpasset fra Aguilar et al. 2016) (C) Skjematisk visning (venstre) og representative elektroniske mikroskopi bilder (midten) av murine megakaryocytter; høyre paneler, nærbilder fra de hvite firkantene (skalalinje = 5 μm for de midterste elektroniske mikroskopibildene og 2 μm for nærbilder). Øvre paneler er in situ megakaryocytter, midten representerer megakaryocytter dyrket in vitro i flytende kultur og nedre paneler er megakaryocytter dyrket i 3D metylcellulose hydrogel. Disse dataene ble opprinnelig publisert i Blood Journal, DOI10.1007/978-1-4939-8585-2_95. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Representative resultater av proplatelet kvantifisering. (A) representative bilder av megakaryocytter på dag 4 av kulturen. Celler ble inkubert tre dager i væske (venstre) eller 2% metylcellulose hydrogel medium (høyre) etterfulgt av en dag med resuspension i flytende medium. Svarte piler indikerer megakaryocytter som utvider proplatelets. (Skalastang = 50 μm). (B) Representative kvantifiseringsdata for proplateletformasjonen. Proplateletformasjon kvantifisert på dag 4 for megakaryocytter som tidligere var prekulturert fra dag 0 til dag 3 i væske eller 2% metylcellulose hydrogel medium. Resultatene uttrykkes som% av megakaryocytter som utvider proplatelets (gjennomsnittlig ± SD) og er fra 3 uavhengige eksperimenter, med et totalt antall megakaryocytter undersøkt per tilstand >750 (t-test, p = 0,0023). Gjennomsnittlig andel megakaryocytter som forlenger proplater er 16% i flytende tilstand og 39% for metylcellulose hydrogel prekultur. Dette resultatet tilsvarer den tidligere demonstrerte og publiserte effekten av hydrogelprekultur som øker proplateletformasjonen sammenlignet med væsketilstanden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det forrige tiåret har mekanobiologi økt mer og mer interesse for mange områder av biologi. Det er nå ofte anerkjent at det mekaniske miljøet rundt cellene spiller en rolle i deres oppførsel, og understreker viktigheten av å studere hvordan megakaryocytter sanser og reagerer på ekstracellulære mekaniske signaler. Det er utfordrende å nøyaktig måle stivheten i benmargsvevet in situ11, spesielt hvis vi vurderer den hematopoietiske røde margen som den ligger inne i trabekulære bein i store pattedyr, mens den lettere tilgjengelige margen fra diafysen i hovedsak består av adipocytter (gul marg)12. I tilfelle av en isolert marg fra mus, hvor diafyse inneholder i hovedsak rød marg, er et annet problem at vevet, når det er ekstrahert fra beinet, ikke forblir sammenhengende. Imidlertid klarte Shin og samarbeidspartnere å måle musdiafysemargsstivhet ved hjelp av atomkraftmikroskopi og fant en verdi avE-marg = 0,3 ± 0,1 kPa, som plasserer margen blant de mykeste vevene6.
Interessen for prosedyren som er beskrevet her er å sammenligne megakaryocytt oppførsel i flytende medium med det i hydrogelen. I flytende miljø har cellene alle sedimentert på bunnen av brønnen, i kontakt med den stive plastoverflaten og en gang med andre celler. I motsetning distribueres celler innebygd i metylcellulosehydrgel homogent i gelen og er helt isolert fra de andre cellene (Figur 3A). Derfor sendes de i hovedsak til mekaniske signaler levert av innesperringen, unntatt jukstakrinkommunikasjon. Paracrine stimulering kan ikke utelukkes helt. Likevel er cellene innebygd i metylcellulosehydrgel fjernt fra hverandre i motsetning til situasjonen i benmargen, og vi kan dermed anta at hvis utskilte stoffer når nærliggende celler, kan de bli svært fortynnet.
Metoden er enkel å definere og krever ikke bestemte ferdigheter. Metylcellulose er en fysisk gel hvis polymerkjeder danner ikke-kovalente krysskoblinger. Å være flytende ved lav temperatur, jellifies når du øker temperaturen (vennligst se artikkelen fra Aguilar et al. 20169 for mer informasjon om karakterisering av gelens mekaniske egenskaper). Denne geltilstanden kan enkelt reverseres etter fortynning i vandig løsning, noe som muliggjør en enkel gjenoppretting av cellene, enten det er festet i gel eller som levende celler.
En kritisk faktor her er hydrogelens stivhet. Riktig metylcellulosevolum bør dispenseres veldig nøyaktig, da selv en liten endring i hydrogelkonsentrasjonen kan ha en viktig innvirkning på miljøets stivhet og derfor på megakaryocyttmodning. For eksempel ble det tidligere vist at økende metylcellulosekonsentrasjon fra 2 til 2,5% økt gelstivhet (Youngs modulus) med 10 ganger. En mulig fallgruve er at det ikke er lett kvalitetskontroll for å verifisere nøyaktige reologiske egenskaper til metylcellulosen i hver eksperimentelle brønn når den er sådd med celler. Likevel er et viktig kriterium som vil berolige om en riktig gelkonsentrasjon riktig modning av megakaryocyttene i hydrogelen, noe som gjenspeiles av deres store størrelse omtrent lik den i flytende medium. En reduksjon i gjennomsnittlig diameter kan gjenspeile en defekt differensiering som ligner på det som oppstår når du øker stivheten med 2,5% metylcellulose (Figur 3B).
En annen begrensning ved metoden er at cellegjenvinning fra hydrogelen tar mer tid enn i den klassiske kulturen, da det er nødvendig å først fortynne gelen før sentrifugering. Hvis metylcellulose må fjernes helt, for eksempel for å få cellelysat for videre vestlig blot eller RNA-isolasjonsprosedyre, kan det være nødvendig med et ekstra vasketrinn, i løpet av hvilken tid modifikasjoner kan forekomme i proteiner eller RNA (proteindefosforylering, RNA-nedbrytning ...).
Et kritisk punkt å vurdere i prosedyren er celleantallet som må være likt under hver tilstand. Dette er ikke så trivielt siden i væskekulturen har celler en tendens til å sediment på bunnen av brønnen, og noen av dem holder seg på plastoverflaten, noe som ikke er tilfelle for celler i suspensjon i hydrogel. En fallgruve er en ufullstendig samling av cellene i flytende tilstand, noe som resulterer i et annet celleinnhold mellom "væske" og "hydrogel" tilstand etter suspensjon i flytende medium på dag 3. En slik forskjell kan føre til avvik i de endelige dataene. Som et kontrollpunkt kan en cellenummerering gjøres på dette stadiet før du sender cellene på nytt. Det er å foretrekke å gjøre det manuelt ved hjelp av et Nageotte hemocytometer, da det er spesielt hensiktsmessig for større celler som megakaryocytter.
Når det gjelder primærcellekultur, er det en mulig risiko for forurensning. Forurensning er den mest sannsynlige forklaringen på en uvanlig lav proplatelet andel i metylcellulose pre-kultur tilstand, da en liten forurensning synes vanskeligere å oppdage enn i flytende medium. Derfor kan det gå ubemerket til proplatelet kvantifisering, noe som fører til villedende resultater. God laboratoriepraksis må overholdes nøye, spesielt under metylcellulosecelleinnkapsling som krever mange og presise manipulasjoner av sprøyter og kontakter. Megakaryocytt levedyktigheten bør også kontrolleres med Trypan blå ved hjelp av et Nageotte cellekammer for manuell telling før du sender på nytt på dag 3.
Samlet sett beskriver protokollen her en in vitro-modell for sammenligning mellom klassisk flytende kultur og en 3D-kultur ved hjelp av metylcellulosehydrgel. Vær oppmerksom på at denne kulturprotokollen er beskrevet for musens primære Lin- celler og har ennå ikke blitt tilpasset menneskelige celler. Denne 3D-modellen er et nyttig verktøy for å undersøke virkningen av det mekaniske miljøet på megakaryocytt oppførsel og modning9. Det er også mulig å legge til forbindelser i kulturen (selv på gelen) for å studere påvirkning av legemidler på megakaryocytt oppførsel / modning og proplateletdannelse. Til slutt, ved å reprodusere de mekaniske begrensningene som celler kan støte på i benmargen, tillater dette kultursystemet undersøkelse av unormale fenotyper som ikke kunne observeres i klassiske flytende kulturer som tidligere vist for Myh9 knockout megakaryocytter9,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Fabien Pertuy og Alicia Aguilar som først utviklet denne teknikken i laboratoriet, samt Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Strasbourg) som karakteriserte de viskoelastiske egenskapene til metylcellulosehydrgelen. Dette arbeidet ble støttet av ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) og av et ARN-stipend (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher er mottaker fra Fondation pour la Recherche Médicale (FRM tilskuddsnummer FDT202012010422).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K.
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R.
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
