Изготовление кристаллических наноцеллюлозных встроенных чернил агарозного биоматериала для культуры тучных клеток, полученных из костного мозга
Summary
Этот протокол выделяет метод быстрой оценки биосовместимости кристаллической наноцеллюлозы (ЧПУ) / агарозных композитных гидрогелевых биоматериалных чернил с тучными клетками костного мозга мыши с точки зрения жизнеспособности клеток и фенотипической экспрессии рецепторов клеточной поверхности, Kit (CD117) и высокоаффинного рецептора IgE (FcεRI).
Abstract
Трехмерная (3D) биопечать использует композиты на основе гидрогеля (или чернила биоматериала), которые наносятся в виде рисунка, образуя субстрат, на который наносятся клетки. Поскольку многие чернила биоматериала могут быть потенциально цитотоксичными для первичных клеток, необходимо определить биосовместимость этих гидрогелевых композитов до их использования в дорогостоящих процессах 3D-тканевой инженерии. Некоторые методы 3D-культивирования, включая биопечать, требуют, чтобы клетки были встроены в 3D-матрицу, что затрудняет извлечение и анализ клеток на предмет изменений жизнеспособности и экспрессии биомаркеров без механического повреждения. Этот протокол описывает в качестве доказательства концепции метод оценки биосовместимости кристаллической наноцеллюлозы (ЧПУ), встроенного в агарозный композит, изготовленный в 24-луночную культуральную систему, с тучными клетками, полученными из костного мозга мыши (BMMCs), с использованием проточных цитометрических анализов жизнеспособности клеток и экспрессии биомаркеров.
После 18 ч воздействия матрицы ЧПУ/агарозы/D-маннитола жизнеспособность BMMC не изменялась по проницаемости йодида пропидия (PI). Однако БММК, культивируемые на субстрате ЧПУ/агарозы/D-маннитола , по-видимому, несколько увеличивают экспрессию высокоаффинного IgE-рецептора (FcεRI) и рецептора фактора стволовых клеток (Kit; CD117), хотя это, по-видимому, не зависит от количества ЧПУ в композите биочернила. Жизнеспособность BMMC также оценивалась после воздействия гидрогелевых каркасов, которые были изготовлены из коммерческих чернил биоматериала, состоящих из фибриллярной наноцеллюлозы (FNC) и альгината натрия с использованием 3D-экструзионного биопринтера. В течение 6-48 ч субстраты FNC/alginate не оказывали неблагоприятного влияния на жизнеспособность BMMCs, определяемую проточной цитометрией и анализами микротитров (XTT и лактатдегидрогеназа). Этот протокол описывает эффективный метод быстрого скрининга биохимической совместимости чернил-кандидатов для биоматериала на предмет их полезности в качестве 3D-каркасов для послепечатного посева тучными клетками.
Introduction
Недавний интерес к системам 3D-культур и 3D-биопечати сосредоточил внимание на гидрогелях и гидрогелевых композитах. Эти композиты служат вязкими, но пористыми биомиметиками и могут состоять из содержания до 99% воды по массе, что сопоставимо с биологическими тканями1,2,3. Эти особенности гидрогелевых композитов, таким образом, позволяют расти клеткам, не влияя на их жизнеспособность и функцию. Одним из таких композитов является кристаллическая наноцеллюлоза (ЧПУ), которая использовалась в качестве армирующего материала в гидрогелевых композитах, клеточных каркасах при разработке имплантатов биоматериала, а также в двумерных (2D) и 3D in vitro клеточных культурах4,5. По большей части матрицы, состоящие из ЧПУ, не являются открыто цитотоксичными для эпителиальных клеток роговицы человека6, эпителиальных клеток кишечника7, мезенхимальных стволовых клеток человеческого костного мозга8 или нейроноподобных клеток9. Однако метаболическая активность и пролиферация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга человека, снижается в корреляции с повышенной вязкостью древесных наноцеллюлозных композитов, что позволяет предположить, что состав матрицы должен быть тщательно проверен на предмет ее вредного воздействия на функции клеток8.
Аналогичным образом, ЧПУ может вызывать воспалительные реакции у макрофагов при интернализации, что может иметь серьезные последствия в системах 3D-культуры иммунных клеток10,11. На самом деле, существует очень мало данных о том, как ЧПУ может влиять на другие иммунные клеточные реакции, особенно аллергические воспалительные реакции, которые инициируются тучными клетками. Тучные клетки представляют собой гранулированные лейкоциты, которые экспрессируют высокоаффинный рецептор IgE, FceRI, ответственный за активацию воспалительных реакций на аллергены. Их пролиферация и дифференцировка зависят от фактора стволовых клеток (SCF), который связывает тирозиновый рецептор Kit. Тучные клетки получены из клеток-предшественников костного мозга, которые входят в кровообращение и впоследствии мигрируют периферически, чтобы повсеместно рассеяться во всех тканях человека12. Поскольку тучные клетки функционируют в 3D-тканевой среде, они являются идеальным кандидатом на иммунные клетки для изучения иммунологических процессов в 3D-моделях тканей in vitro. Однако на сегодняшний день не существует жизнеспособной 3D-модели ткани in vitro, содержащей тучные клетки.
Из-за высокочувствительной природы тучных клеток и их склонности вызывать провоспалительные реакции на внешние раздражители, требуется тщательное рассмотрение составляющих 3D-матрицы и метода биопечати введения тучных клеток в 3D-каркас, как обсуждается далее. Тканевые конструкции могут быть биофабрикцинированы из двух широких категорий биоматериалов, т.е. биочернил и чернил биоматериалов. Различие заключается в том, что биочернила представляют собой насыщенные клетками гидрогелевые композиты, тогда как чернила биоматериала представляют собой гидрогелевые композиты, которые лишены клеток, как определено Groll et al.13,14. Следовательно, 3D-конструкции, напечатанные с помощью биочернил, содержат клетки, предварительно встроенные в гидрогелевую матрицу, тогда как 3D-конструкции, напечатанные чернилами биоматериала, должны быть засеяны клетками после печати. Биофабрикация культивировочных каркасов из биочернил на основе гидрогеля / чернил биоматериала чаще всего выполняется с использованием экструзионных 3D-биопринтеров, которые выдавливают чернила биочернила / биоматериала через микромасштабное сопло под давлением через пневматический или механически управляемый поршень14. Экструзионные биопринтеры изготавливают 3D-каркасы, нанося биочернила в 2D-узоры поперечного сечения, которые последовательно укладываются друг на друга в подходе «снизу вверх».
Чтобы быть совместимыми с экструзионной биопечатью, чернила на основе биочернила/биоматериала на основе гидрогеля должны обладать тиксотропными (разбавляющими сдвиг) свойствами, в результате чего составляющие гидрогелевые полимеры биочернила/биоматериала текут как жидкость через микроканальное сопло при воздействии напряжения сдвига, но возвращаются в вязкое, гелеобразное состояние при снятии напряжения сдвига15 . Из-за высокого содержания воды полимеры биочернил / чернил биоматериала на основе гидрогеля должны быть сшиты, физически или ковалентно, для поддержания архитектуры и структурной целостности 3D-биопечатной структуры. В случае биочернил, нагруженных клетками, клетки непосредственно подвергаются химическим напряжениям во время процесса сшивания. Процесс экструзии клеток, инкапсулированных в гидрогелевую матрицу биочернила, также подвергает клетки стрессу сдвига, что может привести к снижению жизнеспособности и/или гибели клеток. После того, как 3D-модель ткани была биопечатана, трудно различить уровни цитотоксичности, вызванные самой гидрогелевой матрицей, и процессами экструзии и сшивки соответственно. Это особенно сложно в контексте 3D-каркасов, где клетки предварительно встроены в гидрогелевую матрицу, что затрудняет удаление клеток для последующих анализов, что нанесет ущерб жизнеспособности тучных клеток.
Более мягкий подход к созданию 3D-тканевых конструкций, содержащих тучные клетки, включает в себя посев клеток в предварительно напечатанные, пористые чернильные 3D-каркасы биоматериала из суспензии клеточной культуры, которая использует врожденную способность тучных клеток мигрировать из циркуляции в периферические ткани. Преимущества этого подхода к посеву клеток двояки: (i) тучные клетки не подвергаются сдвиговым и химическим нагрузкам в результате процессов экструзии и сшивки соответственно, и (ii) клетки могут быть легко удалены из 3D-каркаса после воздействия путем тщательной промывки для анализа без негативного влияния на их жизнеспособность. Дополнительным преимуществом посева и анализа жизнеспособности тучных клеток на 3D-биопечатных, пористых гидрогелевых каркасах в отличие от 2D-гидрогелевых дисков является то, что 3D-биопечатные гидрогелевые каркасы рекапитулируют микромасштабные топографические особенности тканей in vivo , которые не присутствуют в объемных, 2D-плоских гидрогелевых дисках. Этот подход является подходящим, быстрым и экономически эффективным подходом к определению потенциально катастрофических цитотоксических эффектов матриц гидрогеля биочернила на тучные клетки, а также на другие иммунологические клетки до инвестирования в дорогостоящие эксперименты по 3D-тканевой инженерии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изготовление 3D-биомиметических тканей требует успешного объединения биочернила, который имитирует компоненты внеклеточного матрикса, с клеточным компонентом (компонентами) для создания физиологических аналогов тканей in vivo . Это обусловливает необходимость использования перви?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Alberta Innovates за предоставление ЧПУ, а также Кена Харриса и Дже-Янг Чо за их технические консультации при подготовке матрицы CNC/agarose/D-mannitol. Мы также благодарим Бена Хоффмана, Хизер Уинчелл и Николь Диамантидес за их технические консультации и поддержку в настройке и калибровке 3D-биопринтера INKREDIBLE+.
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
- Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).
- Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
- Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
- Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
- Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
- Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
- Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
- Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
- Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
- Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
- Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
- Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
- Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).
