تصنيع بلوري Nanocellulose جزءا لا يتجزأ من الحبر Agarose المواد الحيوية لثقافة الخلايا الصاري نخاع العظام المستمدة
Summary
يسلط هذا البروتوكول الضوء على طريقة لتقييم التوافق البيولوجي بسرعة للخلايا النانوية البلورية (CNC) / agarose المركبة هيدروجيل الحبر المواد الحيوية مع خلايا الصاري نخاع العظم الماوس المستمدة من حيث صلاحية الخلية والتعبير الظاهري لمستقبلات سطح الخلية، كيت (CD117) ومستقبلات IgE عالية التقارب (FcεRI).
Abstract
تستخدم الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) المركبات القائمة على الهيدروجيل (أو أحبار المواد الحيوية) التي يتم إيداعها في نمط ، مما يشكل ركيزة تودع عليها الخلايا. لأن العديد من الأحبار المواد الحيوية يمكن أن تكون سامة للخلايا الأولية، فمن الضروري تحديد التوافق البيولوجي لهذه المركبات هيدروجيل قبل استخدامها في عمليات هندسة الأنسجة 3D مكلفة. تتطلب بعض طرق الثقافة ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك الطباعة الحيوية، أن يتم تضمين الخلايا في مصفوفة ثلاثية الأبعاد، مما يجعل من الصعب استخراج الخلايا وتحليلها للتغيرات في القدرة على البقاء والتعبير عن العلامات الحيوية دون إحداث ضرر ميكانيكي. يصف هذا البروتوكول بأنه دليل على المفهوم ، وهو طريقة لتقييم التوافق البيولوجي للخلايا النانوية البلورية (CNC) المدمجة مركب agarose ، ملفقة في نظام ثقافة 24 بئرا ، مع خلايا سارية مشتقة من نخاع العظم الماوس (BMMCs) باستخدام المقايسات الخلوية التدفق لرواية الخلية والتعبير عن العلامة الحيوية.
بعد 18 ساعة من التعرض لمصفوفة CNC /agarose/D-mannitol ، لم تتغير قابلية BMMC للحياة كما تقاس نفاذية يوديد البروبيديوم (PI). ومع ذلك، BMMCs مثقف على CNC/agarose/D-مانيتول الركيزة يبدو أن زيادة طفيفة في التعبير عن مستقبلات IgE عالية التقارب (FcεRI) ومستقبلات عامل الخلايا الجذعية (كيت؛ CD117) ، على الرغم من أن هذا لا يبدو أن تعتمد على كمية CNC في مركب bioink. كما تم تقييم صلاحية BMMCs بعد التعرض لدورة زمنية لسقالات الهيدروجيل التي تم تصنيعها من حبر المواد الحيوية التجارية المكونة من نانوسليلوز الرجفان (FNC) وألجينات الصوديوم باستخدام طابعة بيولوجية قذف ثلاثية الأبعاد. على مدى فترة 6-48 ساعة، لم تؤثر ركائز FNC/alginate سلبا على صلاحية BMMCs كما يحددها قياس التدفق الخلوي ومقايسات الميكروتتر (XTT وdhydrogenase اللاكتات). يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لفحص التوافق الكيميائي الحيوي للحبر الحيوية المرشحة بسرعة لفائدة سقالات ثلاثية الأبعاد للبذر بعد الطباعة مع الخلايا الصارية.
Introduction
وقد ركز الاهتمام الأخير في نظم الثقافة ثلاثية الأبعاد والطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد الاهتمام على الهيدروجيلات ومركبات الهيدروجيل. هذه المركبات بمثابة اللزوجة بعد المحاكاة الحيوية المسامية ويمكن أن تتكون من ما يصل إلى 99٪ محتوى المياه من حيث الوزن، وهو ما يماثل الأنسجة البيولوجية1،2،3. هذه السمات من مركبات هيدروجيل وبالتالي تسمح لنمو الخلايا دون التأثير على قدرتها على البقاء ووظيفتها. واحد من هذه المركبة هو نانوسليلوز البلورية (CNC)، والتي تم استخدامها كمادة تعزيز في مركبات الهيدروجيل، سقالات الخلية في تطوير يزرع المواد الحيوية، وفي ثنائي الأبعاد (2D) و 3D في ثقافة الخلايا المختبرية4،5. بالنسبة للجزء الأكبر، المصفوفات المكونة من CNC ليست سامة للخلايا الخلوية علنا إلى الخلايا الظهارية القرنية البشرية6، الخلايا الظهارية المعوية7، الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم البشري8، أو الخلايا العصبية الشبيهة9. ومع ذلك ، فإن النشاط الأيضي وانتشار الخلايا الجذعية المتوسطة المشتقة من نخاع العظم البشري يقلل من الارتباط مع زيادة لزوجة مركبات الخلايا النانوية القائمة على الخشب ، مما يشير إلى أنه يجب اختبار تكوين المصفوفة بعناية لآثارها الضارة على وظائف الخلية8.
وبالمثل ، يمكن أن تحفز CNC الاستجابات الالتهابية في الضامة عند الاستيعاب ، والتي يمكن أن يكون لها عواقب وخيمة في أنظمة زراعة الخلايا المناعية ثلاثية الأبعاد10،11. في الواقع ، هناك القليل جدا من البيانات المتاحة حول كيفية تأثير CNC على استجابات الخلايا المناعية الأخرى ، وخاصة الاستجابات الالتهابية التحسسية التي تبدأها الخلايا السارية. الخلايا الصارية هي الكريات البيض الحبيبية التي تعبر عن مستقبلات IgE عالية التقارب ، FceRI ، المسؤولة عن تنشيط الاستجابات الالتهابية لمسببات الحساسية. انتشارها والتمايز تعتمد على عامل الخلايا الجذعية (SCF), الذي يربط مستقبلات التيروزين, كيت. الخلايا الصاري مشتقة من خلايا السلف نخاع العظم التي تدخل الدورة الدموية وتهاجر بعد ذلك هامشيا لتفريق في كل مكان في جميع الأنسجة البشرية12. كما تعمل الخلايا الصاري في بيئة الأنسجة 3D، فهي مرشح مثالي للخلايا المناعية لدراسة العمليات المناعية في نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد في المختبر . ومع ذلك، حتى الآن، لا يوجد نموذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد قابلة للحياة في المختبر التي تحتوي على خلايا سارية.
نظرا للطبيعة الحساسة للغاية للخلايا الصاري وميلها إلى الحصول على استجابات مؤيدة للالتهابات للمحفزات الخارجية ، يلزم النظر بعناية في مكونات المصفوفة ثلاثية الأبعاد وطريقة الطباعة الحيوية لإدخال الخلايا السارية في السقالة ثلاثية الأبعاد ، كما نوقش أكثر. يمكن تصنيع الأنسجة من فئتين واسعتين من المواد الحيوية ، أي الدينك الحيوي وحبر المواد الحيوية. ويكمن التمييز في حقيقة أن المركبات البيولوجية هي مركبات هيدروجيل محملة بالخلايا، في حين أن أحبار المواد الحيوية هي مركبات هيدروجيل خالية من الخلايا، على النحو المحدد من قبل Groll et al.13,14. وبالتالي، تحتوي البنى ثلاثية الأبعاد المطبوعة بالأنك الحيوي على خلايا مضمنة مسبقا داخل مصفوفة الهيدروجيل، في حين أن البنى ثلاثية الأبعاد المطبوعة بحبر المواد الحيوية تحتاج إلى بذر بخلايا بعد الطباعة. يتم إجراء التصنيع الحيوي لسقالات الثقافة من الأحبار الحيوية / الأحبار الحيوية القائمة على الهيدروجيل بشكل شائع باستخدام الطابعات الحيوية ثلاثية الأبعاد البثق ، والتي تبرز حبر bioink / biomaterial من خلال فوهة صغيرة تحت الضغط إما عن طريق المكبس الهوائي أو الميكانيكي. تقوم الطابعات الحيوية البثق بتصنيع سقالات ثلاثية الأبعاد عن طريق إيداع المنك الحيوي في أنماط مقطعية ثنائية الأبعاد مكدسة بشكل متسلسل على بعضها البعض في نهج “من أسفل إلى أعلى”.
لتكون متوافقة مع الطباعة الحيوية البثق، يجب أن يكون الحبر bioink/biomaterial القائم على الهيدروجيل تمتلك خصائص التكستروبيك (القص رقيق)، حيث البوليمرات هيدروجيل المكونة للتدفق الحبر bioink / المواد الحيوية مثل السائل من خلال فوهة القنوات الدقيقة عندما تتعرض لضغوط القص، ولكن العودة إلى حالة لزجة، هلام مثل عند إزالة الإجهاد القص15 . نظرا لارتفاع محتوى المياه ، يجب ربط البوليمرات من الأحبار الحيوية / المواد الحيوية القائمة على الهيدروجيل ، إما ماديا أو مكافئا ، للحفاظ على الهندسة المعمارية والسلامة الهيكلية للبنية المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد. في حالة الخلايا المحملة bioinks ، تتعرض الخلايا مباشرة لضغوط كيميائية خلال عملية الربط. عملية الخلايا البثق مغلفة داخل مصفوفة هيدروجيل bioink يخضع أيضا الخلايا لإجهاد القص، والتي يمكن أن تؤدي إلى انخفاض القدرة على البقاء و / أو موت الخلية. وبمجرد طباعة نموذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد بيولوجيا، من الصعب التمييز بين مستويات السمية الخلوية التي تثيرها مصفوفة الهيدروجيل نفسها وعمليات البثق والربط المتبادل، على التوالي. وهذا يشكل تحديا خاصا في سياق السقالات ثلاثية الأبعاد حيث تكون الخلايا مضمنة مسبقا داخل مصفوفة الهيدروجيل، مما يجعل من الصعب إزالة الخلايا لإجراء تحليلات لاحقة، مما سيضر بقابلية الخلايا الصارية للحياة.
نهج ألطف لتوليد الأنسجة ثلاثية الأبعاد يبني تحتوي على الخلايا الصاري ينطوي على بذر الخلايا في المطبوعة مسبقا، والسقالات الحبر المواد الحيوية المسامية 3D من تعليق ثقافة الخلية، مما يعزز القدرة الفطرية للخلايا الصاري للهجرة من الدورة الدموية إلى الأنسجة الطرفية. فوائد هذا النهج البذر الخلية هي ذات شقين: (1) لا تخضع الخلايا الصاري للقص والضغوط الكيميائية من عمليات البثق والربط المتبادل، على التوالي، و (2) يمكن إزالة الخلايا بسهولة من سقالة 3D بعد التعرض عن طريق غسل لطيف للتحليل دون التأثير سلبا على قدرتها على البقاء. الفائدة الإضافية من البذر وتحليل صلاحية الخلية من الخلايا الصاري على 3D المطبوعة بيولوجيا، والسقالات هيدروجيل مسامية بدلا من أقراص هيدروجيل 2D هو أن السقالات هيدروجيل المطبوعة بيولوجيا 3D تلخص السمات الطوبوغرافية microscale في الأنسجة الحية ، والتي ليست موجودة بكميات كبيرة، 2D أقراص هيدروجيل مخطط. هذا النهج هو نهج مناسب وسريع وفعال من حيث التكلفة لتحديد الآثار السامة للخلايا الكارثية المحتملة لمصفوفات هيدروجيل البيونك المرشحة على الخلايا الصارية ، وكذلك الخلايا المناعية الأخرى ، قبل الاستثمار في التجارب الهندسية مكلفة الأنسجة ثلاثية الأبعاد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتطلب تصنيع الأنسجة المحاكاة الحيوية ثلاثية الأبعاد الدمج الناجح للدينك الحيوي ، الذي يحاكي مكونات المصفوفة خارج الخلية ، مع المكون الخلوي (المكونات) لإنشاء تناظرات فسيولوجية في الأنسجة الحية . وهذا يتطلب استخدام الخلايا الأولية، وليس الخلايا المتحولة، عند تصنيع الأنسجة المحاكاة ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ألبرتا الابتكار لتوفير CNC وكين هاريس وجاي يونغ تشو لمشورتهم التقنية عند إعداد مصفوفة CNC / agarose / D – mannitol. نشكر أيضا بن هوفمان وهيذر وينشيل ونيكول ديامانتييدات على نصائحهم التقنية ودعمهم بإعداد ومعايرة الطابعة الحيوية INKREDIBLE+ ثلاثية الأبعاد.
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
- Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).
- Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
- Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
- Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
- Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
- Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
- Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
- Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
- Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
- Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
- Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
- Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
- Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).
