Fabricación de una tinta de biomaterial de agarosa incrustada en nanocelulosa cristalina para el cultivo de mastocitos derivados de la médula ósea
Summary
Este protocolo destaca un método para evaluar rápidamente la biocompatibilidad de una tinta de biomaterial de hidrogel compuesto de nanocelulosa cristalina (CNC)/agarosa con mastocitos derivados de la médula ósea de ratón en términos de viabilidad celular y expresión fenotípica de los receptores de la superficie celular, Kit (CD117) y receptor IgE de alta afinidad (FcεRI).
Abstract
La bioimpresión tridimensional (3D) utiliza compuestos a base de hidrogel (o tintas de biomateriales) que se depositan en un patrón, formando un sustrato sobre el que se depositan las células. Debido a que muchas tintas de biomateriales pueden ser potencialmente citotóxicas para las células primarias, es necesario determinar la biocompatibilidad de estos compuestos de hidrogel antes de su utilización en costosos procesos de ingeniería de tejidos 3D. Algunos métodos de cultivo 3D, incluida la bioimpresión, requieren que las células se incrusten en una matriz 3D, lo que dificulta la extracción y el análisis de las células en busca de cambios en la viabilidad y la expresión de biomarcadores sin provocar daños mecánicos. Este protocolo describe como prueba de concepto, un método para evaluar la biocompatibilidad de un compuesto de agarosa incrustado de nanocelulosa cristalina (CNC), fabricado en un sistema de cultivo de 24 pocillos, con mastocitos derivados de médula ósea de ratón (BMMC) utilizando ensayos citométricos de flujo para la viabilidad celular y la expresión de biomarcadores.
Después de 18 h de exposición a la matriz CNC/agarosa/D-manitol, la viabilidad de BMMC no se alteró según lo medido por la permeabilidad del yoduro de propidio (PI). Sin embargo, los BMMC cultivados en el sustrato CNC/agarosa/D-manitol parecieron aumentar ligeramente su expresión del receptor IgE de alta afinidad (FcεRI) y el receptor del factor de células madre (Kit; CD117), aunque esto no parece depender de la cantidad de CNC en el compuesto de biotinta. La viabilidad de los BMMC también se evaluó después de una exposición prolongada a andamios de hidrogel que se fabricaron a partir de una tinta de biomaterial comercial compuesta de nanocelulosa fibrilar (FNC) y alginato de sodio utilizando una bioimpresora de extrusión 3D. Durante un período de 6-48 h, los sustratos FNC/alginato no afectaron negativamente a la viabilidad de los BMMCs según lo determinado por la citometría de flujo y los ensayos de microtituladores (XTT y lactato deshidrogenasa). Este protocolo describe un método eficiente para evaluar rápidamente la compatibilidad bioquímica de las tintas de biomateriales candidatas para su utilidad como andamios 3D para la siembra posterior a la impresión con mastocitos.
Introduction
El reciente interés en los sistemas de cultivo 3D y la bioimpresión 3D ha centrado la atención en los hidrogeles y los compuestos de hidrogel. Estos compuestos sirven como biomiméticos viscosos pero porosos y pueden estar compuestos de hasta un 99% de contenido de agua en peso, lo que es comparable a los tejidos biológicos1,2,3. Estas características de los compuestos de hidrogel permiten el crecimiento de las células sin afectar su viabilidad y función. Uno de estos compuestos es la nanocelulosa cristalina (CNC), que se ha utilizado como material de refuerzo en compuestos de hidrogel, andamios celulares en el desarrollo de implantes de biomateriales y en cultivos celulares bidimensionales (2D) y 3D in vitro4,5. En su mayor parte, las matrices compuestas de CNC no son abiertamente citotóxicas para las células epiteliales corneales humanas6, las células epiteliales intestinales7, las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea humana8 o las células similares a las neuronas9. Sin embargo, la actividad metabólica y la proliferación de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea humana disminuye en correlación con el aumento de la viscosidad de los compuestos de nanocelulosa a base de madera, lo que sugiere que la composición de la matriz debe probarse cuidadosamente por sus efectos nocivos sobre las funciones celulares8.
Del mismo modo, el CNC puede inducir respuestas inflamatorias en macrófagos tras la internalización, lo que podría tener graves consecuencias en los sistemas de cultivo de células inmunes 3D10,11. De hecho, hay muy pocos datos disponibles sobre cómo el CNC puede influir en otras respuestas de las células inmunes, particularmente las respuestas inflamatorias alérgicas que son iniciadas por los mastocitos. Los mastocitos son leucocitos granulados que expresan el receptor IgE de alta afinidad, FceRI, responsable de activar las respuestas inflamatorias a los alérgenos. Su proliferación y diferenciación dependen del factor de células madre (SCF), que se une al receptor de tirosina, Kit. Los mastocitos se derivan de células progenitoras de la médula ósea que entran en la circulación y posteriormente migran periféricamente para dispersarse ubicuamente en todos los tejidos humanos12. Como los mastocitos funcionan en un entorno de tejido 3D, son un candidato ideal para células inmunes para estudiar procesos inmunológicos en modelos de tejidos 3D in vitro. Sin embargo, hasta la fecha, no existe un modelo de tejido 3D in vitro viable que contenga mastocitos.
Debido a la naturaleza altamente sensible de los mastocitos y su propensión a provocar respuestas proinflamatorias a estímulos externos, se requiere una cuidadosa consideración de los constituyentes de la matriz 3D y el método de bioimpresión para introducir mastocitos en el andamio 3D, como se discutió más adelante. Las construcciones de tejidos pueden ser biofabricadas a partir de dos amplias categorías de biomateriales, es decir, biotintas y tintas de biomateriales. La distinción radica en el hecho de que las biotintas son compuestos de hidrogel cargados de células, mientras que las tintas de biomateriales son compuestos de hidrogel que carecen de células, según lo definido por Groll et al.13,14. Por lo tanto, las construcciones 3D impresas con biotintas contienen células preincrustadas dentro de la matriz de hidrogel, mientras que las construcciones 3D impresas con tintas de biomateriales deben sembrarse con células después de la impresión. La biofabricación de andamios de cultivo a partir de biotintas/tintas de biomateriales a base de hidrogel se realiza más comúnmente utilizando bioimpresoras 3D de extrusión, que extruyen la tinta biotinta/biomaterial a través de una boquilla a microescala bajo presión a través de un pistón accionado neumática o mecánicamente14. Las bioimpresoras de extrusión fabrican andamios 3D depositando la biotinta en patrones de sección transversal 2D que se apilan secuencialmente entre sí en un enfoque de “abajo hacia arriba”.
Para ser compatible con la bioimpresión por extrusión, la tinta biotinta/biomaterial a base de hidrogel debe poseer propiedades tixotrópicas (adelgazamiento por cizallamiento), por lo que los polímeros de hidrogel constituyentes de la tinta biotinta/biomaterial fluyen como un fluido a través de una boquilla de microcanal cuando se someten a tensión de cizallamiento, pero vuelven a un estado viscoso similar al gel al eliminar la tensión de corte15 . Debido a su alto contenido de agua, los polímeros de biotintas/biomateriales a base de hidrogel deben estar reticulados, ya sea física o covalentemente, para mantener la arquitectura y la integridad estructural de la estructura bioimpresa en 3D. En el caso de las biotintas cargadas de células, las células se someten directamente a tensiones químicas durante el proceso de reticulación. El proceso de extrusión de células encapsuladas dentro de la matriz de hidrogel biotinta también somete a las células a estrés cortante, lo que puede conducir a una viabilidad reducida y / o la muerte celular. Una vez bioimpreso el modelo tisular 3D, es difícil discriminar entre los niveles de citotoxicidad provocados por la propia matriz de hidrogel y los procesos de extrusión y reticulación, respectivamente. Esto es particularmente desafiante en el contexto de andamios 3D donde las células están preincrustadas dentro de la matriz de hidrogel, lo que dificulta la eliminación de las células para análisis posteriores, lo que sería perjudicial para la viabilidad de los mastocitos.
Un enfoque más suave para generar construcciones de tejido 3D que contienen mastocitos implica sembrar las células en andamios 3D de tinta de biomaterial poroso preimpresos a partir de una suspensión de cultivo celular, lo que aprovecha la capacidad innata de los mastocitos para migrar de la circulación a los tejidos periféricos. Los beneficios de este enfoque de siembra celular son dobles: (i) los mastocitos no están sujetos a tensiones químicas y de corte de los procesos de extrusión y reticulación, respectivamente, y (ii) las células se pueden extraer fácilmente del andamio 3D después de la exposición mediante un lavado suave para su análisis sin afectar negativamente su viabilidad. El beneficio adicional de sembrar y analizar la viabilidad celular de los mastocitos en andamios de hidrogel porosos bioimpresos en 3D en comparación con los discos de hidrogel 2D es que los andamios de hidrogel bioimpresos 3D recapitulan las características topográficas a microescala de los tejidos in vivo , que no están presentes en los discos de hidrogel plano 2D a granel. Este enfoque es un enfoque adecuado, rápido y rentable para determinar los efectos citotóxicos potencialmente catastróficos de las matrices de hidrogel de biotinta candidatas en los mastocitos, así como en otras células inmunológicas, antes de la inversión en costosos experimentos de ingeniería de tejidos en 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fabricación de tejidos biomiméticos 3D requiere la amalgama exitosa de la biotinta, que imita los componentes de la matriz extracelular, con los componentes celulares para crear análogos fisiológicos de los tejidos in vivo . Esto requiere el uso de células primarias, y no células transformadas, al fabricar tejidos biomiméticos fisiológicos. Sin embargo, las células inmunológicas primarias, como los mastocitos, son particularmente susceptibles a los efectos citotóxicos y a los cambios fenotípicos q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Alberta Innovates por proporcionar el CNC y a Ken Harris y Jae-Young Cho por su asesoramiento técnico al preparar la matriz CNC/agarosa/D-manitol. También agradecemos a Ben Hoffman, Heather Winchell y Nicole Diamantides por su asesoramiento técnico y apoyo con la configuración y calibración de la bioimpresora 3D INKREDIBLE+.
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
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