Summary
Denne protokollen beskriver utvinning av flyktige organiske forbindelser fra en biologisk prøve med vakuumassistert sorbentutvinningsmetode, gasskromatografi kombinert med massespektrometri ved hjelp av Entech Sample Preparation Rail, og dataanalyse. Den beskriver også kultur for biologiske prøver og stabil isotopprobing.
Abstract
Flyktige organiske forbindelser (VOC) fra biologiske prøver har ukjent opprinnelse. VOCer kan stamme fra verten eller forskjellige organismer fra vertens mikrobielle samfunn. For å disentangle opprinnelsen til mikrobielle VOCer, ble det utført flyktige hoderomsanalyser av bakterielle mono- og samkulturer av Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa og Acinetobacter baumannii, og stabil isotopprobing i biologiske prøver av avføring, spytt, kloakk og sputum. Mono- og samkulturer ble brukt til å identifisere flyktig produksjon fra individuelle bakteriearter eller i kombinasjon med stabil isotopprobing for å identifisere den aktive metabolismen av mikrober fra de biologiske prøvene.
Vakuumassistert sorbentutvinning (VASE) ble brukt til å trekke ut VOC-ene. VASE er en brukervennlig, kommersialisert, løsningsmiddelfri headspace ekstraksjonsmetode for semi-flyktige og flyktige forbindelser. Mangelen på løsemidler og de nesten vakuumforholdene som brukes under ekstraksjon, gjør utviklingen av en metode relativt enkel og rask sammenlignet med andre ekstraksjonsalternativer som tert-butylering og solid fasemikroekstraksjon. Arbeidsflyten som beskrives her, ble brukt til å identifisere spesifikke flyktige signaturer fra mono- og samkulturer. Videre identifiserte analyse av den stabile isotop-probingen av humane assosierte biologiske prøver VOC-er som enten ble ofte eller unikt produsert. Denne artikkelen presenterer de generelle arbeidsflyt- og eksperimentelle hensynene til VASE i forbindelse med stabil isotopprobing av levende mikrobielle kulturer.
Introduction
Flyktige organiske forbindelser (VOC) har stort løfte om bakteriedeteksjon og identifikasjon fordi de slippes ut fra alle organismer, og forskjellige mikrober har unike VOC-signaturer. Flyktige molekyler har blitt brukt som en ikke-invasiv måling for å oppdage ulike luftveisinfeksjoner, inkludert kronisk obstruktiv lungesykdom1, tuberkulose2 i urin3 og respirator-assosiert lungebetennelse4, i tillegg til å skille personer med cystisk fibrose (CF) fra friske kontrollpersoner 5,6. Flyktige signaturer har til og med blitt brukt til å skille spesifikke patogeninfeksjoner i CF (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 og S. aureus vs. P. aeruginosa10). Men med kompleksiteten til slike biologiske prøver er det ofte vanskelig å finne kilden til spesifikke VOCer.
En strategi for å disentangling de flyktige profilene fra flere smittende mikrober er å utføre headspace analyse av mikroorganismer i både mono- og samkultur11. Headspace analyse undersøker analyttene som slippes ut i "headspace" over en prøve i stedet for de som er innebygd i selve prøven. Mikrobielle metabolitter har ofte blitt karakterisert i monokulturer på grunn av vanskeligheten med å bestemme opprinnelsen til mikrobielle metabolitter i komplekse kliniske prøver. Ved å profilere volatiler fra bakterielle monokulturer, kan typer volatiler en mikrobe produserer in vitro representere en grunnlinje for sitt flyktige repertoar. Å kombinere bakteriekulturer, for eksempel å skape samkulturer, og profilere de flyktige molekylene som produseres, kan avsløre interaksjonene eller kryssfôringen mellom bakteriene12.
En annen strategi for å identifisere den mikrobielle opprinnelsen til flyktige molekyler er å gi en næringskilde som er merket med en stabil isotop. Stabile isotoper forekommer naturlig, ikke-radioaktive former for atomer med et annet antall nøytroner. I en strategi som har blitt brukt siden tidlig på 1930-tallet for å spore aktiv metabolisme hos dyr13, strømmer mikroorganismen av den merkede næringskilden og inkorporerer den stabile isotopen i sine metabolske veier. Mer nylig har en stabil isotop i form av tungtvann (D2O) blitt brukt til å identifisere metabolsk aktiv S. aureus i en klinisk CF sputumprøve14. I et annet eksempel har 13C-merket glukose blitt brukt til å demonstrere kryssfôring av metabolitter mellom CF kliniske isolasjoner av P. aeruginosa og Rothia mucilaginosa12 .
Med fremme av massespektrometriteknikker har metoder for å oppdage flyktige signaler gått fra kvalitative observasjoner til mer kvantitative målinger. Ved å bruke gasskromatografi massespektrometri (GC-MS) har behandling av biologiske prøver blitt innen rekkevidde for de fleste laboratorie- eller kliniske innstillinger. Mange metoder for å kartlegge flyktige molekyler har blitt brukt til å profilere prøver som mat, bakteriekulturer og andre biologiske prøver, og luft og vann for å oppdage forurensning. Imidlertid krever flere vanlige metoder for flyktig prøvetaking med høy gjennomstrømning løsningsmiddel og utføres ikke med fordelene ved vakuumutvinning. I tillegg kreves det ofte større volumer eller mengder (større enn 0,5 ml) prøvematerialer for analyse 15,16,17,18,19, selv om dette er substratspesifikk og krever optimalisering for hver prøvetype og metode.
Her ble vakuumassistert sorbentutvinning (VASE) etterfulgt av termisk desorpsjon på en GC-MS brukt til å kartlegge de flyktige profilene til bakterielle mono- og samkulturer og identifisere aktivt produserte volatiler med stabil isotopprobing fra menneskelige avføring, spytt, kloakk og sputumprøver (figur 1). Med begrensede utvalgsmengder ble VOC hentet ut fra så lite som 15 μL sputum. Isotopprobing eksperimenter med menneskelige prøver krevde å legge til en stabil isotopkilde, for eksempel 13C glukose, og medier for å dyrke veksten av det mikrobielle samfunnet. Den aktive produksjonen av volatiler ble identifisert som et tyngre molekyl av GC-MS. Ekstraksjon av flyktige molekyler under et statisk vakuum gjorde det mulig å oppdage flyktige molekyler med økt følsomhet 20,21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hensyn til headspace Sorbent Pen (HSP) og prøveanalyse
MERK: HSP som inneholder den sorbente Tenax TA ble valgt for å fange et bredt spekter av volatiler. Tenax har en lavere affinitet for vann sammenlignet med andre sorbenter, noe som gjør det mulig å fange flere VOCer fra prøver med høyere fuktighet. Tenax har også et lavt nivå av urenheter og kan kondisjoneres for gjenbruk. Sorbentvalg ble også tatt i betraktning med kolonnen installert i GC-MS (se materialtabellen).
- Generer negative kontroller ved å trekke ut medier og/eller eksempelemner med de samme betingelsene som brukes for prøveuttrekking.
- Analyser en tom HSP (tidligere bekreftet å være ren og fri for betydelig bakgrunn) på GC-MS før du analyserer ekstraherte prøver. Kjør emner mellom prøvetyper (f.eks. tre replikeringer av bakterier monokultur, blanke, tre replikeringer av bakteriekokultur, blank osv.).
- Begrens bruken av duftende personlige pleieartikler eller forbruk av stinkende matvarer før prøveutvinning og analyse. Ideelt sett, lag prøver i en biosikkerhetshette som ikke har blitt renset av alkohol eller andre flyktige rengjøringsmidler i minst 30 minutter. Slå på luftstrømmen i den biosikre hetten i 30-60 min før prøvepreparering.
- Hold prøver på is for å begrense flyktig frigjøring under prøvepreparering.
2. Mono- og samkulturforberedelse
- I den biosikkerhetshetten inokulerer du kulturer av A. baumannii, S. aureus og P. aeruginosa i Todd Hewitt vekstmedier. Inkuber over natten ved 37 °C med 200 o/min agitasjon.
- Etter inkubering over natten, utfør kulturhåndtering i biosikkerhetshetten. Fortynn hver kultur til optisk tetthet 0,05 ved 500 nm.
- Bland samkulturer i like deler, og pipette 200 μL kontrollmedier, mono- eller samkultur i hver brønn av en 96-brønns plate, og plasser i 37 ° C inkubator i 24 timer. Forbered en annen plate for en 48-timers inkubasjon.
- På slutten av inkubasjonsperioden forbereder du prøver for utvinning i avsnitt 4. Pipette flytende kulturer i mikrocentrifuge rør og lagre ved -80 °C.
MERK: På dette tidspunktet kan prøver oppbevares ved -80 °C for å trekke ut senere om nødvendig.
3. Stabil isotopprobing i biologiske prøver forberedelse
MERK: Avførings- og spyttprøvene ble donert fra anonyme givere med godkjenning fra University of California Irvine Institutional Review Board (HS # 2017-3867). Kloakken kom fra San Diego, CA. Sputumprøvene ble samlet inn fra forsøkspersoner med cystisk fibrose som en del av en større studie godkjent av University of Michigan Medical School Institutional Review Board (HUM00037056).
- Utfør alle biologiske prøvepreparater i biosikkerhetshetten.
- For å forberede fekale prøver, tilsett 1 ml deionisert vann til 100 mg avføring i et 1,5 ml mikrosenterrør og virvel i 3 minutter. Plasser på is når den ikke er i bruk.
- Til 15 μL fekal og vannblanding, tilsett 485 μL hjernehjerteinfusjon (BHI) medium med 20 mM 13C glukose, eller BHI med 30% deuterium (D2O). Kontroller at det endelige volumet på prøven er 500 μL. Klargjør prøver i tekniske triplikater.
- For å forberede kloakkprøver, tilsett 500 μL kloakk til 500 μL BHI med 20 mM 13C glukose eller BHI med 30% D2O for et totalt volum på 1 ml. Forbered prøver i triplikat. Plasser på is når den ikke er i bruk.
- For å forberede spyttprøver, tilsett 50 μL spytt til 500 μL BHI med 20 mM 13C glukose eller BHI med 30% D2O for et totalt volum på 550 μL. Forbered prøver i triplikat. Plasser på is når den ikke er i bruk.
- For å forberede sputumprøver for å sammenligne volatilene som er tilstede i prøven før og etter dyrking, utfør en første ekstraksjon med 15 μL sputum. Forbered prøver i triplikat. Plasser på is når den ikke er i bruk. Fortsett til § 4 for prøveutvinning, og trekk ut i 18 timer ved 37 °C med 200 o/min agitasjon.
- Etter ferdigstillelse av den første utvinningen av de ukulturerte sputumprøvene, lagre hetteglassene med sputum. Tilsett 500 μL BHI med 20 mM 13C glukose til hetteglassene med sputum fra 3,5,1. Plasser på is når den ikke er i bruk.
- For å forberede fekale prøver, tilsett 1 ml deionisert vann til 100 mg avføring i et 1,5 ml mikrosenterrør og virvel i 3 minutter. Plasser på is når den ikke er i bruk.
- Fortsett til avsnitt 4 for prøveuttrekking.
4. Prøveuttrekking
- Plasser tomme flyktige organiske analyser (VOA) hetteglass (20 ml) på kaldplaten, og legg kaldplaten på isen i den biosikre hetten.
- Slå på den 5600 sorbente penneavsugsenheten (SPEU), og juster til ønsket temperatur etter behov for hver metode.
MERK: For stabile isotopprobingforsøk ved 37 °C kan det ta opptil 15 minutter å nå innstilt punkt. For mono- og samkultureksperimenter ved 70 °C kan det ta opptil 60 minutter å nå settet. - Samle inn rene HSP-er som er lik antall forberedte prøver, inkludert HSP-er for medie- eller prøvekontroller.
- Etikett 20 ml VOA-hetteglass i henhold til prøver, replikerer og HSP-IDer etter behov. Bruk en markør som motstår vann i tilfelle kondens dannes på utsiden av hetteglasset mens du er på is.
- Inne i den biosikre hetten skruer du ut den hvite hetten på hetteglasset, rørprøven raskt inn i hetteglasset og monterer den svarte hetten, lokkforingen og HSP.
MERK: Prøver bør ikke komme i kontakt med HSP, og prøvevolumet vil avhenge av prøvetype. - Plasser hetteglasset som inneholder prøven og HSP tilbake på kaldplaten.
- Gjenta trinn 4.5 og 4.6 for hvert utvalg. Utfør disse trinnene per prøve i stedet for alt på en gang for å forhindre prøveoppvarming og dermed for tidlig flyktig frigjøring.
- Når alle prøvene er tilberedt i hetteglassene i glass, utfører du følgende trinn utenfor biosikkerhetshetten på benken. Slå på vakuumpumpen, plasser hetteglassene under vakuum til 30 mmHg, og fjern vakuumkilden.
MERK: Hetteglassene trenger ikke å være på kaldbrettet etter at vakuumpåføringen er fullført. - Dobbeltsjekk trykket etter at du har plassert alle prøvene under vakuum ved hjelp av trykkmåleren. Hvis et hetteglass har en lekkasje, må du kontrollere at hetten er skrudd godt fast, og at de hvite O-ringene på HSP- og lokkforingene er ordentlig på plass.
MERK: En kompromittert forsegling kan føre til redusert flyktig deteksjon sammenlignet med et hetteglass under vakuum. - Plasser hetteglassene i SPEU for optimalisert tid og temperatur med agitasjon ved 200 o/min. Trekk ut kulturer i 1 time ved 70 °C. Trekk ut stabile isotopprobing eksperimenter med fekal, kloakk, spytt og sputumprøver i 18 timer ved 37 °C.
- Plasser kaldplaten ved -80 °C for bruk etter at ekstraksjonsperioden er fullført.
- Når ekstraksjonen er fullført, plasser prøver på kaldplaten i 15 minutter for å trekke ut vanndamp fra HSP og hetteglassets hoderom.
- Overfør HSP-ene til ermene.
MERK: Eksperimentet kan settes på pause her i opptil ~ 1 uke ved romtemperatur før du mister de mer flyktige forbindelsene fra HSP-ene.
5. Analyser prøver på gasskromatografien - massespektrometer (GC-MS)
- Bruk følgende GC-MS-innstillinger (se materialtabellen): 35 °C med 5 min hold, 10 °C/min rampe til 170 °C og en rampe på 15 °C/min til 230 °C med et delt forhold på 20:1 og en total kjøretid på 38 minutter.
- Angi avsorpsjonsmetoden på følgende måte: 2 min, 70 °C forvarming; 2 min 260 °C desorpsjon; 34 min, 260 °C bakeout; og 2 min, 70 °C stiftbake.
- Definer rekkefølgen på prøvene, og start kjøringen i henhold til instrumentering.
- Hvis du vil sette opp en sekvens på Entech-programvaren, åpner du programmet. I alternativene til høyre for rullegardinmenyen for instrumentet velger du 5800 | Sekvens.
- Se sekvenstabellen i Entech-programvaren som ligner på den i GC-MS-programvaren. Gi navn til Eksempel-ID-kolonnen i henhold til Gjeldende date_vial nummer. Husk at Navn er analogt med Navn i GC-MS-sekvenstabellen, og 5800-metoden bestemmer hastigheten på temperaturrampen, oppbevaringstidene osv.
- Husk at kolonnene Skuff og Posisjon bestemmer hvor prøveforberedelsesskinnen (SPR) skal gå for å hente HSP-ene.
- Vær oppmerksom på de to skuffene med 30 flekker hver til nærmeste venstre, lagt ut som seks kolonner med fem flekker hver. Skuffeposisjonen som er mest og nærmest brukeren (foran) er posisjon 1, mens lengst til høyre er plassert 30 lengst unna.
- Vær oppmerksom på at disse skuffene er HSP A eller B, der HSP B er skuffen nærmere SPR (innerste skuff), og rett bak HSP B er HSP Blank. Plasser de utpakkede prøvene i skuffene, og velg stedet på sekvensen tilsvarende.
- Lagre sekvenstabellen, velg Kjør på venstre side, og start deretter med tom i desorber hvis den tomme HSP-en er i desorberen (betegnet med en HSP merket med gul etikett).
- Vær oppmerksom på at HSP-er vil bli håndtert av SPR for hvert utvalg i sekvensen. La SPR varme opp, så vises en melding øverst på skjermen for å bekrefte om tomen er i desorberen. Klikk hopp over for å bekrefte at pennen er der. Tillat SPR å kjøre alle prøver automatisk, og sekvensen på GC-MS-siden vil automatisk registrere dataene i separate filer.
6. Dataanalyse
- Kvalitetsfiltreringsdata om GC-MS-programvare (Materialfortegnelser).
- Gå gjennom hver topp på kromatogrammet, og kommenter topper som samsvarer med National Institute of Standards &Technology (NIST)-biblioteket (eller med et annet tilgjengelig bibliotek).
- Legg til kommenterte kromatogramtopper i behandlingsmetoden. Angi vilkårene for å velge topper for å inkludere forbindelser med større sannsynlighet enn 75 %, og kontroller at justeringen av hver identifiserende ion av forbindelsen ligger midt på toppen.
- Hvis du vil legge til en topp i behandlingsmetoden, velger du Kalibrer | Rediger sammensatt | Navn | sett inn forbindelsen under Ekstern standardforbindelse. Legg til navnet på forbindelsen, oppbevaringstid, Quant Signal Target Ion. Legg til de tre største toppene. Hvis du vil lagre, velger du ok | Metode | Lagre.
- Når prosessmetoden er definert, går du videre til Antall | Beregn og vis | QEdit-kvantresultat.
- Inspiser hver forbindelse for å sikre at toppene stemmer overens med forventet oppbevaringstid og er over bakgrunnsstøy.
- Når QEdit er fullført, velger du Avslutt | Ja for å lagre QEdits og gå tilbake til hovedkromatogrammet. Eksporter områdeintegrasjonene ved å åpne filen på venstre side. Velg antall | Generer rapport.
- Hvis du vil eksportere filer for bruk i DExSI, velger du Fil | Eksportere data til AIA-format | Opprett ny mappe, og velg en plassering for filen eller Bruk eksisterende mappe.
- Legg merke til et nytt vindu som åpnes for å velge filer som skal eksporteres. Flytt filene til høyre side av vinduet og klikk på Prosess. Vent noen sekunder til noen få minutter, avhengig av antall filer som konverteres.
- Riktig for isotopoverflod i DExSI i henhold til instruksjonene for DExSI-programvaren (https://github.com/DExSI/DExSI), og utfør analyse med en favorittprogramvare eller -program (f.eks. R). Skript som brukes til å generere tallene er plassert på https://github.com/joannlp/
VOC_SIP .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mono- og samkulturer av S. aureus, P. aeruginosa og A. baumannii
Mono- og samkulturene besto av bakterieartene S. aureus, P. aeruginosa og A. baumannii. Dette er vanlige opportunistiske patogener som finnes i menneskelige sår og kroniske infeksjoner. For å identifisere de flyktige molekylene som finnes i mono- og samkulturene, ble det utført en kort 1-timers ekstraksjon ved 70 °C med 200 rpm agitasjon. Fra mono- og samkulturene ved 24- og 48-timers tidspunkter ble det oppdaget 43 kommenterte flyktige molekyler (figur 2) blant annet aldehyder, ketoner, alkoholer, svovelforbindelser, hydrokarboner, karboksylsyrer eller estere og aromatikk. Det var et lite antall flyktige molekyler som bare ble oppdaget i visse mono- eller samkulturer på bestemte tidspunkter. For eksempel ble acetoin og 3-hydroksy-2-butanoneacetat bare oppdaget i S. aureuskulturene ved 48-timers tidspunktet (figur 2).
Flyktig 1-propanol 2-metyl ble oppdaget bare i P. aeruginosa og A. baumannii co-kultur ved 48 h (Figur 2). Etylacetat var til stede i A. baumannii-samkulturer med enten S. aureus eller P. aeruginosa i 48 timer (figur 2). Metabolittene heptan, 2,3-dimetyl og pentan, 2-metyl ble bare oppdaget i A. baumannii-kulturen ved 24 timer (figur 2). Acetaldehyd og etanol hadde høyere relative overfloder i A. baumannii og S. aureus co-kultur på 24-timers tidspunktet sammenlignet med 48 timer og en av stammene i kulturen alene (figur 2). Noen av volatilene var mer tallrike i kulturer på enten 24- eller 48-timers tidspunktet. Kortkjedede fettsyrer, inkludert eddiksyre, butanosyre og propanosyre, var ved høye relative overfloder i kulturer ved 48 timer, men ble ikke påvist i 24-timers kulturer (figur 2). Heksan var mer tallrik i TH-kontrollen ved 24 timer sammenlignet med 48 timer (figur 2).
Stabil isotopmerking av fekale, kloakk- og spyttprøver
For å identifisere aktiv produksjon av flyktige molekyler fra en biologisk prøve, ble en merket næringskilde, 13C glukose eller D2O, og media lagt til for å støtte veksten av det mikrobielle samfunnet. En unik prøve ble analysert fra hver av de forskjellige prøvetypene av fekale, kloakk- og spyttprøver i triplikat. Det var mer inkorporering av 13C i fullt merkede flyktige molekyler (figur 3A-D) sammenlignet med inkorporering med deuterium (figur 3E). 13C ble innlemmet i 2-butanone, 3-hydroksy; 2,3-butanedione; eddiksyre; og fenol for alle fekal-, avløps- og spyttprøver (figur 3A).
De andre merkede volatilene ble oppdaget i enten to eller en prøvetyper. For eksempel ble aceton, butanoinsyre og propanosyre påvist som merket i spytt og kloakk (figur 3B). De merkede volatilene, dimetyltrisulfid og disulfid dimetyl, ble beriket i både fekale og spyttprøver (figur 3C). Volatiles, 1-propanol, 2-butanone, benzophenone, etanol og metyltiolacetat, ble beriket bare i kloakk (figur 3D). Den merkede flyktige, 2,3-pentandoin, ble beriket i spytt (figur 3D). Deuterium ble innlemmet i volatiler, eddiksyre; benzaldehyd, 4-metyl; dimetyltrisulfid; fenol, enten fra spytt- eller avløpsprøver (figur 3E). I tillegg til de isotopberikede volatilene ble det oppdaget volatiler som ikke inneholdt stabile isotoper. For eksempel ble pyrazinforbindelser, unntatt pyrazin, 2,5-dimetyl, påvist i fekale, kloakk- og spyttprøver, men ble ikke fullt beriket med 13C (Supplerende figur S1).
Stabil isotopmerking av sputumprøver
Den stabile isotopmerkingsstrategien ble implementert for å identifisere aktivt produserte volatiler med sputumprøver fra syv mennesker med cystisk fibrose. Volatilene i utvalget ble sammenlignet med de som kom ut av prøver dyrket med en stabil isotopetikett. Hver flyktige komponent i hver prøve ble analysert to ganger: før og etter stabil isotopprobing med 13C glukose og media. Prøvene som ble samlet inn fra forsøkspersonene strakte seg over tre forskjellige tidspunkter eller kliniske tilstander: baseline, eksaserbasjon og behandling23. Volatilene som ble oppdaget som merket i de kultiverte sputumprøvene, hadde forskjellige relative overfloder sammenlignet med de umerkede volatilene fra de ukulturerte sputumprøvene. Culturing forhold i stabil isotop probing eksperimenter med sputum kan favorisere veksten av visse mikrober, noe som fører til forskjeller i relative overflod av volatiler sammenlignet med ukulturerte sputum prøver.
For eksempel var eddiksyre, dimetyltrisulfid, aceton og propanal, 2-metyl mer rikelig i de dyrkede sputumprøvene sammenlignet med de ukulturerte sputumprøvene (figur 4). Detektering av 13C-merket etanol, som kan være til stede i variable mengder i bakgrunnsromsluften, gir bevis på at etanol ble aktivt produsert av mikrobiell metabolisme fra 13C glukose. Variasjonsmengden ble forklart av faget som vurdert av Permutational Multivariate Analysis of Variance (PERMANOVA) og var også forskjellig for de to ulike flyktige datasettene (tabell 1 og supplerende figur S2). For det 13C-merkede kultiverte sputumet ble 51 % av variasjonen forklart av subjektet, mens 33 % av variasjonen ble forklart av subjekt fra volatilene i de ukulturerte sputumprøvene (tabell 1). Mikrobiomets samfunnssammensetning som bestemt av 16S rRNA-amlikonsekvensering fra de syv fagene var unik for hvert emne (Supplemental Figure S3), og de enkelte signaturene ble også reflektert i både de kultiverte og ukulturerte sputum flyktige molekylene som ble oppdaget.
I kultivert sputum ble det oppdaget 23 volatiler som var fullt merket med 13karbon. De isotopberikede (aktive) volatilene som ble oppdaget fra sputumprøvene, var forskjellige for hvert emne. Volatilene med isotopberikelse oppdaget i sputumprøvene fra alle syv forsøkspersonene var 2,3-butanedione; eddiksyre; aceton; dimetyltrisulfid; disulfid, dimetyl; pyrazin, 2,5-dimetyl (figur 5). Selv om disse volatilene ble oppdaget hos alle, varierte isotopberikelsen for hvert emne. Prøver fra emne 7 hadde høyere isotopberikelse av disulfid dimetyl sammenlignet med de andre seks forsøkspersonene (figur 5B). Aceton var høyere hos forsøkspersonene 4 og 6 (figur 5). Noen volatiler ble beriket med 13C bare i visse. For eksempel ble 1-butanol, 3-metyl og propanoinsyre, 2-metyl bare beriket i en undergruppe av prøver fra emne 2 (figur 5). I tillegg til de isotopberikede volatilene ble det også påvist volatiler som ikke er merket fra samme kultiverte sputum (Tilleggsfigur S4). Volatiles 2-piperidinone; benzaldehyd, 4-metyl; benzothiazol; butanoinsyre, 3-metyl; heksanal; heksan; isopropylalkohol; fenol; propanoinsyre, 2-metyl; pyrrolo 1,2-apyrazin-1,4-dione, ble heksahydro påvist i sputumprøvene, men var ikke isotopberiket (Tilleggsfigur S4).
Figur 1: Protokollskjematisk. En biologisk prøve plasseres i et hetteglass i glass og monteres med lokkforing og headspace sorbent penn. Et vakuum påføres hetteglasset til et trykk på ca. 30 mmHg er nådd. Vakuumkilden fjernes, og hetteglassene plasseres i den sorbente penneavsugsenheten der en statisk ekstraksjon utføres ved hjelp av varme, agitasjon og tid. Etter ekstraksjon plasseres hetteglassene på en kald metallblokk for å fjerne vann fra hoderommet og HSP. HSP-ene samles inn og kjøres via termisk desorpsjon på GC-MS. Dataene analyseres med ChemStation, DExSI og R. Forkortelser: HSP = Headspace Sorbent Pen; GC-MS = gasskromatografi-massespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Varmekart over mono- og samkulturer. VOC-er oppdaget fra mono- og samkulturer ved 24- og 48-timers tidspunkter. Samkulturene er kombinasjonene av bokstavene som representerer hver stamme. Alle prøver ble ekstrahert i 1 time ved 70 °C med 200 o/min agitasjon. Bevegelseskartintensitetsverdier er kolonne Z-skår, normalisert ved metabolitt. Z-poengsummen ble beregnet av verdiforskjellen fra verdigjennomsnittet, dividert med standardavviket for verdier. Dendrogrammet ble generert med det cluster_cols alternativet i pheatmap-funksjonen til R. Dendrogrammet representerer hierarkiske klynger der metabolitter som klynger seg sammen, har mer like Z-poengsummer på tvers av prøver. Forkortelser: A = A. baumanii; P = P. aeruginosa; S = S. aureus; TH = Todd Hewitt media (kontroll). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Prosentomregning av 13C til flyktig molekylmasse i fekale, spytt- og avløpsprøver i løpet av 18 timer samtidig inkubasjon og ekstraksjon. % konvertering ble beregnet for fullt merkede forbindelser ved å ta massen av den fullt merkede forbindelsen (M +N) og dele den med (M +N) + massen av den umerkede flyktige massen (M), der N er maksimalt antall mulige karboner (i A-D) eller hydrogener (i E) som kan merkes i hvert flyktige molekyl. Forbindelser anses å være fullt merket når alle karboner av flyktige er erstattet med 13C. Der data mangler, ble ikke flyktige funnet. For eksempel, i (D), ble 1-propanol ikke påvist i fekale eller spyttprøver. Antall replikeringer per prøve = 3. (A) De 13C-merkede volatilene som oppdages i alle prøvetyper (avføring, spytt og kloakk). (B) De 13C-merkede volatilene som bare er påvist i spytt- og avløpsprøver. (C) De 13C-merkede volatilene som er påvist i avføring og spyttprøver. (D) De 13C-merkede volatilene som ble oppdaget i en av de tre forskjellige utvalgstypene. (E) Deuterium-merkede flyktige molekylene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Varmekart over 13C-merkede volatiler fra kultivert sputum og flyktige molekyler oppdaget fra ukulturert sputum. De merkede volatilene kommer fra de stabile isotopprobing-eksperimentene der 13C glukose og brain heart infusjonsmedium ble lagt til sputum under ekstraksjonstrinnet for å dyrke mikrobiell vekst og fange aktiv flyktig produksjon. De umerkede flyktige molekylene ble oppdaget direkte fra sputumprøver. Varmekartintensitetene er Z-skår som beskrevet i bildeteksten til figur 2. Z-skårene ble imidlertid beregnet i hvert eksperiment for de kultiverte og ukulturerte sputumeksperimentene. Dendrogrammet ble generert som beskrevet i figur 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Prosentomregning av 13C til flyktig molekylmasse i sputumprøver fra syv forsøkspersoner med cystisk fibrose i løpet av 18 timer samtidig inkubasjon og ekstraksjon. % konverteringen ble beregnet som beskrevet i bildeteksten i figur 3. Volatiler som ikke oppdages i prøver, indikeres av fravær av data. N = 1-3. (A) De 13C-merkede volatilene som ble oppdaget ved en høyere prosentkonvertering i de fleste sputumprøver. (B) De 13C-merkede volatilene som ble oppdaget ved en konvertering med lavere prosent i de fleste sputumprøver. (C) De 13C-merkede volatilene oppdaget ved en lavere prosentkonvertering i et mindretall av sputumprøvene. Forkortelser: B = grunnlinje; E = forverring; T = behandling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Frihetsgrader | R2 | P-verdi | ||
| Ukulturert sputum | Tema | 6 | 0.33 | 0.001 |
| Klinisk tilstand | 2 | 0.01 | 0.46 | |
| Emne: klinisk tilstand | 12 | 0.12 | 0.092 | |
| Kultivert sputum med 13C glukose og media | Tema | 6 | 0.51 | 0.001 |
| Klinisk tilstand | 2 | 0.02 | 0.095 | |
| Emne: klinisk tilstand | 12 | 0.11 | 0.194 |
Tabell 1: Permutert multivariat variansanalyse (PERMANOVA) av sputumprøver. PERMANOVA ble generert ved hjelp av adonis-funksjonen fra den veganske pakken i R.
Supplerende figur S1: De relative overflodene av merkede (M+N(maks.)) og umerkede (M+0) volatiler på tvers av fekale prøver, spytt- og avløpsprøver. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: Ikke-metrisk flerdimensjonal skalering av dyrket sputum med stabil isotopprobing og ukulturert sputum. (A) NMDS av dyrket sputum med 13C glukose og media ble generert med k = 3 dimensjoner. Stressverdien var 0,07. (B) NMDS av ukulturert sputum ble generert med k = 3 dimensjoner. Stressverdien var 0,13. Forkortelser: NMDS = ikke-metrisk flerdimensjonal skalering; B = opprinnelig plan; E = forverring; T = behandling. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S3: Mikrobiell samfunnssammensetning av sputumprøver fra forsøkspersoner med cystisk fibrose. Vurdert av 16S rRNA amplicon sekvensering som en del av en større studie, ytterligere informasjon om tilnærming funnet i Carmody et al. 202019. fra forsøkspersoner med cystisk fibrose. Hvert stablede liggende stolpediagram er et annet tidspunkt. Forkortelser: B = baseline, E = forverring, T = behandling. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S4: Den relative overfloden av merkede (M+N(maks.) og umerkede (M+0) volatiler på tvers av sputumprøver fra syv personer med cystisk fibrose. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å identifisere flyktig produksjon i in vitro-kulturer og human-assosierte prøver, ble det utført flyktig analyse av mono- og samkulturer av P. aeruginosa, S. aureus og A. baumanii og stabil isotopprobing av forskjellige biologiske prøver. I analysen for mono- og samkulturer ble volatiler oppdaget ved å utføre en kort ekstraksjon i 1 time ved 70 °C. Den flyktige analysen av mono- og samkulturer tillot undersøkelsen av forbindelsene produsert både av individuelle arter og under deres interaksjoner med andre arter. Det var forskjeller i relativ overflod på tvers av de ulike kulturtypene og tidspoengene. I de stabile isotopforsøkene inkluderte de biologiske prøvene avføring og spytt fra friske personer, kloakk og sputum fra personer med cystisk fibrose. Stabil isotopprofilering gjorde det mulig å identifisere aktivt produserte flyktige molekyler ved å trekke ut i 18 timer ved 37 °C. Den lange ekstraksjonstiden med lavere temperaturaktivert vekst og metabolisme av mikrober tilstede i de biologiske prøvene. Sammenligning av 13C glukose og D2O berikelser viste at det var mer omfattende isotopberikelse med merket 13C.
Når du trekker ut forskjellige utvalgstyper, ble det først utført optimaliseringstrinn før du startet en fullstendig kjøring. Først tester du forskjellige volumer av et utvalg som en prøvekjøring. For noen eksempeltyper var for eksempel sputum bare små utvalgsvolumer tilgjengelige. Det anbefales å starte med et lavere volum eller mindre mengde prøve først, avhengig av prøvetype og tilgjengelige utvalgsmengder. Ikke trekk ut et stort volum eller for mye av prøven fordi den kan overvelde kolonnen og forurense HSP. Kolonneoverbelastning kan være tydelig når topper i kromatogrammet er mettet eller vises i etterfølgende kjøringer. HSP-forurensning har oppstått hvis overføring er til stede når HSP kjøres på nytt på GC-MS. I mono- og samkultureksperimentene var 200 μL kultur tilstrekkelig til å oppdage en rekke volatiler. I de stabile isotopprobingeksperimentene, avhengig av prøvetypen, varierte volumet for hvert eksperiment fra 500 μL til 1 ml. For det andre, avhengig av prøvetype og forbindelser av interesse, må ekstraksjonstiden og -temperaturen samt GC-MS- og termisk desorpsjonsmetodene justeres for å optimalisere flyktig deteksjon. Disse metodene ble fastslått å være passende for analyttene av interesse og kolonnetype.
Etter optimalisering av metoden, gjaldt de kritiske trinnene i protokollen trinnene før og etter utvinning. Under prøvepreparering ble prøver plassert på is slik at volatilene som var tilstede i prøven ikke unnslapp. Det var også viktig å sørge for at vakuumtetningen var stram, og lokket var godt lukket. Ellers ville det være en ineffektiv utvinning og redusert deteksjon av volatilene fra prøven. Lekkasjer kan oppstå fra O-ringene rundt lokkforingen eller HSP. For å sikre at hetteglasset var under vakuum, ble det brukt en måler før ekstraksjon for å sikre at O-ringene fortsatt var funksjonelle. I tillegg, etter utvinningen, ble det plassert prøver på isblokken slik at vann ble trukket ut av hoderommet i en bestemt periode. Vann i kolonnen kan føre til endringer i oppbevaringstider og undertrykkelse av MS-responsen, og dermed føre til ikke-kvantitative resultater. Muligheten til å trekke overflødig vann ut av HSP-ene før fjerning fra vakuumhylsen/hetteglassenheten er mulig på grunn av vaseprosessens lukkede system, og muligheten til å trekke ut vann tilbake til det kaldeste stedet i det ekstraksjonssystemet ved hjelp av -80 °C kaldplate.
Det er både begrensninger og fordeler ved disse metodene med hensyn til alternative metoder. Evaluering av mono- og samkultureksperimentene, det ble oppdaget flyktige signaturer som var spesifikke for en bestemt mikrobe eller medkultur. Det var også endringer i flyktige overflod over tid. Når det gjelder de stabile isotopprobingforsøkene i de forskjellige typer biologiske prøver, resulterte deuteriummerking ikke i så mange isotopberikede volatiler som 13C glukose. Metabolismen som kreves for å produsere isotopberikede volatiler med deuterium, kan være mer begrenset. I tillegg ble media lagt til de biologiske prøvene for å forbedre mikrobiell vekst, noe som kan føre til endringer i den mikrobielle samfunnssammensetningen. Kulturforhold for stabile isotopprobing eksperimenter kan velge for favorisert vekst av visse mikrober i en biologisk prøve. Dette var i motsetning til den korte utvinningen i en time ved 70 °C designet for å oppdage volatilene i samfunnsprøven før en eller få av mikroberene begynner å overta samfunnet. Kompleksiteten i de mikrobielle og kjemiske sammensetningene av fekale, kloakk-, spytt- og sputumprøvetyper gjør det vanskelig å tildele spesifikke kjemiske signaturer til en gitt mikrobiell eller menneskelig opprinnelse uten ytterligere analyser som sekvensering. Denne metoden ga en høy gjennomstrømning, løsemiddelfri vakuumutvinning som førte til mer sensitiv påvisning av prøver med lavt volum. Volumene som ble brukt til disse eksperimentene varierte fra 200 μL til 1 ml dyrkede biologiske prøver. I andre tilfeller (data ikke vist), ble biologiske prøver (f.eks. sputum- og fekalprøver) så lave som 15 μL eller 10 μg ekstrahert.
For fremtidige anvendelser av metoden kan et bredt spekter av utvalgstyper analyseres med små eller begrensede volumer. Dusinvis av prøver kan trekkes ut samtidig, og kjøretiden vil avhenge av parametrene til det spesifikke GC-MS-instrumentet. Når det gjelder stabil isotopprobing, når det kombineres med metagenomisk sekvensering, er det mulighet for å identifisere mikrober som er ansvarlige for produksjonen av de flyktige molekylene. Metagenomen til den biologiske prøven kan sekvenseres før og etter utvinning med stabil isotopprobing for å identifisere endringer i mikrobiell samfunnssammensetning. Metagenomisk sekvensering vil tillate identifisering av gener som er ansvarlige for produksjonen av de isotopberikede flyktige molekylene. Uthevet her er noen eksempler på utvalgstyper og tilnærminger som kan brukes som innspill til den presenterte protokollen, som allerede er etablert i forskjellige bransjer. Fordi flyktige molekyler er viktige diagnostiske indikatorer, kan bruken av denne protokollen utvides til biologiske laboratorier og kliniske helsemiljøer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
V. L. V og S. J.B. D. var tidligere ansatte i Entech Instruments Inc., og K. W. er medlem av Entechs universitetsprogram. J.P., J. K. og C. I. R. har ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Vi takker Heather Maughan og Linda M. Kalikin for nøye redigering av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH NHLBI (tilskudd 5R01HL136647-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) - blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
- Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
- Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
- Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
- Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179 (2015).
- Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
- Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
- Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
- Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87 (2012).
- Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).
- Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).
- Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P.
- Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151 (2018).
- Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
- Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).
- Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
- Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).
- Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
- Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
- Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
- Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390 (2020).
- Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
- Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
- Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12 (2015).
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).
- Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).
