Summary
이 프로토콜은 결정성 나노셀룰로오스(CNC)/아가로즈 복합 하이드로겔 생체재료 잉크를 마우스 골수 유래 마스트 세포와 함께 세포 표면 수용체의 세포 생존성 및 표현성 발현, 키트(CD117) 및 고친화도 이에 수용체(FcθRI)의 생체 적합성을 신속하게 평가하는 방법을 강조한다.
Abstract
3차원(3D) 바이오프린팅은 패턴으로 증착되는 하이드로겔 기반 복합체(또는 생체재료 잉크)를 활용하여 어떤 세포가 증착되는지기판으로 형성한다. 많은 생체 재료 잉크는 잠재적으로 1 차 세포에 세포 독성이 될 수 있기 때문에, 비용이 많이 드는 3D 조직 엔지니어링 프로세스에서 그들의 활용 하기 전에 이러한 하이드로겔 복합체의 생체 적합성을 결정 하는 데 필요한. 바이오프린팅을 포함한 일부 3D 배양 방법은 세포가 3D 매트릭스에 내장되어 기계적 손상을 유도하지 않고 생존력 및 바이오마커 발현의 변화를 추출하고 분석하기 어렵게 만듭니다. 이 프로토콜은 개념증명으로서, 결정성 나노셀룰로오스(CNC) 내장아가로즈 복합체의 생체 적합성을 평가하는 방법으로, 24웰 배양 시스템으로 제조되었으며, 마우스 골수 유래 마스트 세포(BMMC)는 세포 생존가능성 및 바이오마커 발현에 대한 유동 세포측정 분석법을 사용하여 한다.
CNC/아가로즈/D-매니톨 매트릭스에 18h의 노출 후, BMMC 생존력은 프로피듐 요오드(PI) 투과성에 의해 측정된 바와 같이 변경되지 않았습니다. 그러나, CNC/아가로즈/D-mannitol 기판상에서 배양된 BMMCs는 고친화 IgE 수용체(FcθRI) 및 줄기 세포 인자 수용체(Kit; CD117), 이는 바이오잉크 복합체에서 CNC의 양에 의존하는 것으로 보이지 는 않지만. BMMC의 생존가능성은 또한 3D 압출 바이오 프린터를 사용하여 피릴라 나노 셀룰로오스 (FNC)와 나트륨 알기네이트로 구성된 상업용 생체 재료 잉크에서 제조 된 하이드로겔 스캐폴드에 시간 과정 노출 에 따라 평가되었다. 6-48h의 기간 동안, FNC/alginate 기판은 유동 세포측정및 미세titer 분석(XTT 및 젖산 탈수소효소)에 의해 결정된 바와 같이 BMMC의 생존가능성에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 이 프로토콜은 마스트 세포와의 포스트 인쇄 시드를 위한 3D 스캐폴드로 유틸리티에 대한 후보 생체 재료 잉크의 생화학적 호환성을 신속하게 선별하는 효율적인 방법을 설명합니다.
Introduction
최근 3D 배양 시스템과 3D 바이오프린팅에 대한 관심은 하이드로겔 과 하이드로겔 복합재에 주목하고 있습니다. 이러한 복합체는 점성 아직 다공성 생물미약제의 역할을 하며 생물학적 조직에 필적하는 중량별 최대 99%의 수분 함량으로 구성될 수 있다1,2,3. 하이드로겔 복합재의 이러한 특징은 생존력과 기능에 영향을 미치지 않으면서 세포의 성장을 허용합니다. 이러한 복합체중 하나는 하이드로겔 복합재, 세포 스캐폴드, 2차원(2D) 및 체외세포 배양에서 보강재료로 사용되어 온 결정성 나노셀룰로오스(CNC)이다4,5. 대부분의 경우, CNC로 구성된 행렬은 인간 각막 상피 세포6, 장 상피 세포7, 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포8 또는 뉴런과 같은 세포9에 지나치게 세포독성이 없습니다. 그러나, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 대사 활동 및 증식은 목재 계 나노셀룰로오스 복합체의 점도와 상관관계가 감소하며, 매트릭스의 조성물은 세포 기능에 대한 해로운 영향에 대해 신중하게 테스트되어야 함을 시사한다8.
유사하게, CNC는 3D 면역 세포 배양 체계에 있는 심각한 결과를 초래할 수 있던 내화시 대식세포에 있는 선동적인 반응을 유도할 수 있습니다10,11. 사실, CNC가 다른 면역 세포 반응, 특히 비만 세포에 의해 시작되는 알레르기 성 염증 반응에 영향을 미칠 수있는 방법에 사용할 수있는 데이터가 거의 없습니다. 마스트 세포는 알레르겐에 염증 반응을 활성화하는 책임이 있는 높은 친화성 IgE 수용체, FceRI를 표현하는 과립백구체입니다. 그들의 증식 및 분화는 의존형 줄기 세포 인자 (SCF), 티로신 수용체를 결합, 키트. 마스트 세포는 혈액 순환을 입력하고 이후에 모든 인간 조직에서 유비쿼터스로 분산하기 위해 말초로 이동하는 골수 전구 세포에서 파생됩니다12. 비만 세포는 3D 조직 환경에서 기능하기 때문에 체외 3D 조직 모델에서 면역 학적 과정을 연구하기위한 이상적인 면역 세포 후보입니다. 그러나, 현재까지, 비만 세포를 포함하는 시험관 내 3D 조직 모형에는 실행 가능한 없습니다.
유방 세포의 매우 민감한 특성과 외부 자극에 대한 염증 반응을 유도하는 성향으로 인해 3D 매트릭스 성분과 3D 스캐폴드로 마스트 세포를 도입하는 생체 인쇄 방법을 신중하게 고려해야 합니다. 조직 구조는 생체 재료, 즉 바이오 잉크 및 생체 재료 잉크의 두 가지 범주에서 생체 제작 될 수 있습니다. 바이오잉크는 세포가 함유된 하이드로겔 복합재이며, 생체 재료 잉크는 Groll et al.13,14에 의해 정의된 바와 같이 세포가 없는 하이드로겔 복합재라는 사실에 있습니다. 따라서 바이오잉크로 인쇄된 3D 구조에는 하이드로겔 매트릭스 내에 미리 내장된 셀이 포함되어 있는 반면, 생체 재료 잉크로 인쇄된 3D 구조는 포스트 프린팅 셀로 시드되어야 합니다. 하이드로겔 기반 바이오 잉크/생체 재료 잉크로부터의 배양 스캐폴드의 생체 제작은 압출 3D 바이오 프린터를 사용하여 가장 일반적으로 수행되며, 이는 공압 또는 기계적 으로 구동되는 피스톤14를 통해 압력을 받는 마이크로 스케일 노즐을 통해 바이오잉크/생체 재료 잉크를 압다하는 것입니다. 압출 바이오 프린터는 '상향식' 접근법으로 서로 순차적으로 쌓인 2D 단면 패턴으로 바이오잉크를 증착하여 3D 스캐폴드를 제작합니다.
압출 바이오프린팅과 호환되려면 하이드로겔 기반 바이오잉크/바이오머티리얼 잉크는 티조트로픽(전단-숱이) 특성을 소지해야 하며, 이에 따라 전단 응력을 받을 때 마이크로채널 노즐을 통해 유체와 같은 생체잉크/생체재료 잉크의 성분 하이드로겔 폴리머가 구약, 젤과 같은 상태로 되돌릴 수 있으나, 전단 응력의 제거 시 젤과 같은 상태로 되돌아갑니다. . 수분 함량이 높기 때문에 하이드로겔 기반 바이오잉크/생체 재료 잉크의 폴리머는 3D 생체 인쇄 구조의 아키텍처 및 구조적 무결성을 유지하기 위해 물리적으로 또는 동적으로 교차연결되어야 합니다. 세포가 함유된 바이오잉크의 경우, 세포는 교차 연결 과정에서 화학적 스트레스를 직접 받습니다. 바이오잉크 하이드로겔 매트릭스 내에 캡슐화된 세포를 압출하는 과정은 또한 세포를 전단 응고하여 생존가능성 및/또는 세포 사멸을 감소시킬 수 있다. 일단 3D 조직 모형이 생체 인쇄되면, 하이드로겔 매트릭스 자체및 압출 및 교차 연결 프로세스에 의해 유도된 세포 독성의 수준을 구별하기 어렵다. 이것은 세포가 하이드로겔 매트릭스 안에 미리 내장되어 있는 3D 스캐폴드의 맥락에서 특히 도전적입니다, 따라서 마스트 세포의 생존에 해악할 것이다 후속 분석을 위한 세포를 제거하는 것을 어렵게 만듭니다.
마스트 세포를 포함하는 3D 조직 구조물을 생성하는 온화한 접근은 세포 배양 정지에서 미리 인쇄된, 다공성 생물 물질 잉크 3D 발판으로 세포를 종착하는 것을 관련시킵니다, 이는 말모 세포의 타고난 능력을 활용하여 말초 조직으로 순환에서 이동하는 것을 관련시킵니다. 이 세포 파종 접근법의 장점은 두 배입니다: (i) 마스트 세포는 압출 및 교차 연결 공정으로부터 전단 및 화학적 스트레스를 각각 받지 않으며, (ii) 세포는 그들의 생존가능성에 악영향을 미치지 않고 분석을 위해 부드럽게 세척하여 노출 후 3D 스캐폴드에서 쉽게 제거될 수 있다. 2D 하이드로겔 디스크가 아닌 3D 생체 인쇄, 다공성 하이드로겔 스캐폴드에서 돛대 세포의 세포 생존가능성을 파종하고 분석하는 추가적인 이점은 3D 바이오프린트 하이드로겔 스캐폴드가 대량으로 존재하지 않는 생체 내 조직의 미세 스케일 지형 특징을 회수한다는 것입니다. 이 접근법은 비용이 많이 드는 3D 조직 공학 실험에 투자하기 전에 마스트 세포뿐만 아니라 다른 면역 세포에 대한 후보 생잉크 하이드로겔 행렬의 잠재적으로 치명적인 세포 독성 효과를 결정하는 적당하고 빠르며 비용 효율적인 접근 방식입니다.
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Protocol
참고: 본 프로토콜은 마우스 골수의 분리와 마우스 골수 유래 마스트 세포(BMMC)의 분화, (2) CNC/아가로즈/D-mannitol 하이드로겔기질의 제조, 기판에 대한 BMMC의 24웰 시스템 및 배양, (3) CNC/아가로즈/D-mannitol 하이드로겔 기판으로부터 BMMC제거 및 유동 세포측정을 이용한 생존가능성 및 바이오마커 발현의 분석, (4) 상용 피브릴라 나노셀룰로오스(FNC)/나트륨 알기네이트 복합 생체 재료 잉크로부터 의 3D 바이오프린팅및 FNC/나트륨 알기네이트 하이드로겔 스캐폴드및 유동 세포측정, XTT, 락테이트 탈수소(LDH)를 이용한 생존가능성 분석(LDH)의 BMMC 배양
1. BMMC 문화의 세대
참고: 마우스는 이소플루란 마취 다음 CO2 질식에 의해 안락사되었다. 경골과 대퇴골은 고립되었고, 골수 전체를 수확했습니다. 모든 동물 연구는 알버타 대학의 건강 과학 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 캐나다 동물 관리 지침 및 정책에 대한 캐나다 위원회에 따라 수행되었습니다.
- 표 1에 나열된 보충제를 표시된 최종 농도에 추가하여 완전한 RPMI-1640 배양 배지를 준비하십시오. NaOH를 사용하여 중간의 pH를 7.4-7.6으로 조정하고, 일회용 병 상단 필터(0.2 μm 모공 크기)를 사용하여 필터 멸균하고, 최대 2개월 동안 어둠 속에서 4°C에 보관한다.
- 지역 대학 동물 관리 위원회 프로토콜 및 절차에 따라 마우스에서 대퇴골을 얻을.
참고: 이 연구에서는 대퇴골이 C57BL/6 마우스로부터 분리되었지만 연구와 관련이 있는 경우 어떤 균주도 사용할 수 있습니다. - 가위를 사용하여 엉덩이 관절에서 피부와 근육을 제거한 다음 엉덩이 소켓에서 약간 비틀어 대퇴골을 부드럽게 당깁니다(그림 1). 대퇴머리를 부러뜨리지 않도록 주의하십시오. 가위를 사용하여 내측 파벨라에서 대퇴골에서 경골을 잘라냅니다. 칼세음 바로 위에 절단하여 발을 제거하고 폐기합니다.
- 메스를 사용하여 대퇴골과 경골 조각에서 피부와 연골을 제거합니다. 가위를 사용하여 대퇴골과 경골의 양쪽 끝에 깨끗한 절단을하여 붉은 골수를 노출시십시오. 필요한 경우, 이 시점에서 비골을 제거하지만 골수 홍조 중 경골 조작에 도움이 될 수 있습니다.
- 5mL 루어 락 주사기로 26G 바늘을 준비하고, 위에서 설명한 대로 준비된 약 5mL의 완전한 매체로 채우세요.
참고: 이 시점에서 첨가제없이 불완전한 RPMI를 사용하여 시약을 절약할 수도 있습니다. - 대퇴골이나 경골을 집게로 잡고 바늘을 뼈의 한쪽 끝에 삽입하고 주사기를 부드럽게 누릅니다. 뼈를 50mL 멸균 원추형 튜브 위에 놓고 약 5mL의 배지를 뼈에 부드럽게 주입하여 약간의 압력을 가합니다. 골수 조각을 관찰하여 뼈의 다른 쪽 끝에 얇은 빨간 리본으로 원추형 튜브로 떨어집니다.
- 흡인을 회전시키고 완전한 배지로 재주중지하거나 완전한 RPMI-1640 배지의 50mL를 포함하는 T175 cm2 멸균 조직 배양 플라스크로 직접 전달한다. 30 ng/mL 마우스 재조합 인터류빈(IL)-3을 가진 완전한 RPMI-1640 배지에서 흡인을 유지한다.
- 1 일 후, 가벼운 현미경으로 배양을 관찰하십시오. 배양은 다양한 모양과 크기의 세포의 이기종 인구와 골수의 더 큰 조각으로 구성됩니다. 상기와 같이 완전한 RPMI-1640 배지를 사용하여 3-5일마다 15mL의 신선한 배지를 첨가하여 세포 배양을 공급하고, 세포 밀도가 1× 106 셀/mL을 초과하지 않도록 한다. 일주일에 한 번, 실온에서 5 분 동안 200 × g 에서 세포를 회전하고, 신선한 완전한 RPMI-1640 배지에서 재주중단하고, 신선한 T175 플라스크에서 배지의 1:4로 1:4로 분할.
- 4주 후, 아래에 설명된 바와 같이 유동 세포측정에 의한 CD117(Kit) 및 FceRI 수용체의 표면 발현을 측정하여 세포 순도를 결정한다(섹션 3.2).
참고: 4주 후, 세포의 99%는 CD117(키트) 및 FcθRI에 대해 이중 양성이어야 합니다. - 4주 후, 완전한 RPMI-1640 배지에서 IL-3의 20 ng/mL로 BMMC를 유지관리한다. 약 6 주에서, 세포는 분할을 중단하고 더 이상 분할을 요구하지 않습니다. 배양을 3-5일마다 공급하고, 세포를 일주일에 한 번 원심분리하여 펠릿을 공급하고, 신선한 완전한 RPMI-1640 배지로 재차회한다.
2. CNC/아가로즈/D-매니톨 하이드로겔 기판 및 BMMC 배양의 제조
- 유리병에는 인산완충식염(PBS)에 0.2g의 아가로즈 파우더를 10mL의 최종 부피에 넣고 100°C에서 1분간 끓여 용해한다.
- PBS에서 CNC 분말 2.5g을 10mL의 최종 부피에 녹여 25% w/v 혼합물을 준비합니다.
- PBS에 CNC 분말 2g을 10mL의 최종 부피에 녹여 20% w/v 혼합물을 준비하고, 20% w/v 혼합물을 일련 적으로 희석하여 10, 5, 2%w/v CNC 혼합물을 준비한다.
- 25, 20, 10, 5 및 2%를 37°C로 37°C로 가열합니다(그림 2A).
- 뜨거운 아가로즈 용액에 0.46 g의 D-mannitol을 넣고 (4.6 % w /v) 용해하십시오.
- 사전 데운 25, 20, 10, 5 및 2%를 CNC-PBS 혼합물과 1:1 비율로 별도의 원문 튜브에 혼합하여 하이드로겔 혼합물에서 12.5, 10, 5, 2.5 및 1%w/v의 최종 CNC 농도를 산출합니다.
- 빠르게 작업하면 24웰 배양 판에 2.6단계로 제조된 위의 용액의 500 μL/웰을 추가하고, 정중화를 용이하게 하기 위해 실온에서 30분 동안 방치하십시오(그림 2B).
- BMMC 서스펜션의 1000 μL을 마이크로파이프로 하이드로겔 기판 위에 1.1 × 106 개의 세포/mL의 밀도로 조심스럽게 층화하고, 이로 인해 피펫의 끝으로 젤을 만지지 않도록 하여 겔 표면을 손상시키고 입자를 생성한다.
- 18h에 대한 37°C에서 멸균 인큐베이터(5% CO2, 가습대기)에서 하이드로겔 기판상에 BMMC를 배양한다.
3. 흐름 세포 측정 분석
- PI 제외를 통한 BMMC 생존 가능성의 유동 세포 측정 분석
- CNC/아가로즈/D-mannitol의 상단에서 BMMC를 함유하는 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 젤을 피하고 세포를 1.5mL 마이크로퍼지 튜브로 이송한다.
- BMMC는 실온에서 5분 동안 300 × μg 에서 0.5%를 포함하는 PBS(pH 7.4)로 BMMC를 두 번 세척하고, 1.5× 106 셀/mL의 최종 밀도로 PBS-0.5%w/v BSA의 180 μL에서 재차순으로 재차한다. 셀을 96개의 잘 둥근 바닥 플레이트로 옮기습니다.
참고: 0.2 μm 모공 크기의 주사기 필터를 사용하여 모든 PBS-0.5% w/v BSA 용액을 두 번 걸러내고 4°C에 보관합니다. - PBS-0.5%w/v BSA, 또는 PBS-0.5%w/v BSA로 제조된 10x PI(100 μg/mL)를 세포에 10 μg/mL의 최종 농도로 추가하고, 4°C에서 1시간 또는 실내 온도에서 15분 동안 배양한다. 578nm에서 형광 방출을 검출할 수 있도록 아르곤 이온 레이저(488-514 nm) 및 밴드패스 필터가 장착된 유량 세포계를 사용하여 형광 데이터를 획득한다. 실온에서 30 μL/min의 유량으로 샘플당 20,000개의 이벤트를 획득하십시오. 아래에 설명된 데이터를 분석합니다(섹션 3.2.7-3.2.10).
- 키트(CD117) 및 FcθRI 표면 수용체 발현용 BMMC의 유량 세포 측정 분석
- CNC/아가로즈/D-mannitol의 상단에서 BMMC를 함유하는 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 젤을 피하고 세포를 1.5mL 마이크로퍼지 튜브로 이송한다.
- 실온에서 5분 동안 300× g 에서 여과된 PBS-0.5% BSA로 BMMC를 두 번 세척하고, BSA(1.5× 106 셀/mL)를 함유한 PBS 180 μL에서 재연한다. 다시 중단된 셀을 96웰의 라운드 하단 플레이트로 옮기습니다.
- CD117(c-Kit)의 0.06 μg/mL(c-Kit)의 최종 농도를 달성하기 위해 세포에 10배 항체 작동 용액의 20μL을 추가하고 Fc1θRIα-allophycocyanin(APC)의 0.06 μg/mL을 각각 달성한다.
참고: 10배 항체 작동 솔루션은 필터 멸균 PBS-0.5% w/v BSA로 제조되어야 합니다. - 쥐 IgG2b θ isotype 대조군-PE 또는 아르메니아 햄스터 IgG 등형 제어-APC를 포함하는 10배 이소형 제어 작업 용액의 20 μL을 추가하여 3.2.3 단계에서 항체-플루오로포레 공수중 하나에 의해 염색되지 않은 세포를 포함하는 우물을 분리한다.
참고: 등류형 대조군, 쥐 IgG2b θ isotype 대조군-PE 및 아르메니아 햄스터 IgG 등형 대조군-APC는 BMMC에 항체의 비특이적 부착을 제어하는 역할을 한다. BMMC는 FcR의 높은 수준을 표현하지 않기 때문에, 동위 대조군 항체로 검출되는 거의 높은 배경 형광이 있습니다. 필터 멸균 PBS-0.5% w/v BSA에서 10배 이소형 제어 작업 솔루션을 준비합니다. - 어둠 속에서 4 °C에서 96 웰 라운드 하단 플레이트를 1 시간 동안 배양하십시오.
- 각각의 우물에 신선한 PBS-0.5%의 200 μL을 추가하고, 실온에서 5분 동안 300 g의 원심분리기를 3 × 00g 에서 첨가하여 셀을 세척합니다. 워시 스텝을 한 번 더 반복합니다. 조심스럽게 세포 펠릿을 만지지 않고 상체를 제거; 세포 펠릿이 방해받지 않고 남아 있는지 확인하기 위해 일부 상체를 남겨 둡니다.
- 세척 후, 0.5%의 100 μL에서 세포를 재중단하고, 0.2 μm 모공 크기의 주사기 필터로 두 번 멸균된 PBS(pH 7.4)에서 0.05%w/v 나트륨 아지드를 제거하였다. 3.1.3 단계에서 위에서 설명한 바와 같이 유동 사이토미터를 사용하여 PE 및 APC 검출기 채널에서 형광 데이터를 획득한다.
- 확장 ".fcs"를 사용하여 흐름 사이토메트릭 데이터 파일을 보고 분석할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.
- y축을 따라 x축 및 측산란(SSC)을 따라 전방 분산(FSC)을 플로팅하고, FSC 범위의 log10 1.5-5.0및 SSC 범위의 Log10 0.75-3.25를 가진 보존된 세포 집단을 위한 문(iA)에 도시된 바와 같이, 분석시작(i).
참고: 이는 FSC 및 SSC 값이 낮은 세포 이물질이 분석에서 제거되도록 하는 역할을 합니다. 비만 세포는 일반적으로 매우 세분화된 (높은 SSC) 세포와 큰 (높은 FSC) 단핵구 및 림프구와 같은 다른 면역 세포 유형에 비해. - 다음으로, 염료, 항체 또는 동종형 대조군으로 염색된 처리되지 않은 시료의 FSC 대 SSC 도트 플롯 및 히스토그램 프로파일을 생성하고, 특정 항체-플루오로포레 공인단의 방출 스펙트럼에 따라 PE 또는 APC 채널에서 평균 형광 강도(MFI)를 획득한다. 다른 CNC/아가로즈/D-mannitol 기판으로 배양되고 해당 동급형 컨트롤, 항체 또는 염료로 염색된 모든 BMMC 샘플에 동일한 게이트 및 파라미터 세트를 적용합니다. MIS를 가져옵니다.
참고: 본질적으로, 처리되지 않은 스테인드 샘플의 FSC 대 SSC 도트 플롯은 3.2.9 단계에서 얻은 처리되지 않은/ 얼룩이 없는 샘플과 구별할 수 있어야 하며, 염색 절차는 세포 크기(FSC에 의해 측정됨) 또는 과립(SSC에 의해 측정됨)(그림 3A(i)을 변경하지 않도록 합니다. - 통계 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 그래프 생성에 이어 4개의 독립적인 실험에서 각 샘플에 대한 평균 MFI 및 표준 표준 오류(SEM)를 계산합니다.
- 유동 세포 측정 데이터 분석 소프트웨어(그림 3B, 4A(ii),B(ii)에서 히스토그램 오버레이를 준비합니다.
4.3D FNC/나트륨 알기네이트 하이드로겔 기판의 바이오 프린팅
참고: 이 연구에 사용되는 3D 바이오 프린터는 두 개의 독립적인 온도 제어 인쇄헤드가 장착된 공압 압출 시스템입니다. 하이드로겔 스캐폴드에 사용되는 생체 물질 잉크는 (a) 고수화 된 피브릴라 나노 셀룰로오스 (FNC)를 제조하여 콜라겐, (b) 나트륨 알기네이트 및 (c) D-mannitol과 형태학적으로 유사합니다. 멸균 루어 락 원물 생체 인쇄 노즐(22, 25 또는 27 G)을 부착할 수 있는 3mL 카트리지에 멸균 하이드로겔 서스펜션으로 공급된다.
- 실온이 20-25°C인 실온에서 인쇄물과 함께 이 프로토콜을 사용합니다.
- 하이드로겔 복합체의 안정성을 유지하기 위해 생체 재료 잉크 카트리지를 4°C에 저장합니다. 3D 바이오 프린팅을 시작되기 전에 냉장고에서 카트리지(3mL)를 제거하고 실온에 평형할 수 있도록 합니다.
- 인크러블+ 3D 바이오 프린터에 바이오 잉크 카트리지 설치
- 3mL 생체 재료 잉크 카트리지(그림 5B(i)에서 파란색 엔드 캡을 제거하고 멸균 22G(파란색) 원물 생체 인쇄 노즐을 바이오잉크 카트리지의 루어 락 엔드에 부착합니다.
참고: 카트리지를 설치하고 후속 교정 단계를 수행하기 전에 원하는 원추형 생체 인쇄 노즐을 바이오잉크 카트리지에 부착하는 것이 필수적입니다. - 인쇄헤드 1(PH1, 왼쪽)용 공기 압력 공급 튜브를 카트리지의 반대쪽 끝에 연결하고, 부착된 원물 생체 인쇄 노즐이 있는 카트리지를 PH1의 수직 슬롯에 삽입합니다(그림 5A(ii).
- 인쇄물 아래에 확장된 원물 바이오 프린팅 노즐로 PH1에 카트리지를 단단히 고정합니다. PH1의 나사를 손가락으로 꽉 조이면 Bioink 카트리지를 제자리에 고정시십시오. 3D 바이오프린팅은 PH2가 비어 있으면 수행할 수 있습니다.
- 3mL 생체 재료 잉크 카트리지(그림 5B(i)에서 파란색 엔드 캡을 제거하고 멸균 22G(파란색) 원물 생체 인쇄 노즐을 바이오잉크 카트리지의 루어 락 엔드에 부착합니다.
- 3D 바이오 프린터의 x-y-z 축 보정
- 3D 바이오 프린터의 전원을 공급하고 USB 2.0 케이블을 통해 3D 바이오 프린터에 연결된 PC에서 바이오 프린터 소프트웨어를 실행합니다.
- 소프트웨어에서 CONNECT 버튼을 클릭하여 소프트웨어를 3D 바이오 프린터와 동기화합니다.
참고: 인쇄헤드 자외선 발광 다이오드 라이트가 켜지고 끌 때 동기화가 성공하며 HEPA 필터 팬이 다시 켜지고 켜집니다. 소프트웨어는 후속 단계에서 설명한 대로 바이오 프린터 축 및 시작점 보정을 홈으로 하기 전에 3D 바이오 프린터와 동기화되어야 합니다. - 3D 바이오 프린터의 주요 제어 메뉴에서 네 가지 옵션을 관찰하십시오: (i) BIOPRINT, (ii) BIOPRINT, (iii) 유틸리티 메뉴 및 (iv) 상태 화면 준비. BIOPRINT 준비 옵션을 선택한 다음 아래로 스크롤하여 홈 축축옵션을 선택합니다 .
참고: 3D 바이오 프린터는 인쇄헤드 어셈블리를 뒤로 왼쪽으로 이동하여 y-및 x 축을 각각 보정합니다. 그 후, 인쇄헤드가 맨 왼쪽 위치에서 일시 중지되면, 바이오 프린터는 z축 교정 스위치(인쇄판에 위치)가 인쇄헤드 1에 설치된 원추형 생체 인쇄 노즐과 접촉할 때까지 인쇄물을 올립니다. - x-y-z 축을 성공적으로 보정한 후 인쇄물의 약간 저하및 인쇄물의 재배치를 인쇄베드의 중심점 위로 관찰합니다(그림 5A(i))
- 24웰 플레이트에서 바이오 프린팅을 위한 바이오 프린터의 시작점 보정
- 밀봉된 플라스틱 래핑에서 멸균 24웰 배양판을 제거하고 영구 마커로 플레이트 밑면에 잘 D1의 중앙 점에 표시합니다. 플레이트 커버를 제거하고 인쇄물의 왼쪽 왼쪽 모서리에 잘 D1이있는 인쇄판에 24 웰 배양 판을 놓습니다.
- 기본 컨트롤 메뉴에서 유틸리티 메뉴를 선택한 다음 MOVE AXIS를 선택합니다. PH1의 원물 생체 인쇄 노즐이 잘 D1 아래에 표시된 점 위에 직접 올라갈 때까지 x 및 y 축을 따라 1mm 단위로 인쇄헤드를 이동합니다. 필요한 경우 인쇄헤드를 0.1mm 단위로 이동하여 원내 바이오 프린팅 노즐의 위치를 도트 위에 미세 조정합니다.
- 3D 바이오 프린터의 제어판 화면에 표시된 대로 잘 D1의 중앙을 직접 위에 있을 때 원물 생체 인쇄 노즐의 x 및 y 좌표를 기록합니다.
참고: 여기에 사용되는 INKREDIBLE + 3D 바이오 프린터의 경우 x 및 y 좌표는 다음과 같습니다 : x : -46.5 및 y : -27.5. 이러한 좌표는 24웰 플레이트에서 바이오 프린팅을 위한 잘 D1의 중심에서 시작점 역할을 합니다. - 다음으로, 잘 D1의 바닥이 거의 인쇄 헤드 1에 설치된 원물 생체 인쇄 노즐을 만질 때까지 1mm 단위로 인쇄물을 올립니다. 필요한 경우 인쇄판의 움직임을 0.1mm 단위로 미세 조정합니다(그림 5A(ii)). 그런 다음 유틸리티 메뉴에서 Z 축 보정 옵션을 선택하고 STORE Z 교정 옵션을 추가로 선택하고 확인합니다.
- 메인 메뉴로 돌아가 서 BIOPRINT 준비 옵션을 선택합니다. 아래로 스크롤하여 교정 Z 옵션을 선택합니다.
참고: 3D 바이오 프린터는 이제 z축 교정을 성공적으로 실행하면 인쇄된 인쇄물을 낮춥니다(그림 5A(iii).
- 올바른 시작점 좌표로 24웰 플레이트 G 코드 파일 업데이트
- 생체 프린터 소프트웨어(보충 파일 1)에서 제공된 24웰 플레이트 기하학적 코드(G 코드) 파일을 엽니다.
참고: 이 24웰 G 코드 파일은 각 웰(그림 5C(i)(iii)에서 2층 5 x 5 x 1mm 직사각형 구문 의 인쇄를 인코딩합니다. 제공된 G 코드 파일은 모든 3D 바이오 프린팅 소프트웨어와 함께 사용할 수 있습니다. - G 코드 파일의 줄 1은 G0 X-50.0 Y-33.5를 읽습니다. D1의 센터 위치가 잘 되어 있습니다. 단계 4.5.3에서 얻은 값으로 1호선의 x 및 y 좌표를 업데이트합니다 . D1의 센터 위치가 잘 되어 있습니다. 파일을 새 이름으로 저장합니다.
참고: 이 절차는 G 코드 파일을 보정하여 사용되는 특정 3D 바이오 프린터의 x,y 좌표를 기반으로 잘 D1의 중앙에서 인쇄가 시작되도록 합니다. 이 방법은 압출 3D 바이오 프린터로 인쇄할 24웰 플레이트 G 코드 파일을 보정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 연구의 목적을 위해, 24 웰 플레이트의 왼쪽 절반, 즉, 우물 A1-3, B1-3, C1-3 및 D1-3이 인쇄되었다. 3 x 4 그리드에서 2층 5 x 5 x 1mm 직사각형 구문의 인쇄를 인코딩하는 별도의 G 코드 파일도 제공됩니다(보충 파일 2, 그림 5C(ii)).
- 생체 프린터 소프트웨어(보충 파일 1)에서 제공된 24웰 플레이트 기하학적 코드(G 코드) 파일을 엽니다.
- 프린트헤드 1(PH1)용 압출 압력 조정
- 공압 펌프가 INKREDIBLE+ 3D 바이오 프린터의 후방 공기 섭취 포트에 단단히 연결되어 있는지 확인하고 공압 펌프를 켭니다.
- INKREDIBLE+ 3D 바이오 프린터의 오른쪽에 있는 전방 제어 노브를 꺼내십시오.
참고: 전방 제어 노브는 PH1의 압력을 조정하고 후방 제어 노브는 PH2의 압력을 조정합니다. - 바이오 프린터 전면에 위치한 PH1 및 PH2용 디지털 압력 게이지를 관찰하여 각각 0kPa에 가깝게 읽습니다. PH1에 대한 왼쪽 게이지에 표시된 압력이 12 kPa(그림 5A(iii)에 도달할 때까지 전방 제어 노브를 시계 방향으로 천천히 회전시합니다.
- 접힌 티슈 페이퍼 나 방수, 밀봉 필름을 설치된 카트리지의 인쇄 노즐 아래에 놓고 인쇄 노즐을 만지지 않도록주의하십시오.
- 3D 바이오 프린터의 주요 제어 메뉴에서 BIOPRINT 를 준비하십시오.
- PH1을 켜기로 이동하여 켜기를 선택합니다. 생체 재료 잉크가 인쇄 노즐에서 돌출되기 시작합니다. 필요한 경우 생체 재료 잉크가 연속 필라멘트에서 압출될 때까지 제어 노브를 시계 방향으로 회전하여 압출 압력을 증가시키고 새로운 압력 설정을 기록합니다. 생체 재료 잉크낭비를 피하기 위해 신속하게 작업하십시오.
- PH1을 끄면 생체 재료 잉크의 압출을 중지하고, 인쇄된 생체 재료 잉크를 함유한 티슈 페이퍼 또는 필름을 제거하고, 생체 프린터 도어를 닫습니다.
참고: 3D 바이오 프린터는 G 코드 파일의 지시에 따라 인쇄 하는 동안 PH1에 공기 압력 공급을 자동으로 켭니다.
- 24웰 플레이트 형식의 직선 하이드로겔 기판의 3D 바이오프린팅
- 3D 바이오 프린터의 주요 제어 메뉴에서 유틸리티 메뉴를 선택합니다. 생체 프린터 소프트웨어가 인쇄를 위해 G 코드 파일을 3D 바이오 프린터로 전송할 수 있는 비활성화 SD PRINT를 탐색하고 선택합니다.
- 바이오 프린터 소프트웨어의 LOAD 버튼을 클릭하고 4.6.2 단계에 저장된 업데이트된 24웰 플레이트 G 코드 파일을 선택합니다.
- 소프트웨어의 오른쪽 제어판에서 PRINT 미리 보기 탭을 선택하고 인쇄 버튼을 클릭하여 잘 D1에서 바이오 프린팅을 시작합니다.
참고: 3 x 4 그리드 웰 플레이트 G 코드 파일을 사용하는 경우, 전체 24웰 플레이트가 인쇄되는 경우 A6과 는 달리 24웰 플레이트(그림 5C(ii),D)의 생체 인쇄는 잘 A3에서 종료됩니다. - 직선 구조의 바이오 프린팅이 완료되면 뚜껑으로 24웰 플레이트를 덮고 클래스 II 생물 안전 캐비닛으로 이동합니다.
- 각 직리직선 구조는 멸균 50mM CaCl2 용액(그림 5B(ii)의 두 방울로 침수하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
참고: 이것은 alginate 폴리머 사슬을 Ca2+ 이온과 이온적으로 교차 연결하고 직선 구조가 구조적 무결성을 유지할 수 있도록 하는 역할을 합니다. - 각 구조에서 CaCl2 솔루션을 신중하게 흡인하고, 1x PBS(pH 7.4)의 1mL에서 한 번 헹구어 초과 CaCl2 (그림 5D)를 제거합니다.
- 생체 인쇄 하이드로겔 구조의 탈수를 방지하기 위해 BMMC가 구문에 시드될 때까지 3D 생체 인쇄 직사각형 구조를 신선한 1x PBS로 유지합니다(그림 5D).
5. 3D 생체 인쇄 직립 스캐폴드 및 생존 가능성 테스트에 대한 BMMC 의 배양
- 3D 생체 인쇄 직립 하이드로겔 스캐폴드에 BMMC의 배양
- BMMC의 시드 알리쿼트온을 3D 생체 인쇄 직사각형 스캐폴드에 트리플리케이트(예: 6, 18, 24 및 48h)에 38h로 연결하여 모든 치료가 동시에 종료되도록 합니다. 처리되지 않은 컨트롤과 동일한 기간 동안 트리플리케이트의 빈 우물에 시드된 BMMC를 사용합니다.
- BMMC를 T175 cm2 배양플라스크에서 멸균 50mL 원추형 튜브로 무균적으로 전송하고, BMMC를 실온에서 5분 동안 200 × g 로 펠릿합니다.
- IL-3의 20 ng/mL을 포함하는 신선한 완전 RPMI 배지의 50mL에서 펠릿을 재중단하고, 패혈계를 사용하여 트라이판 블루 스테인드 BMMC의 알리쿼트를 계산하여 살아있는 세포 밀도를 계산한다.
- 5.1.3 단계에서 계산된 세포 밀도에 기초하여, 1× 106 세포/mL의 최종 밀도에서 BMMC 현탁액의 6mL 알리쿼트를 준비한다.
- 48h 인큐베이션 설정의 경우, 3D 생체 인쇄 직립 하이드로겔 스캐폴드를 포함하는 웰 A1-3로부터 PBS를 흡습하고 BMMC(1 × 106 셀/mL) 현탁액을 각각 양호에 포함시켰다. 또한, BMMC(1× 106 셀/mL) 현탁액은 생체 인쇄 물자 없이 우물 A4-6로 서스펜션하여 처리되지 않은 대조군역할을 한다. 24, 18 및 6h 처리 기간 동안 BMMC로 파종하는 데 적절한 시간이 도달할 때까지 탈수를 방지하기 위해 첨가제없이 RPMI에서 생체 인쇄 비계(B1-3, C1-3, D1-3)를 포함하는 나머지 우물을 배양한다. 24, 18, 6h 타임 포인트에 대한 BMMC와 시드에 대한 적절한 시간이 도달 할 때까지 PBS의 1 mL로 생체 인쇄 스캐폴드 (B4-6, C4-6, D4-6)없이 우물을 채웁니다.
- 5% CO2 가습 된 대기에서 37 °C에서 24 웰 플레이트를 배양합니다.
- 24h 인큐베이션 설정의 경우, 기존 배양 배지/버퍼를 우물 B1-6로부터 흡인하고, BMMC(1× 106 셀/mL) 현탁액을 이들 우물로 배양한다. 접시를 인큐베이터에 반환합니다.
- 18h 인큐베이션 설정의 경우, 기존 배양 배지/버퍼를 웰C1-6으로부터 흡인시키고, BMMC(1× 106 세포/mL) 현탁액을 이들 우물로 배양한다. 접시를 인큐베이터에 반환합니다.
- 6h 인큐베이션 설정의 경우, 기존 배양 배지/버퍼를 우물 D1-6로부터 흡인하고, BMMC(1× 106 셀/mL) 현탁액을 이들 우물로 배양한다. 접시를 인큐베이터에 반환합니다.
- 인큐베이션 종료를 위해, (i) 파이 염색 및 유동 세포측정에 의한 분석, (ii) XTT 세포 생존성 분석, (iii) LDH 방출 분석에 대한 24웰 플레이트의 각 우물에서 샘플을 분배한다. 따라서, 라운드 하단 96-웰 플레이트와 필요한 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브가 인큐베이션의 종점 보다 사전에 잘 라벨이 붙도록 한다.
- XTT 대사 분석용 세포 샘플링
- 각 웰 내의 배양 배지에서 BMMC를 철저히 재중단하여 3D 생체 인쇄 하이드로겔 스캐폴드를 손상시키지 않도록 주의하십시오.
- 무균적 BMMC 서스펜션의 40 μL을 각각 웰에서 멸균하여 760 μL의 신선한 완전 RPMI 배지(최종 부피 = 800 μL)를 포함하는 1.5mL 마이크로퍼지 튜브를 살균하고, 소용돌이를 짧게 혼합한다.
- 마이크로 플레이트 분광광로계에서 흡광도 측정( 재료 표 참조)을 기록하는 데 적합한 평평한 바닥 96웰 마이크로티터 플레이트에 희석된 BMMC 서스펜션100 μL을 분배합니다.
- 멀티채널 마이크로피펫을 사용하여 BMMC 셀 서스펜션을 포함하는 각 웰에 XTT 작업 용액 50 μL을 분배합니다.
참고: XTT 시약 5mL을 전자 커플링 시약 100μL와 혼합하여 XTT 작업 용액을 준비합니다. 사용하기 직전에 37°C 의 수조에서 -20°C에서 이러한 성분을 해동하십시오. - 24h에 대한 5% CO2 가습 된 대기에서 37 °C에서 96 웰 플레이트를 배양합니다.
- 인큐베이션이 끝나면 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 실온으로 냉각시합니다. 650 nm에서 배경 빼기와 450 nm에서 마이크로 플레이트 분광계에 흡광도 값을 기록합니다.
- 젖산 탈수소효소(LDH) 분석용 수퍼네티드 샘플링
- 나머지 BMMC 서스펜션(960 μL)을 24웰 플레이트의 각 웰에서 마이크로퍼지 튜브로 옮기고, 실온에서 5분 동안 200 × g 의 젤렛을 전달한다.
- 파이펫은 각 마이크로퍼지 튜브에서 96웰 마이크로티터 플랫 바닥 플레이트로 세포 배양 상류제의 3개의 100 μL 알리쿼트. 각 미세 후지 튜브에서 남은 슈퍼네이넌트를 버리고 BMMC 펠릿을 유지하여 5.4.1-5.4.8 섹션에서 PI로 염색합니다.
- LDH 작업 용액의 파이펫 50 μL은 각 100 μL 알리쿼트에 상골이 있습니다.
참고: LDH 분석 시약의 준비를 위한 보충 파일 3 을 참조하십시오. - 실온에서 어둠 속에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 파이펫 50 μL의 1M 아세트산은 각 웰에 반응중지한다.
- 680 nm에서 배경 빼기와 490 nm에서 마이크로 플레이트 분광계에 흡광도 값을 기록합니다.
- 프로피듐 요오드 (PI) 제외를 통해 BMMC 생존가능성의 흐름 세포 측정 분석
- 멜터워시 버퍼(PBS[pH 7.4]로 BMMC 펠릿을 재중단하여 0.5% w/v BSA를 함유하고, 실온에서 5분 동안 300 × g 의 셀을 펠릿한다.
- 흐름 세척 버퍼로 워시 스텝을 한 번 더 반복합니다.
- 각 BMMC 펠릿을 400μL의 플로우 세척 버퍼로 재보설합니다.
참고: 총 24개의 재일시중단 BMMC 샘플이 있을 것입니다: 생체 인쇄 하이드로겔 기판에 배양된 12개의 BMMC 샘플(트리플리케이트의 4시간 지점)과 생체 인쇄 물자 없이 우물에서 배양한 12개의 BMMC 샘플(트리플리케이트4 시간 점). - 라운드 하단 96 웰 마이크로티터 플레이트에서, 파이펫 20 μL의 흐름 세척 버퍼는 우물 A1-12 및 B1-12로 버퍼. 동일한 마이크로티터 플레이트에서 파이펫 20 μL 10x PI 염색 용액(유량 세척 버퍼의 100 μg/mL PI)을 우물 C1-12 및 D1-12로 넣습니다.
- 생체 인쇄 하이드로겔 기판에 배양된 12개의 BMMC 샘플 중 180 μL을 우물 A1-12 (웰당 1개의 샘플)로 분배합니다. 생체 인쇄 하이드로겔 기판없이 배양 된 12 BMMC 샘플의 180 μL을 우물 B1-12 (우물 당 하나의 샘플)로 분배합니다. 각 치료 조건에 대한 비염색형 컨트롤로 우물 A1-12 및 B1-12로 분배된 BMMC 샘플을 사용합니다(총 24개의 컨트롤).
- 생체 인쇄 물자위에 배양된 12개의 BMMC 샘플 중 180μL을 우물 C1-12 (웰당 1개의 샘플)로 분배합니다. 생체 인쇄 물자 없이 배양된 12개의 BMMC 샘플 중 180 μL을 우물 D1-12 (웰당 1개의 샘플)로 분배합니다.
참고: 우물 C1-12 및 D1-12의 BMMC 샘플은 10 μg/mL(총 24개의 염색된 샘플)의 최종 효과적인 PI 농도로 염색됩니다. - 4°C에서 1시간 또는 어둠 속에서 실온에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 인큐베이션 기간이 끝나면, 3.1항 에 앞서 설명한 바와 같이 유동 사이토미터상 에서 마이크로티터 플레이트로부터 직접 샘플을 분석한다.
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Representative Results
성공적인 생체 재료 잉크 또는 배양 기판의 가장 중요한 특성 중 하나는 생체 적합성입니다. 주로, 기판은 세포 사멸을 유도해서는 안됩니다. 세포 생존력과 괴사를 정량화하는 몇 가지 미세량 계 및 유극성 방법이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 하이드로겔 매트릭스 내에 포함된 세포를 분석할 수 없습니다. 이 프로토콜에서, 상기 언급한 제한은 BMMC를 하이드로겔 기질 또는 생체 인쇄 스캐폴드에 시드함으로써 회피된다. 특정 인큐베이션 기간(이 연구에서 6-48h)이 발생한 후, BMMC는 하이드로겔 기판 또는 생체 인쇄 스캐폴드의 기계적 중단 또는 가수분해 없이 마이크로파이프팅에 의해 쉽게 수확되며, 이는 그렇지 않으면 세포에 물리적 손상을 입힐 수 있다. 그런 다음 BMMC의 생존가능성은 유동 세포측정법을 통해 PI 투과성 방법을 사용하여 빠르게 분석된다. PI는 DNA16의 염기 쌍 사이 를 상호 작용하는 경우에만 그대로 세포막 과 형광을 가진 실행 가능한 세포에서 제외되는 막 불굴의 염료입니다.
따라서, 손상된 세포막을 가진 세포만 PI에 투과성이 있고 그러므로, 형광할 것입니다. PI 투과성 분석은 CNC/아가로즈/D-mannitol 기판에서 배양될 때 BMMC 생존가능성에 변화가 없음을 입증했습니다. 실제로, CNC 농도(최대 12.5% w/v)는 CNC/아가로즈/D-mannitol 하이드로겔 기판이 없는 경우 배양된 BMMC와 비교하여 BMMC 생존가능성에 대한 부작용을 유도하지 않았다(그림 3B, C). 또한 바이오크 또는 배양 기질이 세포의 형태를 바꾸지 않는 것이 중요합니다. 유동 세포측정 FSC 대 SSC 플롯에 기초하여, 가장 높은 CNC 농도(12.5%w/v)를 가진 하이드로겔 기판은 CNC/아가로즈/D-mann-mann-mit-i)의 부재시 배양된 BMMC와 비교하여 BMMC의 네이티브 크기(FSC) 또는 세분성(SSC)을 변경하지 않았다.
생체 재료 잉크 또는 배양 기판의 또 다른 중요한 특징은 지원하는 세포의 분화 및 표현형을 유지하는 능력을 보유해야한다는 것입니다. 비만 세포의 가장 전형적인 바이오마커 중 2개는 비만 세포 생존 및 분화에 필요한 항원 및 줄기 세포 인자 수용체에 대한 BMMC 반응을 용이하게 하는 고친화도 IgE 수용체, FcθRI입니다. 성숙한 마스트 세포는 이 두 표면 수용체의 발현에 의해 정의되고, 배양에서 이를 유지하기 위해 바이오잉크 기판에 대해, 이들 두 수용체의 발현을 크게 수정해서는 안 된다. CNC/아가로즈/D-mannitol 기판은 CNC 농도에서 FcθRI 및 키트 발현을 ≥ 2.5%(그림 4A(iii),B(iii)를 증가시키는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 상승된 FcθRI 및 Kit 발현 수준은 고원 효과를 나타내는 2.5%와 12.5% CNC 사이에서 상대적으로 일관된 상태를 유지하며, 이는 CNC의 농도에 의존하지 않는 효과를 시사하지만 하이드로겔 복합체의 다른 파라미터에 영향을 미친다는 것을 시사한다.
이 연구에서 생성된 3D 바이오프린테릭 하이드로겔 생체 재료 잉크 스캐폴드는 결정성 나노셀룰로오스 대신 피릴라 나노셀룰로오스(FNC)와 아가로즈 대신 젤라토르로 알기네이트 나트륨으로 구성됩니다. Fibrillar 나노 셀룰로오스는 CNC17에 비해 뚜렷한 나노 스케일 지형 특징을 나타내며, 3D 생체 인쇄 FNC 하이드로겔 바이오 크록스 기판의 마이크로 스케일 아키텍처 외에도 BMMC의 생존가능성에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있습니다. FNC/alginate/D-mannitol bioink 비계(도 6)의 3D 바이오 프린팅 및 이온 교차 링크에 이어, BMMC는 단독으로 또는 3D 바이오프린팅 하이드로겔 스캐폴드에서 6, FNC/alginate/D-mannitol 스캐폴드에 대응하여 BMMC의 생존 가능성의 동적 변화를 평가하기 위해 각각 18, 24 및 48h, 있는 경우, 시간의 연장 된 기간 동안. XTT 분석은 3D 생체 인쇄 하이드로겔 스캐폴드에서 배양된 BMMC의 대사 활성이 BMMC에 단독으로 배양된 것과 비교했을 때 모든 테스트 시간 포인트에서 ~100%로 비교적 일관되게 유지되었다는 것을 나타냈다(그림 7A). 세포의 용해는 LDH 분석이 그것의 oxido 환원 효소 활동의 함수로 검출하는 세포 배양 매체로 LDH의 방출 귀착됩니다.
3D 바이오프린팅 하이드로겔 스캐폴드에서 배양된 BMMC는 단독으로 배양한 BMMC와 비교했을 때 LDH 방출의 점진적인 시간 의존적 증가를 나타냈다. 그러나 이러한 경향은 9% 미만의 비중요한 표준 편차를 보였습니다(그림 7B). 3D 생체 인쇄 하이드로겔 스캐폴드에 배양된 BMMC의 PI 염색은 매 시간 마다 단독으로 배양한 BMMC에 비해 생존가능성에 큰 변화가 없음을 밝혔다(그림 7C). 특히, 3D 바이오프린테겔 스캐폴드에서 배양된 PI 염색 BMMC의 MFI는 모든 시간 포인트에서 상대적으로 일관된(PI-MFI 7000)로 유지되었으며, CNC/아가로즈/D-mannitol 기판에서 배양된 BMMC와 유사하며, 이는 CNC/agarose/D-mannitol 기판에서 배양된 BMMC와 유사하며, 이는 전체 50000000의 일관된 PI-MFI를 선보였다. 총체적으로, 이러한 데이터는 FNC/alginate/D-mannitol 하이드로겔 비계가 BMMC의 생존가능성에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다.
그림 1: 골수가 고립되는 경골과 대퇴골을 묘사한 마우스 다리의 해부학.
그림 2: CNC/아가로즈/D-mannitol 하이드로겔 기판의 준비. (A) CNC/아가로즈/D-mannitol 하이드로겔 기판 제제 프로토콜의 회로도. (B) CNC/아가로즈/D-mannitol 제제(0, 1, 2.5, 5, 10 및 12.5% (w/v) PBS/아가로즈/D-mannitol에서 CNC가 24웰 플레이트에 적재되었다. 약어: PBS = 인산염 완충식식염; CNC = 결정성 나노 셀룰로오스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: CNC/아가로즈/D-mannitol 기판에 대한 배양 다음 예의 이오디드 제외를 통해 BMMC 생존가능성에 대한 혈중 세포 측정 분석. BMMC는 CNC/아가로즈/D-mannitol 하이드로겔 기판에서 제거되고, 두 번 세척하고, PBS-0.5% w/v BSA로 재장매되고, 4°C에서 1시간 동안 PI로 염색하고, 흐름 세포측정(n=4)에 의해 분석되었다. PE 채널에서 PI 형광 방출 검출을 포함하여 샘플 당 총 20,000개의 세포를 획득하였다. 유동 세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석이 수행되었습니다. (A) 전방 분산(x축) 대 측면 분산(y축) (i) 처리되지 않은 제어 BMMC(0% CNC/아가로즈/D-mannitol)와 (ii) BMMC에서 배양된 BMMC는 데이터 분석에 사용되는 게이트 셀 집단을 묘사하여 12.5%로 배양하였다. (B) 12.5% CNC/아가로즈/D-mannitol에서 배양된 처리되지 않은 대조군 BMMC(0% CNC/아가로즈/D-mannitol)와 BMMC로부터 게이트 셀(PI로 염색되지 않거나 염색)의 히스토그램 오버레이 프로파일. (C) BMMC는 18h에 대해 상이한 CNC/아가로즈/D-mannitol 기판(1-12.5%(w/v) CNC에서 배양되었고, 세포 생존가능성은 PI 스테인드 셀의 유동 세포 측정 분석에 의해 결정되었다. PI로 염색된 BMMC에 비해 다른 CNC/아가로즈/D-mannitol 기판(1-12.5%(w/v) CNC에 배양된 BMMC용 PI MF의 그래픽 표현. 약어 : BMMC = 골수 유래 비만 세포; CNC = 결정성 나노 셀룰로오스; PBS = 인산염 완충식식염; BSA = 소 세럼 알부민; PI = 요오드 프로피듐; PE = 피코에리스린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: FcθRI 및 Kit(CD117) 세포 표면 수용체 발현의 유동 세포 측정 분석. BMMC는 18h에 대한 CNC/아가로즈/D-mannitol 기판의 부재 또는 존재에서 배양되었고, 수용체 발현을 위해 제거및 분석되었다. 데이터는 4개의 복제를 대표합니다. 처리되지 않은 BMMC 샘플(0% CNC/아가로즈/D-mannitol)에서 총 세포 집단의 전방 분산(x축) 점도 플롯(0% CNC/아가로즈/D-mannitol), (A)(i) 등류형 대조군 항체-APC 또는 (b)(i) 등류형 대조군 항체-APC 또는 (i) 등류형 대조군 항체-PE 및 게이트 셀이 사용되는 인구 분석. 게이트 BMMC의 히스토그램 오버레이 프로파일 (동형 제어 항체 또는 (a)(ii) 안티 FcθRI-APC 항체 또는 (b)(ii) 안티 키트-PE 항체) 단독으로 배양(0% CNC/아가로스/D-mannitol) 또는 12.5% CNC/a-mannitol에 BMMC는 다른 CNC/아가로즈/D-mannitol 기판(1-12.5%(w/v) CNC에서 18h를 배양했으며, FcθRI 및 Kit 표면 수용체 발현 분석이 각각 유동 세포측정(n=4)을 통해 배양되었다. (A)(iii) 항 FcθRI-APC 또는 (b)(iii) 항키트-PE 항체로 염색된 BMMC의 MFIs의 그래픽 표현은 각각 다른 CNC/아가로즈/D-mannitol 기판에 대한 배양(1-12.5% (w/v) CNC에 대한 배양에 따라 처리되지 않은 세포(0NC%)와 유사하게 처리되지 않은 세포(0NC)에 대한 비정형(SNC)에 대한 것이다. 약어: CNC = 결정성 나노 셀룰로오스; APC = 동종 균 시 아닌; PE = 물리에리트린; BMMC = 골수 유래 비만 세포; MFI = 형광 강도를 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 3D 바이오 프린터 장비 및 소모품은 24웰 플레이트 형식으로 5 x 5 x 1mm 2층 직선 바이오 잉크 하이드로겔 스캐폴드에 필요한 소모품입니다. (a)(i) x-y-z 축의 호밍을 완료할 때 인쇄소 조립 위치를 가진 공압 압출 3D 바이오 프린터. (A) (ii) x-y-z 치수에서 잘 D1의 중간에 직접 인쇄 노즐을 설치하고 설치한 인쇄헤드 1의 시작점 보정. (A) (iii) Z축 보정 및 12kPa로 설정된 PH1의 압출 압력을 따르는 PH1의 위치. (B) (i) NFC/알기네이트/D-매니톨 바이오 재료 잉크 제형을 함유한 바이오 잉크 카트리지(3mL). (B) (ii) 50mM CaCl2 교차 연결 용액의 물방울 디스펜서. (C) (i) 24웰 플레이트의 모든 우물에서 5 x 5 x 1mm 2층 직사각형 바이오잉크 하이드로겔 스캐폴드의 인쇄를 인코딩하는 G 코드 파일에서 인쇄 레이아웃의 회로도 표현. (C) (ii) 5 x 5 x 1mm 2층 직사각형 바이오잉크 하이드로겔 스캐폴드의 인쇄를 코딩하는 G 코드 파일로부터 인쇄 레이아웃의 회로도 표현은 우물 A1-3, B1-3, C1-3 및 24웰 플레이트의 D1-3에서만 분리된다. (C) (iii) 슬라이스 프로그램, 슬라이스 프로그램에서 5 x 5 x 1mm 2층 직선 바이오 잉크 하이드로겔 스캐폴드 패턴의 확장된 뷰. (D) 실제 3D 바이오프린팅 5 x 5 x 1mm 2층 직리동맥 바이오잉크 하이드로겔 스캐폴드의 Topview는 PBS에 침지된 24웰 플레이트 형식으로 진행됩니다. 약어: 3D = 3차원; PH1 = 프린트헤드 1; NFC = 나오비릴라 셀룰로오스; G 코드 = 기하학적 코드; PBS = 인산염 완충식식염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: FNC/alginate/D-mannitol 하이드로겔 스캐폴드에서 3D 바이오 프린팅 및 BMMC 배양 워크플로우를 묘사한 회로도 다이어그램. 5 x 5 x 1mm 2층 그리드 패턴을 인코딩하는 G 코드 파일의 FNC/Alginate/D-mannitol bioink를 함유한 하이드로겔 스캐폴드의 3D 바이오프린팅, CaCl2와 하이드로겔 스캐폴드의 교차 연결, 크로스링크 FNC/Alginate/D-Mannitol 하이드로겔 구조에 BMMC를 배양합니다. 약어: 3D = 3차원; 2D = 2차원; G 코드 = 기하학적 코드; FNC = 피브릴라 나노 셀룰로오스; BMMC = 골수 유래 마스트 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: FNC/alginate/D-mannitol scaffolds에 대한 배양 에 따른 BMMC 생존 가능성의 흐름 세포 측정(PI) 및 마이크로티터(XTT 및 LDH) 분석. (A) 세포 증식(XTT) 대사 성 증식(XTT) 대사 분석 데이터 FNC/Alginate/D-mannitol bioinks에 대한 6, 48. 값은 각각 6, 18, 24 및 48h에 대해 단독으로 배양된 BMMC에 대한 XTT 대사 데이터의 백분율로 제시됩니다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다(n=3). (B) FNC/알기네이트/D-mannitol bioink 비계에서 배양된 BMMC에 대한 LDH 효소 방출 분석 데이터는 각각 6, 18, 24 및 48h에 대해 배양한다. 값은 각각 6, 18, 24 및 48h에 단독으로 배양된 BMMCs에 의해 방출된 LDH 효소에 비해 접힌 변화로 제시된다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다(n=3). (C) 6, 18, 24 및 48h에 대한 FNC/Alginate/D-mannitol 바이오 잉크 비계에서 단독으로 또는 배양된 PI 염색 BMMC의 혈중 세포 측정 데이터. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다(n=3). 약어: LDH = 젖산 탈수소 효소; BMMC = 골수 유래 비만 세포; FNC = 피브릴라 나노 셀룰로오스; PI = 요오드 프로피듐; MFI = 형광 강도를 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 1.1.1. RPMI 의 500 mL 병 (하이클론, GE 헬스케어, 미국) |
| 1.1.2. 4 mM L-글루타민 (기브코, 월섬 매사추세츠, 미국) |
| 1.1.3. 50 mM β-메르카토에탄올 (피셔 사이언디언스, 햄프턴, 뉴햄프셔, 미국) |
| 1.1.4. 1 mM 나트륨 피루바테 (기브코) |
| 1.1.5. 100 U/mL 페니실린 (기브코) |
| 1.1.6. 100 μg/mL 연쇄상 구균 (Gibco) |
| 1.1.7. 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 (Gibco) |
| 1.1.8. 25 mM 헤페 (피셔) |
| 1.1.9. 10% 열 비활성화 FBS (Gibco) |
| 1.1.10. 30 ng/mL 마우스 재조합 IL-3 (페프로텍, 로키 힐, 뉴저지, 미국) |
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Discussion
3D 생체 mimetic 조직의 제조는 세포 외 매트릭스의 구성 요소를 모방하는 바이오 잉크의 성공적인 합병을 필요로하며, 세포 구성 요소 (들)와 함께 생체 내 조직의 생리적 유사체를 생성합니다. 이것은 생리적인 생물역학 조직을 제조할 때 1 차적인 세포의 사용을 필요로 하고, 세포를 변형시키지 않습니다. 그러나 비만 세포와 같은 1차 면역학적 세포는 특히 생잉크 매트릭스 자체에 의해 유도될 수 있는 세포독성 효과 및 현상적 변화에 취약하며, 이는 바람직하지 않다. 따라서, 마스트 세포의 생존가능성 및 표현형(표면 수용체 발현)에 대한 후보 생체물질 잉크의 효과를 신속하게 평가하는 능력은 특히 바이오잉크 매트릭스 내에 내장된 다른 세포 유형을 포함하는 복잡한 조직의 3D 바이오프린팅 이전에 매우 유리하며, 이는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요된다.
이 프로토콜의 접근은 BMMC를 배양하는 것을 포함합니다, 1 차성 마스트 세포의 예는, 미리 형성된 후보 하이드로겔 bioink 기판의 표면에 (1-12.5% CNC 아가로즈에 내장), 이는 흐름 세포 세포 에 의한 세포 생존가능성 및 표면 수용체 발현의 후속 분석을 위한 BMMCs의 쉬운 검색을 허용하는. 마우스 대퇴골과 경골에서 골수의 격리는 이러한 뼈의 취약성과 작은 크기로 인해 세부 사항에 정밀도와주의를 필요로한다. 골수의 성공적인 격리 및 증착 후 골수를 세포 배양 배지로 성공적으로 분리하고 증착한 후, 4주 동안 30 ng/mL 마우스 재조합 IL-3를 지속적으로 세포 배양을 유지하는 것이 필수적이며, 이는 조혈 전구세포를 키트(CD117)와 FcθRI 세포 표면에 대해 이중 양성인 마스트 세포로 분화하는 지속적인 자극을 보장한다.
키트(CD117) 및 FcθRI 수용체의 표면 발현을 위한 마스트 세포의 유동 세포 측정 분석은 도 4A(ii),B(ii)에서 입증된 바와 같이 이러한 수용체를 표적으로 하는 항체의 특정 신호로부터 비특이적 배경 신호를 분화하는 것을 돕기 위해 동종형 항체 제어를 사용해야 한다. 또한 잘 정의된 마스트 세포 집단에 게이트하여 도 4A(i) 및 4B(i)에 도시된 바와 같이 세포 이물질을 배제하는 것이 필수적이며, 이는 항체를 비특이적 결합시킬 수 있다. 부드러운 마이크로파이프는 바이오크 하이드로겔 기판의 표면에서 BMMC를 검색할 때 사용되어야 하며, 이는 세포막에 가해지는 전단력을 감소시키고 PI로 인위적으로 염색될 수 있다. PI 염색 BMMC는 PBS-0.5%w/v BSA를 기반으로 하는 PI 염색 매체로서 염색 된 배양 기간이 끝난 직후의 흐름 세포측정에 의해 분석되어야 하며, 세포 배양 배지 이외의 장기간 세포를 유지하도록 의도되지 않는다. PI는 손상된 세포막을 가진 세포에만 침투하기 때문에, 높은 선택성 및 감도로 괴사 세포를 얼룩지게 할 수 있습니다. 그러나 PI는 세포막을 그대로 유지하는 세포 세포를 검출할 수 없습니다.
본 프로토콜에 기재된 PI-배제 흐름 세포측정 분석체는 인지질, 인산화세포에 구체적으로 결합하는 부속서-V-형광체(FITC)로 증강될 수 있으며, 이는 세포막의 외부 전단지로 배회된다. 그러나 FITC의 형광 방출출혈을 PI로부터 방출하는 데 사용되는 검출기 채널로 의한 형광 방출을 고려하여 보상이 필요하며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 제공된 24웰 플레이트 G-코드로부터 3D 바이오프린팅을 위한 바이오프린터를 준비할 때, 시작점 보정을 정확하게 수행해야 하며, 이에 따라 잘 D1 의 중심의 x 및 y좌표가 기록되고 G 코드 파일은 1호선에 이러한 x-y-좌표로 업데이트된다. 이러한 초기 교정 단계가 정확하게 수행되지 않으면 인쇄시작 시 인쇄헤드가 올바른 시작점으로 이동하지 않습니다. z축의 올바른 교정은 인쇄소 또는 인쇄 개시 시 24웰 플레이트와 충돌하는 인쇄헤드의 노즐을 초래할 수 있으므로 똑같이 중요합니다.
5 x 5 x 1mm 2층 직선 그리드 구조(그림 5C(iii)의 회로도 도면은 기판을 형성하는 압출된 바이오잉크 필라멘트 사이에 모공의 존재를 보여 준다. 필라멘트의 기공 의 크기와 직경은 세 가지 매개 변수에 따라 달라집니다: (i) 인쇄 노즐의 이동 속도, (ii) 카트리지 내의 바이오잉크에 가해지는 압출 압력, (iii) 인쇄 노즐 직경. 큰 필라멘트 직경과 작은 모공을 가진 바이오 잉크 기판은 느린 인쇄 노즐 속도, 더 높은 압출 압력 (>12 kPa), 그리고 더 큰 직경의 인쇄 노즐 (22 G)을 사용하여 인쇄 할 수 있습니다. 반대로, 더 빠른 인쇄 노즐 속도, 낮은 압출 압력 (<12 kPa), 그리고 더 작은 직경 인쇄 노즐 (27 G)은 미세한 필라멘트와 더 큰 모공을 가진 기판을 초래할 것입니다. 그러나, 압출 압력이 부족하면 연속 필라멘트 대신 압출되는 생체 잉크의 일관성 없는 덩어리가 발생하여 3D 생체 인쇄 기판의 품질과 구조적 무결성에 부정적인 영향을 미칩니다.
이 프로토콜에 제시된 CNC/아가로즈/D-mannitol 후보 바이오크는 아가로즈가 실온으로 냉각될 때 열 겔화를 거칩니다. 대조적으로, 본 프로토콜에서 3D 바이오프린팅에 사용되는 상업용 바이오크는 바이오잉크 제형에 알지네이트 나트륨의 포함으로 인해 CaCl2와 이온 성 교차 연결을 겪는다. 따라서, 기판의 교차 연결(gelation)을 용이하게 하기 위해 바이오프린팅 후 50mM CaCl2 용액에 생체 인쇄 FNC/alginate/D-mannitol 스캐폴드를 침지하는 것이 필요하다. CaCl2와 이온 교차 연결 단계의 생략은 세포 배양 배지에 침지될 때 FNC/alginate/D-mannitol 비계의 용해귀귀일 것이다. CNC/아가로즈/D-mannitol 바이오잉크 제형의 가장 중요한 제한은 실제 3D 바이오프린팅에 적용되어 아가로즈(90-95°C)의 매우 높은 용융 온도이다. 본 연구에서 사용되는 3D 바이오 프린터의 인쇄헤드가 최고 온도 130°C에 도달할 수 있지만, CNC/아가로즈/D-mannitol의 압출 필라멘트는 연속층이 인쇄되어 기판을 구성하기 위해 인쇄될 가능성이 높습니다. CNC/아가로즈/D-mannitol bioink 제제의 이러한 제한은 CNC/아가로즈/D-mannitol bioink를 냉각 된 인쇄판에 직접 인쇄하여 젤레이션을 가속화하거나 실온에서 압출 될 수있는 알기네이트 나트륨과 아가로즈를 대체하여 5M 내의 급속한 이온 교차 연결을 통해 우회 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 공압 압출 3D 생체 프린팅을 실시해서는 안되는 유방 세포와 같은 민감한 면역 세포와의 열악한 생화학적 호환성을 나타내는 생체 잉크 제형을 신속하게 선별하고 배제하는 신뢰할 수있는 접근 방식을 제공합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 멀티플렉스 스크리닝 분석기를 수행하기 위해 상대적으로 적은 양의 세포가 필요하기 때문에 비용 효율적입니다. 대조적으로, 미리 공식화된 바이오잉크 세포 혼합물은 고가의 재조합 성장 인자에 의존하는 1차 세포를 배양할 때 특히 생체 적합성 선별 분석법을 수행하기 위해 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 것으로 입증될 수 있는 매우 높은 세포 밀도(>107 cells/mL)에서 생체 인쇄되어야 합니다.
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Disclosures
이 작품은 캐나다 국립 연구 위원회와 앨버타 혁신에 의해 지원되었다.
Acknowledgments
CNC/아가로즈/D-mannitol 매트릭스를 준비할 때 CNC와 켄 해리스, 조재영에게 기술적 조언을 해주신 알버타 이노베이트에게 감사드립니다. 우리는 또한 벤 호프만, 헤더 윈첼과 니콜 디아만타이드의 기술적 조언과 INKREDIBLE + 3D 바이오 프린터의 설정 및 교정에 대한 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
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