Summary
Denne protokol fremhæver en metode til hurtigt at vurdere biokompatibiliteten af en krystallinsk nanocellulose (CNC)/agarose komposit hydrogel biomateriale blæk med mus knoglemarvs-afledt mastceller i form af celle levedygtighed og fænotypiske udtryk for celleoverfladen receptorer, Kit (CD117) og høj affinitet IgE receptor (FcεRI).
Abstract
Tredimensionel (3D) bioprint udnytter hydrogelbaserede kompositter (eller biomateriale blæk), der deponeres i et mønster og danner et substrat, hvorpå celler deponeres. Fordi mange biomateriale blæk kan være potentielt cytotoksiske til primære celler, er det nødvendigt at bestemme biokompatibiliteten af disse hydrogel kompositter forud for deres udnyttelse i dyre 3D-væv engineering processer. Nogle 3D-kulturmetoder, herunder bioprint, kræver, at celler indlejres i en 3D-matrix, hvilket gør det vanskeligt at udtrække og analysere cellerne for ændringer i levedygtighed og biomarkørudtryk uden at fremkalde mekanisk skade. Denne protokol beskriver som proof of concept, en metode til at vurdere biokompatibiliteten af en krystallinsk nanocellulose (CNC) indlejret agarosekomposit, fremstillet i et 24-brønds kultursystem med musebenmarvsbaserede mastceller (BMMCs) ved hjælp af flowcytometriske analyser for celle levedygtighed og biomarkørudtryk.
Efter 18 timers eksponering for CNC/agarose/D-mannitolmatrixen blev BMMC's levedygtighed uændret målt ved propidiumidodi (PI) permeabilitet. BMMCs, der dyrkes på CNC/agarose/D-mannitolsubstratet , syntes imidlertid at øge deres udtryk for den høje affinitets-IgE-receptor (FcεRI) og stamcellefaktorreceptoren (Kit; CD117), selv om dette ikke synes at være afhængig af mængden af CNC i bioink komposit. BMMCs' levedygtighed blev også vurderet efter et tidsinterval, der blev udsat for hydrogel-stilladser, der var fremstillet af et kommercielt biomaterialeblæk bestående af fibrillar nanocellulose (FNC) og natriumalginat ved hjælp af en 3D-ekstruderingsbioprinter. I en periode på 6-48 timer påvirkede FNC/alginatsubstraterne ikke BMCCs levedygtighed negativt som bestemt af flowcytometri- og mikrotiteranalyser (XTT- og laktatdehydrogenase). Denne protokol beskriver en effektiv metode til hurtigt at screene den biokemiske kompatibilitet af kandidat biomateriale blæk for deres nytte som 3D stilladser til post-print såning med mast celler.
Introduction
Den seneste interesse for 3D-kultursystemer og 3D bioprinting har fokuseret opmærksomheden på hydrogels og hydrogelkompositter. Disse kompositter tjener som tyktflydende endnu porøse biomimetik og kan bestå af op til 99% vandindhold efter vægt, hvilket kan sammenlignes med biologisk væv1,2,3. Disse træk ved hydrogel kompositter dermed tillade vækst af celler uden at påvirke deres levedygtighed og funktion. En sådan komposit er krystallinsk nanocellulose (CNC), som er blevet brugt som et forstærkende materiale i hydrogel kompositter, celle stilladser i udviklingen af biomateriale implantater, og i to-dimensionelle (2D) og 3D in vitro celle kultur4,5. For det meste er matricer bestående af CNC ikke åbenlyst cytotoksiske til menneskelige hornhinde epitelceller6, intestinale epitelceller7, menneskelige knoglemarvsbaserede mesenkymale stamceller8 eller neuronlignende celler9. Metabolisk aktivitet og spredning af menneskelige knoglemarvsbaserede mesenkymale stamceller falder imidlertid i sammenhæng med den øgede viskositet af træbaserede nanocellulosekompositter, hvilket tyder på, at matrixens sammensætning skal testes omhyggeligt for dens skadelige virkninger på cellefunktioner8.
På samme måde kan CNC fremkalde inflammatoriske reaktioner i makrofager ved internalisering, hvilket kan have alvorlige konsekvenser i 3D immuncellekultursystemer10,11. Faktisk er der meget få data tilgængelige om, hvordan CNC kan påvirke andre immuncelleresponser, især allergiske inflammatoriske reaktioner, der er initieret af mastceller. Mastceller er granulerede leukocytter, der udtrykker den høje affinitet IgE receptor, FceRI, ansvarlig for aktivering inflammatoriske reaktioner på allergener. Deres spredning og differentiering er afhængige af stamcellefaktor (SCF), som binder tyrosin receptor, Kit. Mastceller er afledt af knoglemarvs stamfader celler, der kommer ind i cirkulationen og efterfølgende migrere perifert at sprede allestedsnærværende i alle menneskelige væv12. Da mastceller fungerer i et 3D-vævsmiljø, er de en ideel immuncellekandidat til at studere immunologiske processer i in vitro 3D-vævsmodeller. Til dato er der dog ingen levedygtig in vitro 3D-vævsmodel, der indeholder mastceller.
På grund af mastcellernes meget følsomme karakter og deres tilbøjelighed til at fremkalde proinflammatoriske reaktioner på eksterne stimuli kræves omhyggelig overvejelse af 3D-matrixbestanddelene og bioprintmetoden til at introducere mastceller i 3D-stilladset, som diskuteret yderligere. Vævskonstruktioner kan biofabrikeres fra to brede kategorier af biomaterialer, dvs. bioinks og biomateriale blæk. Sondringen ligger i, at bioinks er cellebelastede hydrogelkompositter, mens biomateriale blæk er hydrogelkompositter, der er blottet for celler, som defineret af Groll et al.13,14. Derfor indeholder 3D-konstruktioner trykt med bioinks celler, der er indlejret i hydrogelmatrixen, mens 3D-konstruktioner trykt med biomaterialefarver skal sås med celler efter udskrivning. Biofabrication af kultur stilladser fra hydrogel-baserede bioinks / biomateriale blæk er oftest udføres ved hjælp af ekstrudering 3D bioprintere, som ekstruderer bioink / biomateriale blæk gennem en mikroskala dyse under tryk via enten en pneumatically eller mekanisk drevet stempel14. Ekstrudering bioprintere fabrikerer 3D-stilladser ved at deponere bioinken i 2D-tværsnitsmønstre, der sekventielt stables på hinanden i en 'bottom-up'-tilgang.
For at være kompatibel med ekstruderingsbioprinting skal den hydrogelbaserede bioink/biomaterialeblæk have thixotrope (forskydningsfortyndende) egenskaber, hvorved bioink/biomaterialeblæks konstituerende hydrogelpolymmer flyder som en væske gennem en mikrokanaldyse, når de udsættes for forskydningsstress, men vender tilbage til en tyktflydende gellignende tilstand ved fjernelse af forskydningsstress15 . På grund af deres høje vandindhold skal polymererne af hydrogelbaserede bioinks/biomaterialeblæk være krydslinket, enten fysisk eller kovalent, for at opretholde arkitekturen og den strukturelle integritet af den bioprintede struktur med 3D-bioprintet. I tilfælde af cellebelastede bioinks udsættes cellerne direkte for kemiske belastninger under krydslinkprocessen. Processen med ekstrudering af celler indkapslet i bioink hydrogel matrix også udsætter cellerne for at forskyde stress, hvilket kan føre til nedsat levedygtighed og / eller celledød. Når 3D-vævsmodellen er blevet bioprintet, er det vanskeligt at skelne mellem de niveauer af cytotoksicitet fremkaldt af hydrogelmatrixen selv og ekstruderings- og krydslinkingsprocesserne. Dette er især udfordrende i forbindelse med 3D-stilladser, hvor cellerne er indlejret i hydrogelmatrixen, hvilket gør det vanskeligt at fjerne cellerne til efterfølgende analyser, hvilket ville være skadeligt for mastcellernes levedygtighed.
En blidere tilgang til generering af 3D-vævskonstruktioner, der indeholder mastceller, indebærer såning af cellerne i fortrykt, porøs biomaterialeblæk 3D-stilladser fra en cellekulturophængning, hvilket udnytter mastcellernes medfødte evne til at migrere fra cirkulationen til perifert væv. Fordelene ved denne cellesåningsmetode er dobbelt: (i) mastcellerne udsættes ikke for forskydning og kemiske belastninger fra henholdsvis ekstruderings- og krydslinkingsprocesserne, og (ii) cellerne let kan fjernes fra 3D-stilladset efter eksponering ved skånsom vask til analyse uden at påvirke deres levedygtighed negativt. Den yderligere fordel ved såning og analyse af mastcellernes celle levedygtighed på 3D bioprintede, porøse hydrogel stilladser i modsætning til 2D hydrogelskiver er, at 3D bioprintede hydrogel stilladser generobrer mikroskala topografiske træk ved in vivovæv , som ikke er til stede i bulk, 2D planar hydrogel diske. Denne tilgang er en passende, hurtig og omkostningseffektiv tilgang til at bestemme de potentielt katastrofale cytotoksiske virkninger af kandidat bioink hydrogel matricer på mastceller, samt andre immunologiske celler, forud for investeringer i dyre 3D væv engineering eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol består af fem afsnit: (1) isolering af musebenmarv og differentiering af musebenvsbaserede mastceller (BMMCs), (2) fremstilling af CNC/agarose/D-mannitol hydrogel substrater i et 24-brøndssystem og -kultur af BMMCs på substraterne, (3) fjernelse af BMMCs fra CNC/agarose/D-mannitol hydrogel substrater og analyse af levedygtighed og biomarkørudtryk ved hjælp af flowcytometri, (4) 3D bioprint af hydrogel stilladser fra en kommercielt tilgængelig fibrillar nanocellulose (FNC)/natriumalginat sammensat biomateriale blæk, og (5) kultur af BMMCs på FNC / natrium alginat hydrogel stilladser og analyse af levedygtighed ved hjælp af flowcytometri, XTT, og laktat dehydrogenase (LDH) mikrotiter assays.
1. Generation af BMMC-kulturen
BEMÆRK: Mus blev aflivet ved CO2-kvælning efter isofluran anæstesi. Skinnebenet og lårbenet blev isoleret, og hele knoglemarven blev høstet. Alle dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med det canadiske råd for dyrepleje retningslinjer og politikker med godkendelse fra Health Science Animal Care and Use Committee for University of Alberta.
- Forbered komplet RPMI-1640 kulturmedium ved at tilføje de kosttilskud, der er anført i tabel 1 , til de angivne endelige koncentrationer. Mediums pH-tilstand justeres til 7,4-7,6 ved hjælp af NaOH, filtersterilaliseres ved hjælp af et engangs-flaske-top-filter (0,2 μm porestørrelse) og opbevares ved 4 °C i mørke i op til 2 måneder.
- Få lårben fra mus i overensstemmelse med de lokale University Animal Care Committee protokoller og procedurer.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev lårben isoleret fra C57BL/6 mus, men enhver belastning kan anvendes, hvis det er relevant for undersøgelsen. - Brug en saks, fjern hud og muskler fra hofteleddet, og træk derefter forsigtigt lårbenet ved at vride lidt ud af hoftestikket (Figur 1). Pas på ikke at brække lårhovedet af. Skær skinnebenet væk fra lårbenet ved den mediale fabella ved hjælp af en saks. Fjern poten ved at skære lige over calcaneum og kassér.
- Brug en skalpel, fjern hud og brusk fra lårben og skinneben stykker. Brug en saks, lav et rent snit i hver ende af lårbenet og skinnebenet, udsætter den røde knoglemarv indeni. Hvis det er nødvendigt, fjerne fibula på dette punkt, men bemærk, at det kan støtte i manipulation af skinnebenet under knoglemarvsskylning.
- Forbered en 26 G nål med en 5 mL luer-lock sprøjte, og fyld med ca. 5 mL komplette medier forberedt som beskrevet ovenfor.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan ufuldstændigt RPMI uden tilsætningsstoffer også bruges til at spare på reagenser. - Hold lårbenet eller skinnebenet med sammenklik, sæt nålen i den ene ende af knoglen og tryk forsigtigt på sprøjten. Hold knoglen over et sterilt rør på 50 mL, og sprøjt forsigtigt ca. 5 mL medium ind i knoglen, og tryk lidt pres. Overhold stykker knoglemarv falder ud i den anden ende af knoglen som tynde røde bånd og ind i det koniske rør.
- Skru ned for aspirater og resuspend i komplet medium, eller overfør direkte til en T175 cm2 steril vævskultur kolbe indeholdende 50 mL komplet RPMI-1640 medium. Bevar aspiraterne i komplet RPMI-1640 medium med 30 ng/mL mus rekombinant interleukin (IL)-3.
- Efter 1 dag observerer kulturerne under et let mikroskop. Kulturen vil bestå af en heterogen population af celler i forskellige former og størrelser og endnu større stykker knoglemarv. Fodercellekulturer ved at tilføje 15 mL frisk medium hver 3-5 dage ved hjælp af hele RPMI-1640-mediet som beskrevet ovenfor, og sørg for, at celletætheden aldrig overstiger 1 × 106 celler / mL. En gang om ugen, spinde ned celler på 200 × g i 5 min ved stuetemperatur, genbruges i frisk komplet RPMI-1640 medium, og split 1:4 i 50 mL medium i friske T175 kolber.
- Efter 4 uger bestemmes cellerenhed ved at måle overfladeudtrykket af CD117-receptorer (Kit) og FceRI-receptorer efter flowcytometri som beskrevet nedenfor (afsnit 3.2).
BEMÆRK: Efter 4 uger skal 99% af cellerne være dobbeltpositive for CD117 (Kit) og FcεRI. - Efter 4 uger og fremefter skal BMMCs med 20 ng/mL IL-3 i komplet RPMI-1640 medium. På ca 6 uger, vil cellerne stoppe dividere og vil ikke længere kræve opdeling. Foder kulturer hver 3-5 dage, pellet cellerne ved centrifugering en gang om ugen, og genbruges i frisk komplet RPMI-1640 medium.
2. Fremstilling af CNC/agarose/D-mannitol hydrogel substrater og BMMC kultur
- I en glasflaske tilsættes 0,2 g agarosepulver til fosfatbufferet saltvand (PBS) (2% w/v) til et endeligt volumen på 10 mL, og kog i 1 min ved 100 °C for at opløses.
- 2,5 g CNC-pulver opløses i PBS til et endeligt volumen på 10 mL for at forberede en 25% w/v blanding.
- Opløs 2 g CNC-pulver i PBS til et endeligt volumen på 10 mL for at forberede en 20% w / v blanding, og serielt fortynde 20% w / v blandingen til at forberede 10, 5 og 2% w / v CNC blandinger.
- Opvarm 25, 20, 10, 5 og 2% w/v CNC-blandingerne til 37 °C i 10 min (figur 2A).
- Der tilsættes 0,46 g D-mannitol til den varme agaroseopløsning (4,6% w/v) og opløses.
- Bland de forvarmede 25, 20, 10, 5 og 2% w/v CNC-PBS blandinger med den varme agarose/D-mannitolopløsning i separate koniske rør i et 1:1-forhold for at give endelige CNC-koncentrationer på 12,5, 10, 5, 2,5 og 1% w /v i hydrogelblandingerne.
- Arbejde hurtigt, tilsæt 500 μL/brønd af de ovennævnte opløsninger udarbejdet i trin 2.6 i firedobbelt til en 24-brønd kultur plade, og lad stå i 30 min ved stuetemperatur for at lette polymerisering (Figur 2B).
- Lag forsigtigt 1000 μL af BMMC-suspensionen ved en densitet på 1,1 × 106 celler/ml oven på hydrogelsubstraterne med en mikropipettor, og undgå at røre gelen med spidsen af pipetten, da dette vil beskadige geloverfladen og generere partikler.
- Inkuberes BMMCs på hydrogel substrater i en steril inkubator (5% CO2, befugtet atmosfære) ved 37 °C i 18 timer.
3. Flow cytometriske analyser
- Flow cytometrisk analyse af BMMC levedygtighed via PI udelukkelse
- Fjern forsigtigt kulturmediet, der indeholder BMMCs, fra toppen af CNC/agarose/D-mannitolen, undgå gelen, og overfør cellerne til et 1,5 mL mikrofugerør.
- BMMCs vaskes to gange med PBS (pH 7.4), der indeholder 0,5% w/v kvægserum albumin ved 300 × g i 5 min ved stuetemperatur, og genanvendes i 180 μL PBS-0,5% w/v BSA til en endelig tæthed på 1,5 × 106 celler/mL. Overfør cellerne til en 96 godt rundbundet plade.
BEMÆRK: Filtersterilalisere alle PBS-0,5% w/v BSA-opløsninger to gange ved hjælp af et sprøjtefilter i 0,2 μm porestørrelse og opbevares ved 4 °C. - Der tilsættes 20 μL PBS-0,5% w/v BSA eller 10x PI (100 μg/mL), der er fremstillet i PBS-0,5 % w/v BSA, til cellerne i en endelig koncentration på 10 μg/mL, og inkuberes i enten 1 time ved 4 °C eller 15 min ved stuetemperatur i mørke. Erhverve fluorescens data ved hjælp af en flow cytometer udstyret med en Argon ion laser (488-514 nm) og bandpass filter til at muliggøre påvisning af fluorescens emission ved 578 nm. Der indvendes 20.000 hændelser pr. prøve med en strømningshastighed på 30 μL/min ved stuetemperatur. Analysere dataene som beskrevet nedenfor (punkt 3.2.7-3.2.10).
- Flow cytometrisk analyse af BMMCs for Kit (CD117) og FcεRI overflade receptor udtryk
- Fjern forsigtigt kulturmediet, der indeholder BMMCs, fra toppen af CNC/agarose/D-mannitolen, undgå gelen, og overfør cellerne til et 1,5 mL mikrofugerør.
- Vask BMMCs to gange med filtreret PBS-0,5% BSA ved 300 × g i 5 min ved stuetemperatur, og genanvendes i 180 μL PBS indeholdende 0,5% w/v BSA (1,5 × 106 celler/mL). Overfør de ophængte celler til en 96-godt rundbundet plade.
- Der tilsættes 20 μL 10x antistofarbejdsløsninger til cellerne for at opnå en endelig koncentration på henholdsvis 0,06 μg/mL CD117 (c-Kit)-phycoerythrin (PE) og 0,06 μg/mL af FcεRIα-allophycocyanin (APC).
BEMÆRK: 10x antistofarbejdsopløsningerne skal fremstilles i filtersteriliseret PBS-0,5% w/v BSA. - Der tilsættes 20 μL 10x isotypestyringsarbejdsløsninger, der indeholder enten rotte IgG2b κ isotype control-PE eller armensk hamster IgG isotype control-APC, for at adskille brønde, der indeholder celler, der ikke er blevet plettet med nogen af antistoffluoriortkonjuporterne i trin 3.2.3.
BEMÆRK: Isotypekontrollerne, rotte IgG2b κ isotype control-PE og armensk hamster IgG isotype control-APC tjener til at kontrollere for ikke-specifik fastgørelse af antistoffer til BMMC. Da BMMCs ikke udtrykker høje niveauer af FcR, er der sjældent høj baggrund fluorescens opdaget med isotype kontrol antistoffer. Klargør 10x isotypestyringsarbejdsløsninger i filtersteriliseret PBS-0,5% w/v BSA. - Inkuberes den 96-brønd runde bundplade i 1 time ved 4 °C i mørke.
- Vask cellerne ved at tilsætte 200 μL frisk PBS-0,5% w/v BSA buffer til hver brønd og centrifuge ved 300 × g i 5 min ved stuetemperatur. Gentag vasketrinnet igen. Fjern forsigtigt supernatanten uden at røre cellepillen; efterlade nogle supernatant for at sikre, at cellepillen forbliver uforstyrret.
- Efter vask skal celler genbruges i 100 μL på 0,5 % w/v BSA, 0,05 % w/v natriumhyrde i PBS (pH 7,4), der er blevet sterilfiltreret to gange med et sprøjtefilter på 0,2 μm porestørrelse. Erhverve fluorescens data i PE og APC detektor kanaler ved hjælp af en flow cytometer, som beskrevet ovenfor i trin 3.1.3.
- Analyser data ved hjælp af software, der er i stand til at se og analysere flowcytometriske datafiler med udvidelsen ".fcs".
- Begynd analyse ved at plotte fremad scatter (FSC) langs x-aksen og side scatter (SSC) langs y-aksen, og porten til den bevarede cellepopulation med et FSC-område af log10 1,5-5,0 og et SSC-område af log10 0,75-3,25 i de ubehandlede og ikke-farvede celler som vist i figur 3A (i),(ii).
BEMÆRK: Dette tjener til at sikre, at celleaffald med lave FSC- og SSC-værdier elimineres fra analysen. Mastceller er normalt meget granulære (høje SSC) celler og store (høj FSC) sammenlignet med andre immunologiske celletyper, såsom monocytter og lymfocytter. - Dernæst generere FSC vs SSC prik plots og histogram profiler af ubehandlede prøver, der er blevet farves med farvestof, antistoffer, eller isotype kontrol, og opnå gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) i PE eller APC kanaler i henhold til emission spektrum af de specifikke antistof-fluorophore konjugat eller farvestof, der anvendes. Anvende det samme sæt porte og parametre på alle BMMC-prøver, der er inkuberet med forskellige CNC/agarose/D-mannitolsubstrater og farvestoffer med de tilsvarende isotypekontroller, antistoffer eller farvestof få MFI'er.
BEMÆRK: I det væsentlige bør FSC vs SSC priklodder af de ubehandlede farvede prøver ikke kunne skelnes fra ubehandlede/ikke-farvede prøver, der er fremstillet i trin 3.2.9, for at sikre, at farvningsproceduren ikke ændrer cellestørrelsen (målt ved FSC) eller granularitet (målt ved SSC) (figur 3A(i),(ii)). - Beregn gennemsnitlige MFI'er og standardfejl af middelværdi (SEM) for hver prøve fra 4 uafhængige eksperimenter efterfulgt af generering af grafer ved hjælp af en softwarepakke til statistisk analyse.
- Forbered histogrammeoverlejringer i flowcytometridataanalysesoftwaren (figur 3B, 4A(ii),B(ii)).
4.3D Bioprinting af FNC/natriumalginathydratsubstrater
BEMÆRK: Den 3D-bioprinter, der anvendes i denne undersøgelse, er et pneumatisk ekstruderingssystem udstyret med to uafhængige, temperaturstyrede printhoveder. Det biomaterialeblæk, der anvendes til 3D bioprint hydrogel stilladserne, er formuleret af (a) meget hydreret fibrillar nanocellulose (FNC), som er morfologisk ligner kollagen, (b) natriumalginat og (c) D-mannitol. Den leveres som en steril hydrogelaffjedring i 3 ml patroner, hvortil sterile luer-lock koniske bioprinting dyser (22, 25 eller 27 G) kan fastgøres.
- Brug denne protokol sammen med printhovederne og printet ved stuetemperatur, hvor rumtemperaturen er 20-25 °C.
- Opbevar biomaterialeblækpatronerne ved 4 °C for at opretholde stabiliteten af hydrogelkompositlen. Før 3D-bioprint påbegyndes, skal du fjerne en patron (3 mL) fra køleskabet og gøre det muligt at ekvilibrere til stuetemperatur.
- Installation af en Bioink patron på INKREDIBLE+ 3D Bioprinter
- Fjern de blå endehætter fra den 3 ml biomaterialeblækpatron (figur 5B(i)), og anbringe en steril 22 G (blå) koniske bioprinting dyse på luer-lock enden af Bioink patronen.
BEMÆRK: Det er vigtigt at anbringe den ønskede koniske bioprinting dyse på bioink patronen, før du installerer patronen og udfører de efterfølgende kalibreringstrin, da hvis du ikke gør det, vil det resultere i forkert kalibrering af z-aksen på 3D-bioprinteren. - Tilslut lufttryksforsyningsrøret til printhoved 1 (PH1, til venstre) til den modsatte ende af patronen, og sæt patronen med den tilhørende koniske bioprintdyse i PH1's lodrette slot (figur 5A(ii)).
- Sæt patronen fast i PH1 med den koniske bioprintdyse, der strækker sig under printhovedet. Stram skruen på PH1 med uret, indtil fingertæt for at låse Bioink patronen på plads. Bemærk, at 3D bioprint kan udføres med PH2 venstre tom.
- Fjern de blå endehætter fra den 3 ml biomaterialeblækpatron (figur 5B(i)), og anbringe en steril 22 G (blå) koniske bioprinting dyse på luer-lock enden af Bioink patronen.
- Kalibrering af x-y-z akserne i 3D bioprinteren
- Tænd for 3D-bioprinteren, og start bioprintersoftwaren på en pc, der er tilsluttet 3D-bioprinteren via et USB 2.0-kabel.
- Klik på knappen CONNECT i softwaren for at synkronisere softwaren med 3D-bioprinteren.
BEMÆRK: Synkroniseringen lykkes, når det ultraviolette lysdiodelys, der udsender ultraviolet lys, tændes og slukkes, og HEPA-filterventilatoren slukker og tændes igen. Softwaren skal synkroniseres med 3D-bioprinteren, før bioprinterakserne og udgangspunktskalibreringen skal finpudses som beskrevet i de efterfølgende trin. - Overhold fire muligheder i hovedkontrolmenuen på 3D-bioprinteren: (i) PREPARE BIOPRINT, (ii) BIOPRINT, (iii) UTILITIES MENU og (iv) STATUS SCREEN. Vælg indstillingen FORBERED BIOPRINT , og rul derefter ned til , og vælg indstillingen HOME AXES .
BEMÆRK: 3D-bioprinteren flytter derefter printhead-samlingen frem og venstre for at kalibrere henholdsvis y- og x-akserne. Derefter, når printhovederne er sat på pause yderst til venstre, hæver bioprinteren printbedet, indtil z-aksekalibreringskontakten (placeret på printbedet) kommer i kontakt med den koniske bioprintdyse, der er installeret på printhead 1 - Efter vellykket kalibrering af x-y-z-akserne skal du observere den lille sænkning af printbedet og flytningen af printhovederne til over det centrale punkt på printbedet (figur 5A(i)).
- Udgangspunktskalibrering af bioprinteren til bioprint i 24-brøndsplader
- Fjern en steril 24-brønd kultur plade fra sin forseglede plast indpakning, og markere en prik af i midten punkt af godt D1 på undersiden af pladen med en permanent markør. Fjern pladedækslet, og placer 24-brøndskulturpladen på printbedet med brønd D1 placeret i det forreste venstre hjørne af printbedet.
- Vælg MENUEN UTILITIES i hovedkontrolmenuen, og vælg derefter FLYT AKSE. Flyt printhovederne i 1 mm trin langs x- og y-akserne, indtil PH1's koniske bioprintdyse er direkte over priken, der er markeret under brønd D1. Hvis det er nødvendigt, skal du finjustere placeringen af den koniske bioprintdyse over pryden ved at flytte printhovederne i intervaller på 0,1 mm.
- Optag x- og y-koordinaterne for den koniske bioprinting dyse, når direkte over midten af brønden D1, som angivet på kontrolpanelet skærmen af 3D bioprinter.
BEMÆRK: For den BLÆKREDIBLE+ 3D bioprinter, der anvendes her, er x- og y-koordinaterne som følger: x : -46,5 og y : -27,5. Disse koordinater tjener som udgangspunkt i midten af brønden D1 til bioprinting i en 24-brønd plade. - Løft derefter printbedet i 1 mm trin, indtil bunden af brønden D1 næsten rører den koniske bioprintdyse, der er installeret i printhead 1. Finjustere trykkets bevægelse i intervaller på 0,1 mm, hvis det er nødvendigt (figur 5A, nr. ii)). Vælg derefter Z-AXIS KALIBRERINGsindstillingen I MENUEN UTILITIES, og vælg og bekræft indstillingen STORE Z KALIBRERING yderligere.
- Gå tilbage til hovedmenuen, og vælg indstillingen FORBERED BIOPRINT . Rul ned til , og vælg indstillingen KALIBRER Z .
BEMÆRK: 3D-bioprinteren sænker nu printbedet, når z-aksekalibreringen udføres korrekt (figur 5A(iii)).
- Opdatering af G-kodefil med 24 brønde med korrekt udgangspunkt koordinater
- Åbn den medfølgende 24-brønd plade geometriske kode (G-kode) fil i bioprinter software (supplerende fil 1).
BEMÆRK: Denne 24-brønd G-kode fil koder udskrivning af 2-lags 5 x 5 x 1 mm retlinede konstruktioner i hver brønd (Figur 5C(i),(iii)). De medfølgende G-kodefiler kan bruges sammen med enhver 3D-bioprinting-software. - Bemærk, at linje 1 i G-kodefilen læser G0 X-50.0 Y-33.5 ; Center Position af D1 godt. Opdater x- og y-koordinaterne på linje 1 med de værdier, der er opnået i trin 4.5.3, dvs. Center Position af D1 godt. Gem filen under et nyt navn.
BEMÆRK: Denne procedure tjener til at kalibrere G-kodefilen, så udskrivningen påbegyndes i midten af brønden D1 baseret på x,y koordinaterne for den specifikke 3D-bioprinter, der anvendes. Denne tilgang kan bruges til at kalibrere 24-brønd plade G-kode fil til udskrivning med enhver ekstrudering 3D bioprinter. I forbindelse med denne undersøgelse blev kun den venstre halvdel af 24-brøndpladen, dvs. brønde A1-3, B1-3, C1-3 og D1-3, trykt. Der findes også en separat G-kodefil, der koder udskrivningen af 2-lags 5 x 5 x 1 mm retlinede konstruktioner i et 3 x 4 gitter (supplerende fil 2, figur 5C(ii)).
- Åbn den medfølgende 24-brønd plade geometriske kode (G-kode) fil i bioprinter software (supplerende fil 1).
- Justering af ekstruderingstryk for Printhead 1 (PH1)
- Sørg for, at den pneumatiske pumpe er tæt forbundet med den bageste luftindtagsport på INKREDIBLE+ 3D bioprinteren, og tænd for den pneumatiske pumpe.
- Træk den forreste betjeningsknap ud, der er placeret i højre side af INKREDIBLE+ 3D bioprinteren.
BEMÆRK: Den fremadgående betjeningsknap justerer trykket for PH1, mens den bageste betjeningsknap justerer trykket for PH2. - Overhold de digitale trykmålere til PH1 og PH2 placeret på forsiden af bioprinteren, der hver læser tæt på 0 kPa. Drej langsomt den forreste betjeningsknap med uret, indtil trykket angivet på venstre måler for PH1 når 12 kPa (figur 5A(iii)).
- Anbring et foldet silkepapir eller et stykke vandtæt, tætningsfilm under den installerede patrons printdyse, og pas på ikke at røre ved printdysen.
- Vælg FORBERED BIOPRINT i hovedkontrolmenuen på 3D-bioprinteren.
- Gå til , og vælg SLÅ PH1 til. Bemærk, at biomaterialeblæk begynder at ekstrudere fra printdysen. Hvis det er nødvendigt, øge ekstrudering trykket ved at dreje kontrolknappen med uret, indtil biomateriale blæk er ekstruderet i en kontinuerlig glødetråd, og registrere den nye trykindstilling. Arbejd hurtigt for at undgå at spilde biomateriale blæk.
- Vælg SLUK PH1 for at stoppe ekstrudering af biomaterialeblæk, fjerne det silkepapir eller den film, der indeholder det ekstruderede biomaterialeblæk, fra printstedet, og luk bioprinterdøren.
BEMÆRK: 3D-bioprinteren aktiverer automatisk lufttryksforsyningen til PH1 under udskrivningen som anvist af G-kodefilen.
- 3D bioprinting af retlinede hydrogelsubstrater i et 24-brønds pladeformat
- Vælg UTILITIES MENU i hovedkontrolmenuen på 3D-bioprinteren. Naviger til og vælg DISABLE SD PRINT, som gør det muligt for bioprintersoftwaren at overføre G-kodefiler til 3D-bioprinteren til udskrivning.
- Klik på knappen LOAD i bioprintersoftwaren, og vælg den opdaterede G-kodefil med 24 brønde, der er gemt i trin 4.6.2.
- Vælg fanen VIS UDSKRIFT i højre kontrolpanel i softwaren, og klik på printknappen for at starte bioprint i brønd D1.
BEMÆRK: Hvis du bruger 3 x 4 gitter godt plade G-kode fil, bioprinting vil opsige i godt A3 af 24-brønd plade (Figur 5C (ii), D), i modsætning til godt A6, hvis en fuld 24-brønd plade er trykt. - Når bioprinting af de retlinede konstruktioner er afsluttet, skal den 24-brønds plade med låget dækkes og flyttes til et klasse II biosikkerhedskab.
- Fordyb hver retlinet konstruktion i to dråber steril 50 mM CaCl2 opløsning (Figur 5B(ii)), og inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
BEMÆRK: Dette tjener til ionisk at krydse de alginat polymerkæder med Ca2+ ioner og gøre det muligt for de retlinede konstruktioner at opretholde deres strukturelle integritet. - CaCl2-opløsningen skal forsigtigt aspireres fra hver konstruktion og skylles en gang i 1 mL 1x PBS (pH 7.4) for at fjerne overskydende CaCl2 (figur 5D).
- For at forhindre dehydrering af de bioprintede hydrogelkonstruktioner skal de 3D bioprintede retlinede konstruktioner opbevares i frisk 1x PBS, indtil BMCCs er klar til at blive sået på konstruktionerne (Figur 5D).
5. Inkubation af BMMCs på 3D bioprintede retlinede stilladser og levedygtighedstest
- Inkubation af BMMCs på 3D bioprintede retlinede hydrogel stilladser
- Frø aliquots af BMMCs på 3D bioprintede retlinede stilladser i tredotel i fire forskellige varigheder, f.eks 6, 18, 24 og 48 timer, således at alle behandlinger afsluttes samtidigt. Brug BMMCs seedet i tomme brønde i tredotel i samme varighed som ubehandlede kontroller.
- Aseptisk overføre BMMCs fra en T175 cm2 kultur kolbe til en steril 50 mL konisk rør, og pellet BMMCs på 200 × g i 5 min ved stuetemperatur.
- Resuspend pellet i 50 mL frisk komplet RPMI medium, der indeholder 20 ng/mL af IL-3, og beregne den levende celletæthed ved at tælle en aliquot af trypan blå-farvede BMMCs ved hjælp af en hemacytometer.
- Baseret på celletætheden beregnet i trin 5.1.3 skal der forberedes en 6 mL-aliquot af BMMC-suspensionen ved en endelig densitet på 1 × 106 celler/mL.
- Til 48 timers inkubation setup, aspirere PBS fra brønde A1-3 indeholder 3D bioprintede retlinede hydrogel stilladser, og pipette 1 ml BMMC (1 × 106 celler / ml) suspension i hver brønd. Også pipette 1 mL BMMC (1 × 106 celler / mL) suspension i brønde A4-6 uden bioprintede konstruktioner til at tjene som ubehandlet kontrol. Inkuber de resterende brønde, der indeholder bioprintede stilladser (B1-3, C1-3, D1-3) i RPMI uden tilsætningsstoffer for at forhindre dehydrering, indtil det rette tidspunkt er nået til såning med BMMC for behandlingsvarighederne på 24, 18 og 6 timer. Fyld brøndene uden bioprintede stilladser (B4-6, C4-6, D4-6) med 1 mm PL PBS, indtil det rette tidspunkt er nået til såning med BMMCs for 24, 18 og 6 timers tidspunkter.
- Inkuber 24-brøndspladen ved 37 °C i en 5% CO2 befugtet atmosfære.
- Til 24 timers inkubation setup, aspirere allerede eksisterende kultur medium / buffer fra brønde B1-6, og frø 1 mL BMMC (1 × 106 celler / mL) suspension i disse brønde. Returner pladen til inkubatoren.
- For 18 h inkubation setup, aspirere allerede eksisterende kultur medium / buffer fra brønde C1-6, og frø 1 mL BMMC (1 × 106 celler / mL) suspension i disse brønde. Returner pladen til inkubatoren.
- For 6 timers inkubation setup, aspirere allerede eksisterende kultur medium / buffer fra brønde D1-6, og frø 1 mL BMMC (1 × 106 celler / mL) suspension i disse brønde. Returner pladen til inkubatoren.
- Ved inkubation ophører prøverne fra hver brønd af 24-brøndspladen til (i) PI-farvning og analyse ved flowcytometri, (ii) XTT-celle levedygtighedsanalyse og (iii) LDH-frigivelsesanalyse. Sørg derfor for, at en rundbundet 96-brøndsplade og de nødvendige 1,5 mL mikrofugerør er mærket i god tid før inkubationens endepunkt.
- Celleprøvetagning til XTT metabolisk analyse
- Grundigt genanvende BMMCs i kulturmediet inden for hver brønd, idet man passer på ikke at beskadige og fragmentere 3D bioprintede hydrogel stilladser.
- Aseptisk overførsel 40 μL af den homogene BMMC suspension fra hver brønd til steril 1,5 mL mikrofuge rør, der indeholder 760 μL frisk komplet RPMI medium (sidste volumen = 800 μL), og vortex kort at blande.
- Dispenser 100 μL af de fortyndede BMMC-affjedringer i tredotel i en fladbundet 96-brønd mikrotiterplade, der er egnet til registrering af absorbansmålinger (se materialetabellen) på et mikropladespektrofotometer.
- Dispenser 50 μL XTT arbejdsløsning til hver brønd, der indeholder BMMC celleaffjedringen, ved hjælp af en multikanalmikropipette.
BEMÆRK: Klargør XTT-arbejdsløsning ved at blande 5 mL XTT-reagens med 100 μL elektronkoblingsreagens. Optø disse komponenter fra -20 °C i et vandbad på 37 °C umiddelbart før brug. - Inkuber 96-brøndspladen ved 37 °C i en 5% CO2 befugtet atmosfære i 24 timer.
- I slutningen af inkubationen fjernes 96-brøndpladen fra inkubatoren og lad den køle af til stuetemperatur. Optag absorbansværdier på et mikropladespektrofotometer ved 450 nm med baggrunds subtraktion ved 650 nm.
- Supernatant prøveudtagning til laktatdehydrogenase (LDH) analyse
- De resterende BMMC-affjedring (960 μL) overføres fra hver brønd af 24-brøndspladen til mikrofugerørene, og cellerne pellet ved 200 × g i 5 min ved stuetemperatur.
- Pipette tre 100 μL aliquots af cellekultur supernatant fra hver mikrofuge rør i en 96-brønd microtiter fladbundet plade. De resterende supernatanter kasseres fra hvert mikrofugerør, og BMMC-pellets bevares til yderligere farvning med PI i punkt 5.4.1-5.4.8.
- Pipette 50 μL af LDH-arbejdsopløsningen i hver 100 μL aliquot supernatant.
BEMÆRK: Der henvises til supplerende fil 3 til fremstilling af LDH-analysereagenser. - Inkuber i 1 time i mørket ved stuetemperatur.
- Pipette 50 μL af 1 M eddikesyre til hver brønd for at stoppe reaktionen.
- Optag absorbansværdier på et mikropladespektrofotometer ved 490 nm med baggrunds subtraktion ved 680 nm.
- Flow cytometrisk analyse af BMMC levedygtighed via propidium jod (PI) udelukkelse
- Brug BMMC-pelletsne i flowvaskebufferen (PBS [pH 7,4] indeholdende 0,5 % w/v BSA) og pellet cellerne ved 300 × g i 5 min ved stuetemperatur.
- Gentag vasketrinnet med flowvaskebufferen igen.
- Brug hver BMMC pille i 400 μL flow vask buffer.
BEMÆRK: Der vil være 24 genophængte BMMC-prøver i alt: 12 BMMC-prøver inkuberet på bioprintede hydrogelsubstrater (4 tidspunkter i tredotel) og 12 BMMC-prøver inkuberet i brønde uden bioprintede konstruktioner (4 tidspunkter i tredotel). - I en rundbundet 96-brønd mikrotiterplade pipette 20 μL flow vask buffer i brønde A1-12 og B1-12. I samme mikrotiterplade pipette 20 μL 10x PI farvningsopløsning (100 μg/mL PI i flow wash buffer) i brønde C1-12 og D1-12.
- Dispenser 180 μL af de 12 BMMC-prøver, der er inkuberet på bioprintede hydrogelsubstrater, i brønde A1-12 (en prøve pr. brønd). Dispenser 180 μL af de 12 BMMC-prøver, der er inkuberet uden bioprintede hydrogelsubstrater, i brønde B1-12 (en prøve pr. brønd). Brug BMMC prøverne udleveres i brønde A1-12 og B1-12 som uredeligerede kontroller for hver behandling tilstand (24 kontroller i alt).
- Dispenser 180 μL af de 12 BMMC-prøver, der er inkuberet på bioprintede konstruktioner, i brønde C1-12 (en prøve pr. brønd). Dispenser 180 μL af de 12 BMMC-prøver, der er inkuberet uden bioprintede konstruktioner, i brønde D1-12 (en prøve pr. brønd).
BEMÆRK: BMMC-prøverne i brønde C1-12 og D1-12 vil blive farves ved en endelig effektiv PI-koncentration på 10 μg/mL (24 farvede prøver i alt). - Pladen inkuberes enten i 1 time ved 4 °C eller 15 min ved stuetemperatur i mørke.
- Ved inkubationsperiodens afslutning analyseres prøverne direkte fra mikrotiterpladen på et flowcytometer som tidligere beskrevet i punkt 3.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et af de mest afgørende kendetegn ved et vellykket biomaterialeblæk eller kultursubstrat er biokompatibilitet. Først og fremmest må substratet ikke fremkalde cellulær død. Der er flere mikrotiter-baserede og flow cytometriske metoder til kvantificering af celle levedygtighed og nekrose; Disse metoder er dog ikke modtagelige for at analysere celler, der er indlejret i en hydrogelmatrix. I denne protokol omgås ovennævnte begrænsning ved at så BMMCs på hydrogelsubstratet eller bioprintet stillads. Efter en bestemt inkubationsperiode (6-48 timer i denne undersøgelse) høstes BMMCs let ved mikropipetter uden behov for mekanisk forstyrrelse eller hydrolyse af hydrogelsubstratet eller bioprintet stillads, som ellers ville forårsage fysisk skade på cellerne. BMMCs levedygtighed analyseres derefter hurtigt ved hjælp af PI-permeabilitetsmetoden via flowcytometri. PI er et membran-uigennemtrængeligt farvestof, der er udelukket fra levedygtige celler med intakte cellemembraner og fluorescer kun ved sammenfæsning mellem baserne par DNA16.
Som sådan er det kun celler med kompromitterede cellemembraner, der kan gennemtrænges for PI og vil derfor fluorescere. PI permeabilitet analyse viste ingen ændringer i BMMC levedygtighed, når de er kultiveret på CNC / agarose / D-mannitol substrat. Faktisk fremkaldte ingen af de testede CNC-koncentrationer (op til 12,5% w/v) nogen negative virkninger på BMMC's levedygtighed sammenlignet med de BMMCs, der blev kultiveret i mangel af CNC/agarose/D-mannitol hydrogelsubstrat (figur 3B, C). Det er også vigtigt, at bioink eller kultursubstrat ikke ændrer cellernes morfologi. Baseret på flowcytometrisk FSC vs. SSC-plots ændrede hydrogelsubstratet med den højeste CNC-koncentration (12,5% w/v) ikke BMCCs oprindelige størrelse (FSC) eller granularitet (SSC) sammenlignet med BMMCs, der dyrkes i mangel af CNC/agarose/D-mannitol hydrogel substrater (figur 3A(i), ii)).
Et andet vigtigt kendetegn ved et biomateriale blæk eller kultursubstrat er, at det skal have evnen til at opretholde differentiering og fænotype af de celler, det understøtter. To af de mest kendetegnende biomarkører af mastceller er høj-affinitet IgE receptor, FcεRI, som letter BMMC reaktioner på antigener og stamcellefaktor receptor, Kit (CD117), som er nødvendig for mast celle overlevelse og differentiering. Modne mastceller defineres ved ekspressionen af disse to overfladereceptorer, og for at et bioinksubstrat kan opretholde dem i kulturen, må det ikke væsentligt ændre udtrykket af disse to receptorer. CNC/agarose/D-mannitolsubstratet syntes at øge FcεRI- og Kit-ekspressionen ved CNC-koncentrationer ≥ 2,5 % (figur 4A( iii), B(iii)). Interessant nok forblev de forhøjede Udtryksniveauer for FcεRI og Kit relativt konsistente mellem 2,5% og 12,5% CNC, hvilket er tegn på en plateaueffekt og antyder en effekt, der ikke er afhængig af koncentrationen af CNC, men af en anden parameter i hydrogelkomposit.
De 3D bioprintede hydrogel biomateriale blæk stilladser genereret i denne undersøgelse består af fibrillar nanocellulose (FNC), i stedet for krystallinsk nanocellulose, og natrium alginat som gelator, i stedet for agarose. Fibrillar nanocellulose udviser forskellige nanoskala topografiske træk i forhold til CNC17, som ud over mikroskala arkitektur af 3D bioprintede FNC hydrogel bioink substrater, potentielt kan påvirke levedygtigheden af BMMCs. Efter 3D bioprinting og ionisk krydsklinking af FNC/alginate/D-mannitol bioink stilladser (figur 6) blev BMMCs enten alene eller på 3D bioprintede hydrogel stilladser til henholdsvis 6, 18, 24 og 48 timer for at vurdere de dynamiske ændringer i BMCCs levedygtighed som reaktion på FNC/alginate/D-mannitol stilladserne eventuelle, over længere perioder. XTT-analysen viste, at BMCCs metaboliske aktivitet, der dyrkes på 3D-bioprintede hydrogel stilladser, forblev relativt konsistente ved ~ 100% på tværs af alle testede tidspunkter sammenlignet med BMMCs, der dyrkes alene (Figur 7A). Cellernes lysis resulterer i frigivelsen af LDH i cellekulturmediet, som LDH-analysen registrerer som en funktion af sin oxido-reduktive enzymatiske aktivitet.
BMMCs, der dyrkes på 3D-bioprintede hydrogel stilladser, udviste en gradvis tidsafhængig stigning i LDH-frigivelse sammenlignet med BMMCs, der dyrkes alene; Denne tendens havde dog en ikke-signifikant standardafvigelse på mindre end 9 % (figur 7B). PI farvning af BMMCs dyrkes på 3D bioprintede hydrogel stilladser afslørede ingen væsentlige ændringer i levedygtigheden i forhold til BMMCs dyrkes alene på hvert tidspunkt (Figur 7C). Navnlig forblev MFI af PI-farvede BMMCs, der dyrkes på 3D bioprintede hydrogel stilladser, relativt konsistente (PI-MFI på 7000) på tværs af alle tidspunkter og lignede de BMMCs, der blev kultiveret på CNC/agarose/D-mannitol substraterne, som udviste en konsekvent PI-MFI på 7000 på tværs af alle CNC-koncentrationer (2,5-12,5 %). Samlet set viser disse data, at FNC/alginate/D-mannitol hydrogel stilladserne ikke påvirker BMMCs levedygtighed negativt.
Figur 1: Anatomi af museben, der skildrer skinnebenet og lårbenet, hvorfra knoglemarven er isoleret.
Figur 2: Forberedelse af CNC/agarose/D-mannitol hydrogel substrat. (A) Skematisk for CNC/agarose/D-mannitol hydrogel substratforberedelsesprotokol. (B) CNC/agarose/D-mannitol præparater (0, 1, 2,5, 5, 10 og 12,5% (w/v) CNC i PBS/agarose/D-mannitol) blev læsset på en 24-brønds plade i firedobbelt som illustreret. Forkortelser: PBS = fosfat-buffered saltvand; CNC = krystallinsk nanocellulose. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Flowcytometrisk analyse af BMMC's levedygtighed via propidium-jodudeudektion efter inkubation på CNC/agarose/D-mannitolsubstrater. BMMCs blev fjernet fra CNC/agarose/D-mannitol hydrogel substrater, vasket to gange, suspenderet igen i PBS-0,5% w /v BSA, plettet med PI i 1 time ved 4 °C, og analyseret ved flowcytometri (n=4). I alt 20.000 celler pr. prøve blev erhvervet, herunder registrering af PI-fluorescensemission i PE-kanalen. Dataanalyse blev udført ved hjælp af flowcytometrianalysesoftware. (A) Fremadrettet punkt (x-akse) versus side scatter (y-akse) prik plot analyse af den samlede cellepopulation fra (i) ubehandlet kontrol BMMC (0% CNC/ agarose / D-mannitol) og (ii) BMMCs dyrkes på 12,5% CNC / agarose / D-mannitol, der skildrer gated celle befolkning, der anvendes til dataanalyse. (B) Histogrammeprofil af indhegnede celler (ubesmittede eller farvede med PI), fra ubehandlede kontrol BMMCs (0% CNC/agarose/D-mannitol) og BMMCs, der dyrkes på 12,5% CNC/agarose/D-mannitol. (C) BMMCs blev kultiveret på forskellige CNC/agarose/D-mannitol substrater (1-12,5% (w/v) CNC) i 18 timer, og celle levedygtighed blev bestemt ved flow cytometrisk analyse af PI-farvede celler. Grafisk repræsentation af PI MFI'er for BMMCs inkuberet på forskellige CNC/ agarose / D-mannitol substrater (1-12,5% (w / v) CNC) i forhold til BMMCs, der var ubehandlet og farves med PI. Forkortelser: BMMCs = knoglemarvsbaserede mastceller; CNC = krystallinsk nanocellulose; PBS = fosfatbufferet saltvand; BSA = albumin til kvægserum; PI = propidium jod; PE = phycoerythrin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Flow cytometrisk analyse af FcεRI og Kit (CD117) celleoverflade receptor udtryk. BMMCs blev kultiveret enten i mangel eller tilstedeværelse af CNC / agarose / D-mannitol substrater i 18 h, fjernet og analyseret for receptor udtryk. Data er repræsentative for 4 repliker. Termins scatter (x-axis) versus side scatter (y-axis) prikplot af den samlede cellepopulation i den ubehandlede BMMC-prøve (0% CNC/agarose/D-mannitol), farves med (A)(i) isotypekontrolantistoffet-APC eller (B)(i) isotypen kontrolantistof-PE, og den gated cellepopulation, der anvendes til dataanalyse. Histogram overlejringsprofiler af indhegnede BMMCs (plettet med isotypekontrolantistof eller (A)(ii) anti-FcεRI-APC antistof eller (B)(ii) anti-Kit-PE antistof), inkuberet enten alene (0% CNC/agarose/D-mannitol) eller på 12,5% CNC/agarose/D-mannitol substrater. BMMCs blev kultiveret i 18 timer på forskellige CNC/agarose/D-mannitol substrater (1-12,5% (w/v) CNC) efterfulgt af henholdsvis FcεRI og Kit overfladereceptorudtryksanalyse via flowcytometri (n=4). Grafisk repræsentation af MFI'er af BMMCs farves med (A)(iii) anti-FcεRI-APC eller (B)(iii) anti-Kit-PE antistoffer, henholdsvis efter kultur på forskellige CNC / agarose / D-mannitol substrater (1-12,5% (w / v) CNC) i forhold til celler, der var ubehandlet (0% CNC) og farves på samme måde. Forkortelser: CNC = krystallinsk nanocellulose; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; BMMCs = knoglemarvs-afledt mastceller; MFI = middelstofstofintensiteter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: 3D bioprinterudstyr og forbrugsstoffer, der kræves for at bioprinte 5 x 5 x 1 mm 2-lags retlinet bioink hydrogel stilladser i et 24-brønds pladeformat. (A)(i) En pneumatisk ekstrudering 3D bioprinter med printhead samlingsposition på sin hvileposition ved afslutningen af homing af sine x-y-z akser. A) ii) Udgangspunktskalibrering af printhoved 1 med en bioinkpatron installeret og placering af printdysen direkte hen over midten af brønden D1 i x-y-z-dimensionerne. A) iii) PH1's position efter z-aksekalibrering og ekstruderingstrykket af PH1 indstillet til 12 kPa. B) i) Bioink patron (3 mL), der indeholder NFC/Alginate/D-mannitol biomateriale blæk formulering. B) ii) Dråbedispenser på 50 mM CaCl2 crosslinking-opløsning. C) (i) Skematisk repræsentation af et udskriftslayout fra en G-kodefil, der koder for trykning af 5 x 5 x 1 mm 2-lags retlinet bioink hydrogel stilladser i alle brønde af en 24-brønds plade. C) (ii) Skematisk gengivelse af et udskriftslayout fra en G-kodefil, der kun koder for trykning af 5 x 5 x 1 mm 2-lags retlinet bioink hydrogel stilladser i brønde A1-3, B1-3, C1-3 og D1-3 af en 24-brønds plade. C) (iii) Udvidet visning af 5 x 5 x 1 mm 2-lags retlinet bioink hydrogel stillads mønster i udskæring program, Slic3r. D) Topvisning af faktiske 3D bioprintede 5 x 5 x 1 mm 2-lags retlinede bioink hydrogel stilladser i en 24-brønd plade format nedsænket i PBS. Forkortelser: 3D = tredimensionelle; PH1 = printhoved 1; NFC = nanofibrillar cellulose; G-kode = geometrisk kode; PBS = fosfat-buffered saltvand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Skemadiagram, der skildrer arbejdsgang for 3D bioprint og BMMC-kultur på FNC/alginate/D-mannitol hydrogel stilladser. 3D bioprinting af hydrogel stilladser med FNC/Alginate/D-mannitol bioink fra en G-kode fil, der koder et 5 x 5 x 1 mm 2-lags gittermønster, kryds sammenkædning af hydrogel stilladser med CaCl2 og dyrkning af BMC'er på det sammenkoblede FNC/Alginate/D-mannitol hydrogelkonstruktioner. Forkortelser: 3D = tredimensionelle; 2D = todimensionel; G-kode = geometrisk kode; FNC = fibrillar nanocellulose; BMMCs = knoglemarvs-afledt mastceller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Flowcytometri (PI) og mikrotiter (XTT og LDH) analyser af BMMC-levedygtighed efter inkubation på FNC/alginate/D-mannitol stilladser. (A) Cellespredningsdata (XTT) for BMMCs, der dyrkes på FNC/Alginate/D-mannitol bioink substrater til henholdsvis 6, 18, 24 og 48 timer. Værdier præsenteres som en procentdel af XTT metaboliske data for BMMCs dyrkes alene for 6, 18, 24 og 48 h, henholdsvis. Fejllinjer angiver standardafvigelse (n=3). (B) LDH-enzymfrigivelsesanalysedata for BMMCs, der dyrkes på FNC/Alginate/D-mannitol bioink-stilladser til henholdsvis 6, 18, 24 og 48 timer. Værdier præsenteres som fold-ændringer i forhold til LDH enzym frigivet af BMMCs dyrkes alene for 6, 18, 24 og 48 h, henholdsvis. Fejllinjer angiver standardafvigelse (n=3). (C) Flow cytometriske data af PI-farvede BMMCs, der blev kultiveret enten alene eller på FNC/Alginate/D-mannitol bioink stilladser for henholdsvis 6, 18, 24 og 48 timer. Fejllinjer angiver standardafvigelse (n=3). Forkortelser: LDH = laktatdehydrogenase; BMMCs = knoglemarvs-afledt mastceller; FNC = fibrillar nanocellulose; PI = propidium jod; MFI = gennemsnitlig fluorescensintensitet. Klik her for at se en større version af dette tal.
| 1.1.1. 500 mL flaske RPMI (HyClone, GE Healthcare, USA) |
| 1.1.2. 4 mM L-glutamin (Gibco, Waltham Massachusetts, USA) |
| 1.1.3. 50 mM β-Mercaptoethanol (Fisher Scientific, Hampton, New Hampshire, USA) |
| 1.1.4. 1 mM natrium pyruvat (Gibco) |
| 1.1.5. 100 U/mL penicillin (Gibco) |
| 1.1.6. 100 μg/mL streptomycin (Gibco) |
| 1.1.7. 0,1 mM MEM ikke-essentielle aminosyrer (Gibco) |
| 1.1.8. 25 mM HEPES (Fisher) |
| 1.1.9. 10% varmeinaktiveret FBS (Gibco) |
| 1.1.10. 30 ng/mL mus rekombinant IL-3 (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey, USA) |
Tabel 1: Komplet RPMI-1640 medietillæg.
Supplerende fil 1. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremstillingen af 3D biomimetiske væv kræver en vellykket sammenlægning af bioinken, som efterligner komponenter i den ekstracellulære matrix, med den eller de cellulære komponenter for at skabe fysiologiske analoger af in vivovæv . Dette kræver brug af primære celler, og ikke omdannes celler, når der fremstilles fysiologiske biomimetiske væv. Primære immunologiske celler, såsom mastceller, er imidlertid særligt modtagelige for cytotoksiske virkninger og fænotypiske ændringer, der kan fremkaldes af selve bioinkmatrixen, hvilket er uønsket. Derfor er evnen til hurtigt at vurdere virkningen af kandidatbiomaterialeblæk på mastcellernes levedygtighed og fænotype (overfladereceptorudtryk) yderst fordelagtig, især før 3D-bioprint af komplekse væv, der indeholder forskellige celletyper indlejret i bioinkmatrixen, hvilket er dyrt og tidskrævende.
Tilgangen af denne protokol indebærer dyrkning BMMCs, et eksempel på primære mastceller, på overfladen af præformede kandidat hydrogel bioink substrater (1-12,5% CNC indlejret i agarose), som gør det muligt at hente BMMCs til efterfølgende analyse af celle levedygtighed og overflade receptor udtryk ved flow cytometri. Isolering af knoglemarv fra mus lårben og skinneben kræver præcision og opmærksomhed på detaljer på grund af skrøbelighed og lille størrelse af disse knogler. Efter vellykket isolering og aflejring af knoglemarven i cellekulturmediet er det vigtigt at opretholde cellekulturen med 30 ng/mL mus rekombinant IL-3 kontinuerligt i 4 uger, hvilket sikrer vedvarende stimulering for at differentiere de hæmatopoietiske stamfaderceller i mastceller, der er dobbeltpositive for Kit (CD117) og FcεRI celleoverfladereceptorer.
Flowcytometrisk analyse af mastceller til overfladeudtryk af Kit-receptorer (CD117) og FcεRI-receptorer bør anvende isotypeantistofkontroller for at hjælpe med at differentiere ikke-specifikt baggrundssignal fra de specifikke signaler fra de antistoffer, der anvendes til at målrette disse receptorer, som påvist i figur 4A(ii),B(ii). Det er også vigtigt at gate på en veldefineret mast celle befolkning til at udelukke cellerester som vist i figur 4A(i) og 4B(i), som også kan ikke-specifikt binde antistoffer. Der bør anvendes skånsom mikropipetter ved hentning af BMMC'erne fra overfladen af bioink hydrogelsubstraterne for at reducere de forskydningskræfter, der udøves på cellerne, hvilket kan beskadige cellemembranen og resultere i kunstigt forhøjet farvning med PI. De PI-farvede BMMCs bør analyseres ved flowcytometri umiddelbart efter farvning inkubationsperioden slutter som PI farvning medium, som er baseret på PBS-0,5% w / v BSA, er ikke beregnet til at opretholde celler i længere tid uden for celle kultur medium. Da PI kun gennemsyrer celler med kompromitterede cellemembraner, er det i stand til at plette nekrotiske celler med høj selektivitet og følsomhed. PI er dog ikke i stand til at opdage apoptotiske celler, som opretholder intakte cellemembraner.
Den CYTOMETRISKE ANALYSE, der er beskrevet i denne protokol, kan suppleres med Annexin-V-fluorescein isothiocyanat (FITC), som specifikt binder sig til fosfolipid, fosfatylserin, der omfordeles til den ydre folder i apoptotiske cellers cellemembran. Det er dog nødvendigt med kompensation for at tage højde for fluorescensudledningsblødningen af FITC i den detektorkanal, der anvendes til at opnå fluorescensemission fra PI og omvendt. Ved udarbejdelsen af bioprinteren til 3D-bioprint fra den medfølgende 24-brønds plade G-kode er det vigtigt, at udgangspunktskalibreringen udføres nøjagtigt, hvorved x- og y-koordinaterne i midten af brønden D1 registreres, og G-kodefilen opdateres med disse x- og y-koordinater på linje 1. Hvis disse indledende kalibreringstrin ikke udføres nøjagtigt, flyttes printhovederne ikke til det korrekte udgangspunkt ved udskrivningens begyndelse. Korrekt kalibrering af z-aksen er lige så vigtig, da hvis du ikke gør det, kan det resultere i, at printhovedets dyse kolliderer med printbedet eller 24-brøndpladen ved udskrivningens begyndelse.
Det skematiske diagram for 5 x 5 x 1 mm 2-lags retlinet gitterkonstruktion (figur 5C(iii)) illustrerer tilstedeværelsen af porer mellem de ekstruderede bioinktråde, der danner substratet. Størrelsen af glødetrådenes størrelse og diameter afhænger af tre parametre: i) printdysens rejsehastighed, ii) ekstruderingstrykket på bioinken i patronen og iii) printdysediameteren. Bioink substrater med store glødetrådsdiametre og små porer kan udskrives ved hjælp af en langsommere printdysehastighed, højere ekstruderingstryk (>12 kPa) og en printdyse med større diameter (22 G). Omvendt vil en hurtigere printdysehastighed, lavere ekstruderingstryk (<12 kPa) og en printdyse med mindre diameter (27 G) resultere i substrater med finere glødetråde og større porer. Et utilstrækkeligt højt ekstruderingstryk vil imidlertid resultere i, at inkonsekvente klumper af bioink ekstruderer i stedet for kontinuerlige filamenter, hvilket vil påvirke kvaliteten og den strukturelle integritet af det bioprintede 3D-bioprintede substrat negativt.
CNC/agarose/D-mannitol candidate bioink, der præsenteres i denne protokol, gennemgår termisk gelering, når agarose afkøles til stuetemperatur. I modsætning hertil gennemgår den kommercielle bioink, der anvendes til 3D-bioprint i denne protokol, ionisk krydskædning med CaCl2 på grund af inddragelsen af natriumalginat i bioinkformuleringen. Det er derfor nødvendigt at nedsænke de bioprintede FNC/alginate/D-mannitol stilladser i 50 mM CaCl2 opløsning efter bioprinting for at lette krydskædning (gelering) af substratet. Udeladelse af det ioniske krydskædningstrin med CaCl2 vil resultere i opløsning af FNC/alginate/D-mannitol stilladserne, når de er nedsænket i cellekulturmediet. Den største begrænsning af CNC/agarose/D-mannitol bioink formuleringen i dens anvendelse i selve 3D bioprinting er den usædvanligt høje smeltetemperatur af agarose (90-95 °C). Selv om de printhoveder på den 3D-bioprinter, der anvendes i denne undersøgelse, kan nå en maksimal temperatur på 130 °C, vil de ekstruderede filamenter af CNC/agarose/D-mannitol sandsynligvis sprede sig hurtigt, efterhånden som der trykkes på efterfølgende lag for at konstruere substratet. Denne begrænsning af CNC/agarose/D-mannitol bioink formuleringen kan omgås ved enten at udskrive CNC/agarose/D-mannitol bioink direkte på et afkølet printbed for at fremskynde gelation eller erstatte agarose med natriumlginate, som kan ekstruderes ved stuetemperatur og gennemgår hurtig ionisk krydsning med 50 mM CaCl2 inden for 5 min.
Denne protokol tilbyder en pålidelig tilgang til hurtigt at screene og udelukke bioink formuleringer, der udviser dårlig biokemisk kompatibilitet med følsomme immunologiske celler, såsom mastceller, der ikke bør udsættes for pneumatisk ekstrudering 3D bioprinting. Desuden er denne protokol omkostningseffektiv, da det kræver relativt lave mængder af celler til at udføre en multiplexed screening assay. I modsætning hertil skal præformulerede bioinkcelleblandinger bioprintes ved meget høje celletætheder (>107 celler/mL), hvilket kan vise sig at være dyrt og tidskrævende at udføre en biokompatibilitetsscreeningsanalyse, især når de kultificerer primære celler, der er afhængige af dyre rekombinante vækstfaktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbejde blev støttet af National Research Council Canada og Alberta Innovates.
Acknowledgments
Vi takker Alberta Innovates for at levere CNC og Ken Harris og Jae-Young Cho for deres tekniske rådgivning, når de forbereder CNC / agarose / D-mannitol matrix. Vi takker også Ben Hoffman, Heather Winchell og Nicole Diamantides for deres tekniske rådgivning og support med opsætning og kalibrering af INKREDIBLE + 3D bioprinter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J.
- Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , Springer. Cham. 1345-1363 (2019).
- Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
- Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
- Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
- Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
- Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
- Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
- Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
- Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
- Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
- Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
- Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
- Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).
