Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Brukervennlig, høy gjennomstrømning og helautomatisk datainnsamlingsprogramvare for kryo-elektronmikroskopi med én partikkel

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62832
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, 2Gatan Inc.

Summary

Enpartikkel kryo-elektronmikroskopi krever en passende programvarepakke og brukervennlig rørledning for automatisk datainnsamling med høy gjennomstrømning. Her presenterer vi anvendelsen av en helautomatisk programvarepakke for bildeinnhenting, Latitude-S, og en praktisk rørledning for datainnsamling av vitrifiserte biomolekyler under lavdoseforhold.

Abstract

I løpet av de siste årene har teknologiske og metodologiske fremskritt innen enpartikkel cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) banet en ny vei for høyoppløselig strukturbestemmelse av biologiske makromolekyler. Til tross for de bemerkelsesverdige fremskrittene i cryo-EM, er det fortsatt rom for forbedring i ulike aspekter av arbeidsflyten for enkeltpartikkelanalyse. Enkeltpartikkelanalyse krever en passende programvarepakke for automatisk datainnsamling med høy gjennomstrømning. Flere automatiske programvarepakker for datainnsamling ble utviklet for automatisk avbildning for enpartikkel cryo-EM de siste åtte årene. Dette dokumentet presenterer en anvendelse av en helautomatisk bildeinnsamlingspipeline for vitrifiserte biomolekyler under lavdoseforhold.

Den demonstrerer en programvarepakke, som kan samle kryo-EM-data fullt ut, automatisk og presist. I tillegg kontrolleres forskjellige mikroskopiske parametere enkelt av denne programvarepakken. Denne protokollen demonstrerer potensialet i denne programvarepakken i automatisert avbildning av det alvorlige akutte respiratoriske syndromet-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike protein med et 200 keV kryo-elektronmikroskop utstyrt med en direkte elektrondetektor (DED). Rundt 3000 cryo-EM-filmbilder ble anskaffet i en enkelt økt (48 t) datainnsamling, noe som gir en atomoppløsningsstruktur av piggproteinet til SARS-CoV-2. Videre indikerer denne strukturelle studien at piggproteinet vedtar to store konformasjoner, 1-RBD (reseptorbindende domene) opp åpne og alle RBD ned lukkede konformasjoner.

Introduction

Single-particle cryo-EM har blitt en vanlig strukturell biologi teknikk for høyoppløselig struktur bestemmelse av biologiske makromolekyler1. Enkeltpartikkelrekonstruksjon avhenger av å skaffe seg et stort antall mikrografer av vitrifiserte prøver for å trekke ut todimensjonale (2D) partikkelbilder, som deretter brukes til å rekonstruere en tredimensjonal (3D) struktur av en biologisk makromolekyl2,3. Før utviklingen av DEDs varierte oppløsningen fra enkeltpartikkelrekonstruksjon mellom 4 og 30 Å4,5. Nylig har den oppnåelige oppløsningen fra single-particle cryo-EM nådd utover 1,8 Å6. DED og automatisert datainnsamlingsprogramvare har vært viktige bidragsytere til denne oppløsningsrevolusjonen7, der menneskelig intervensjon for datainnsamling er minimal. Generelt utføres kryo-EM-avbildning ved lave elektrondosehastigheter (20-100 e/Å2) for å minimere elektronstråleindusert strålingsskade av biologiske prøver, noe som bidrar til det lave signal-til-støy-forholdet (SNR) i bildet. Denne lave SNR hindrer karakteriseringen av høyoppløselige strukturer av biologiske makromolekyler ved hjelp av enkeltpartikkelanalyse.

Den nye generasjonen elektrondetektorer er CMOS (komplementære metalloksid-halvleder)-baserte detektorer, som kan overvinne disse lave SNR-relaterte hindringene. Disse direkte deteksjon CMOS-kameraene tillater rask avlesning av signalet, på grunn av hvilket kameraet bidrar til bedre punktspredningsfunksjon, egnet SNR og utmerket detektiv kvanteeffektivitet (DQE) for biologiske makromolekyler. Direkte deteksjonskameraer tilbyr høy SNR8 og lav støy i de innspilte bildene, noe som resulterer i en kvantitativ økning i detektiv kvanteeffektivitet (DQE) - et mål på hvor mye støy en detektor legger til et bilde. Disse kameraene tar også opp filmer med hastigheten på hundrevis av bilder per sekund, noe som muliggjør rask datainnsamling9,10. Alle disse egenskapene gjør raske direkte deteksjonskameraer egnet for lavdoseapplikasjoner.

Bevegelseskorrigerte stakkbilder brukes til databehandling for å beregne 2D-klassifisering og rekonstruere et 3D-tetthetskart over makromolekyler ved hjelp av ulike programvarepakker som RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 og EMAN215. For enkeltpartikkelanalyse er det imidlertid nødvendig med et enormt datasett for å oppnå en høyoppløselig struktur. Derfor er automatisk datainnsamlingsavgift svært viktig for datainnsamling. For å registrere store cryo-EM-datasett har flere programvarepakker blitt brukt det siste tiåret. Dedikerte programvarepakker, for eksempel AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS og EPU, er utviklet for automatisert datainnsamling.

Disse programvarepakkene bruker rutinemessige oppgaver for å finne hullposisjoner automatisk ved å korrelere bildene med lav forstørrelse til bilder med høy forstørrelse, som hjelper til med å identifisere hull med glassaktig is av appropriativ istykkelse for bildeanskaffelse under lavdoseforhold. Disse programvarepakkene har redusert antall repeterende oppgaver og økt gjennomstrømningen av cryo-EM-datainnsamlingen ved å skaffe seg en enorm mengde data av god kvalitet i flere dager kontinuerlig, uten avbrudd og den fysiske tilstedeværelsen til operatøren. Latitude-S er en lignende programvarepakke, som brukes til automatisk datainnsamling for enkeltpartikkelanalyse. Denne programvarepakken er imidlertid bare egnet for K2/ K3 DEDs og er utstyrt med disse detektorene.

Denne protokollen demonstrerer potensialet til Latitude-S i den automatiserte bildeinnhentingen av SARS-CoV-2 spikeprotein med en direkte elektrondetektor utstyrt med en 200 keV cryo-EM (se materialtabellen). Ved hjelp av dette datainnsamlingsverktøyet blir 3000 filmfiler av SARS-CoV-2 spike protein automatisk anskaffet, og ytterligere databehandling utføres for å oppnå en 3,9-4,4 Å oppløsning spike proteinstruktur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Tre viktige trinn kreves for kryo-EM-datainnsamling: 1. kryo-EM-nettforberedelse, 2. kalibrering og justering av mikroskopet, 3. automatisk datainnsamling (figur 1). Videre er automatisert datainnsamling delt inn i a. egnet områdevalg, b. optimalisering av Latitude-S, c. start automatisk hullvalg, og d. starte automatisk datainnsamling (figur 1).

1. Forberedelse og prøvebelastning av Cryo-EM-nettet for automatisk datainnsamling

  1. Rengjør gitteret med en glødeutladning og variere glødeutladningsparametrene basert på eksperimentelle krav (her 60 s ved 20 mA).
  2. Tilsett en nylaget proteinprøve (3 μL) i det glødeladede rutenettet og inkuber i 10 s.
  3. Flekk gitteret i 3-5 s ved 100% fuktighet og dypp dem raskt i flytende etan ved hjelp av et kryo-stempel.
  4. Klem gitteret manuelt inn i en klipsring for å danne patronen ved hjelp av en fleksibel C-klipsring.
  5. Legg de frosne patronmonterte rutenettene i autoloaderkassetten og overfør kassetten med nanohetten til den forhåndskjølte autoloaderen til mikroskopet for datainnsamling.

2. Mikroskopjustering og grunnleggende justering før automatisk datainnsamling

  1. Bjelkeskift
    1. Klikk på Strekskift fra kategorien Direkte justering .
    2. Reduser forstørrelsen, og sentrer strålen til den optiske aksen ved hjelp av Multifunksjon X- og Y-knappen .
  2. Justering av pivotpunkt
    1. Klikk alternativet Strek-helling i Direkte justering pp X fra kategorien Direkte justering .
    2. Kondenser strålen til et sted og minimer bevegelsen ved hjelp av Multifunksjon X- og Y-knotten .
  3. C2 blenderåpning sentrering
    1. Velg kondensatoråpningen i kategorien Justering .
    2. Kondenser strålen til et sted, sentrer strålen til den optiske aksen, og utvid deretter strålen for å dekke sirkelen jevnt.
    3. Gjenta disse trinnene til kondensatoren 2 blenderåpning er justert.
  4. Komafri justering
    1. Klikk komafri justering X fra kategorien Direkte justering for å justere strålen etter den optiske aksen.
    2. Bruk multifunksjonsknappen for å minimere formen og bevegelsen til FFT (sørg for at den er stabil).
    3. Gjenta samme prosedyre for Koma - fri justering Y.
  5. Angi parallell belysning før datainnsamling i cryo-EM på grunn av C-tvillinglinsen.
    1. Sett inn objektiv blenderåpning (70 μm) i diffraksjonsmodus.
    2. Fokuser objektivåpningen på det fremre brennplanet til diffraksjonslinsen ved å kontrollere defokusintensitetsknappen (objektiv objektiv og C2-objektivstrøm).
    3. Sørg for at den skarpe kanten på objektivåpningen ses etter riktig defokusering.
    4. Sett inn stråleproppen og spre intensiteten til gullpulverdiffraksjonsringene er minimert.
      MERK: Hvis strålen er riktig spredt, er en klar diffraksjonsring av gullpulveret synlig på skjermen, noe som indikerer at strålen er parallell.
    5. Trekk stråleproppen tilbake etter at du har satt parallellbelysningen og endre mikroskopmodusen til Nano-proben.
      MERK: Kontroller mikroskopjusteringen før du starter datainnsamlingen for å sikre optimal ytelse for mikroskopet. Alle disse innstillingene vil bli utført i mikroskopet Direct Alignment GUI Tab. All mikroskopjustering utføres ved hjelp av et testrutenett før datainnsamling.

3. Datainnsamling med Latitude-S

  1. Start automatisert programvare for automatisert datainnsamling i Latitude-S.
    MERK: Latitude-S-installasjonen krever også mikroskopkalibrering, som vil bli utført før datainnsamling, og innstillingene vil bli lagret permanent. Fem forskjellige tilstander for datainnsamling kalibreres med fire forskjellige forstørrelser (figur 1 og figur 2). Atlastilstand og rutenetttilstand er i to forskjellige forstørrelser i LM-modus (områder med lav forstørrelse). Hulltilstanden er i SA-modus (områder med høy forstørrelse), men med moderat forstørrelse. Fokus og datatilstand bruker SA-modus med høy forstørrelse.
    1. Klikk DigitalMicrograph fra Start-menyen , eller dobbeltklikk på DigitalMicrograph-ikonet på skrivebordet.
    2. Velg Teknikkbehandling-ikonet fra DigitalMicrograph.
      MERK: Dette systemet viser TEM - og Latitude-S-ikoner (figur 2 og tilleggsfigur S1).
    3. Velg Latitude-S-ikonet for automatisert datainnsamling med én partikkel.
      MERK: K2-kameraet fungerer i tre moduser: lineær/integrert, talt og superoppløsning. Brukeren kan velge hvilken som helst modus i grensesnittet til DigitalMicrograph. Databilder kan lagres som enten dosefraksjonerte bildestakker eller som summerte bilder i MRC-, TIF- eller DM4-filer med forskjellige bitdybder. Videre kan data lagres som bevegelseskorrigerte bilder for K3-kameraet. På et K2-kamera kan en ubehandlet bildestakk lagres som 4-biters MRC-, 8-biters TIF- eller 8-biters DM4-filer.
  2. Opprett en ny økt basert på innstillingene fra en tidligere økt.
    1. Merk av for Basert på forrige økt på paletten.
    2. Velg Ny-knappen .
    3. Velg mappen som inneholder økten som innstillingene for den nye økten er basert på. Gå til den forrige øktkatalogen for å opprette den nye økten. Velg mappen for å lagre den nye økten og tilknyttede data.
    4. Velg og velg mappen der den nye økten og tilknyttede data skal lagres.
      MERK: Hver tilstand og dens underliggende innstillinger (forstørrelse, belysningsforhold, bilde eller projektor) og stråleskift og kameraparametere (total eksponering, eksponering med ett bilde og binning) eksporteres fra den eksisterende økten til den nye økten. Banen til mappen vises som en tekststreng nederst på paletten. Hver av tilstandene og konfigurasjonspalettene har en stjerne (*) lagt til i tittelen for å vise at den allerede er konfigurert og klar til bruk.
  3. Fortsett en eksisterende økt.
    1. Trykk Fortsett-knappen i paletten for å fortsette en eksisterende økt.
      MERK: Atlasmontasjen kan ikke modifiseres.
    2. Velg og naviger til mappen som inneholder økten som må fortsettes.
  4. Start en helt ny økt.
    1. Klikk ny fane på paletten. Velg mappen som inneholder økten som skal fortsettes. Velg en mappe for å lagre dataene.
      MERK: Standard mappenavn bygges ved hjelp av dato og klokkeslett.
    2. Klikk på Innstilling-ikonet . I boksen Behandle tilstandsutforskning som vises, legger du til tilstand, angir TEM-betingelsen, kamerabetingelsen og bildet/stakken, og deretter gir du navn til statusen.
      MERK: Den automatiserte datainnsamlingsarbeidsflyten bruker 5 forskjellige tilstander for automatisert datainnsamling. Disse tilstandene er konfigurert og lagret i sine respektive tilstandspaletter. Tilstandssammendraget er gitt i tabell 1.
  5. Konfigurer atlastilstanden.
    1. Klikk på Atlas tilstandspalett.
    2. Konfigurer atlastilstanden med følgende parametere: forstørrelse 115x LM-modus i nanosonde, lysforhold-spotstørrelse 8 og lysstyrke 934400, binning: 1 og kameraeksponeringstid: 1,0 s for avbildning ved lav forstørrelse. Se tilstandssammendraget som er angitt i tabell 1.
    3. Klikk Neste for å gå til neste tilstand.
      MERK: Atlas-tilstanden er den laveste forstørrelsestilstanden, som gir undersøkelsen av hele rutenettet (Tilleggs figur S2). Generelt hjelper denne tilstanden oss med å visualisere hele rutenettet ved lav forstørrelse og bedømme istykkelsen, flatheten og den ødelagte firkanten i rutenettene. Det anbefales å generere atlaset på forskjellige områder av rutenettet for å observere optimal istykkelse og suboptimal istykkelse på gitteret (Supplerende figur S3). De nevnte parametrene kan varieres i henhold til brukerens behov.
  6. Konfigurer rutenettstatusen.
    1. Klikk på paletten for rutenettstatus.
    2. Konfigurer grid-tilstanden med følgende mikroskopavbildningsoptikk (forstørrelse 380x LM-modus i Nano-sonde), lysforhold (spotstørrelse: 8 og lysstyrke 626 200), binning: 1 og kameraeksponeringstid: 1,0 s.
    3. Se tilstandssammendraget for Latitude-S i tabell 1.
    4. Klikk Neste for å gå til neste tilstand.
      MERK: Netttilstanden er satt til en forstørrelse som er høyere enn atlastilstanden, slik at synsfeltet er en rutenettstorg (figur 2). I denne spesielle forstørrelsen observeres en rutenett firkant. Derfor observeres hull riktig i denne forstørrelsen, noe som bidrar til å kontrollere istykkelsen på hullene (Supplerende figur S4). Et enkelt båndpassfilter brukes i rutenettet for å finne hullene i patentgitteret. De nevnte parametrene kan varieres i henhold til brukerens behov.
  7. Konfigurer hulltilstanden.
    1. Klikk på hullpaletten.
    2. Konfigurer hulltilstanden med følgende mikroskopinnstillinger: bildeoptikk (forstørrelse 4500x SM-modus i Nano-sonde), belysningsforhold (spotstørrelse: 7 og Strålediameter 8,81 μm), binning: 1 og kameraeksponeringstid: 1,0 s.
    3. Endre parameterne hvis det er nødvendig basert på rutenetttypen. Se tilstandssammendraget i tabell 1.
    4. Klikk Neste for å gå til neste tilstand.
      MERK: SA-modusen indikerer et høyforstørrelsesområde i elektronmikroskopet. Hulltilstanden er i SA-forstørrelsesområdet med et synsfelt på noen få mikrometer (10-20 μm) (figur 2 og supplerende figur S4). Dette forstørrelsesområdet er høyere enn Atlas- eller Grid-tilstanden, men mye mindre enn Fokus/Data-tilstanden. I denne forstørrelsen vil individuelle hull være synlige. Hullstørrelsen er hensiktsmessig for å observere høye grader av forurensninger, tomme hull og riktig istykkelse på hullene. Hullene for avbildning velges basert på disse forutsetningene. To filtre brukes i hulltilstanden: ett for krysskorrelasjon av et hullreferansebilde med et nytt hullbilde og et annet for å justere scenehøyden til den eusentriske høyden.
  8. Konfigurer fokustilstanden.
    1. Klikk på Fokuspalett.
    2. Konfigurer fokustilstanden med følgende mikroskopinnstillinger: bildeoptikk (forstørrelse 45 000x SA-modus i nanosonde), lysforhold (spotstørrelse: 8 og lysstyrke 934400), binning: 1 og kameraeksponeringstid: 1,0 s.
    3. Fokuser på det amorfe karbonområdet nær hullet. Se tilstandssammendraget for Latitude-S i tabell 1.
    4. Klikk Neste for å gå til neste tilstand.
      MERK: SA-modusen indikerer et høyforstørrelsesområde i elektronmikroskopet. Fokustilstanden er den høyeste forstørrelsen av SA-området. I fokusmodus skiftes strålen til et nærliggende karbonområde av målhullet og utfører fokus automatisk for å samle inn dataene i datatilstanden. Et båndpassfilter kombinert med et hanning eller mykt rektangulært filter brukes i fokustilstand for å måle forskyvningen mellom to fokustilstandsbilder i samme område (figur 2). De nevnte parametrene kan varieres i henhold til brukerens behov.
  9. Konfigurer datatilstanden.
    1. Klikk på Datapalett.
    2. Konfigurer datatilstanden med følgende mikroskopinnstillinger: bildeoptikk (f.eks. forstørrelse 28 000x, 45 000x, 54 000x ved SA-modus i nanosonde), belysningsforhold (spotstørrelse: 8 og lysstyrke 934400), binning: 1 og kameraeksponeringstid: 1,0 s.
    3. Se tilstandssammendraget for Latitude-S som er angitt i tabell 1.
    4. Klikk Neste for å gå til neste tilstand.
      MERK: Datatilstanden er den høyeste forstørrelsen som er valgt basert på krav til pikselstørrelse og måloppløsning (figur 2). Generelt, etter fokusering, blir strålen automatisk flyttet til målområdet for å samle inn dataene. De ovennevnte parameterne kan endres basert på brukerens krav.

4. Fokuskonfigurasjon

  1. Klikk på Fokuskonfigurasjonspalett. Angi området for defokusverdier og trinnstørrelsen i den angitte kategorien.
  2. Trykk Neste for å gå til neste trinn.
    MERK: Lavere defokusverdier kan brukes til datainnsamling med høy oppløsning. Vanligvis brukes -0,5 til -3,0 μm defokusverdier med 0,25 eller 0,5 defokustrinnstørrelser til bildeanskaffelse. Brukere kan hoppe over trinnet for fokusoppsett hvis de bare vil sile eksemplet. Bare trykk på Neste-knappen på paletten for å hoppe over fokuskonfigurasjonstrinnet.

5. Fin justering

  1. Fokuser på noen funksjoner på rutenettet (f.eks. sekskantet is i isforurensning); se figur 3.
    MERK: Funksjonene skal ikke være for store eller for små. De skal være synlige ved både Atlas-tilstandsforstørrelse 115x (LA-modus) og dataforstørrelse.
  2. Klikk på Capture-knappen . Plasser røde kryss-merket på samme funksjon på hvert bilde av forskjellige tilstander.
  3. Begynn med fokus-, data- og hulltilstander fordi synsfeltet er mye større enn atlas- og rutenetttilstandene. Zoom på atlas- og rutenetttilstander for å plassere røde kryss-merket på samme funksjon i atlas- og rutenetttilstandene.
  4. Klikk på Beregn-knappen for å beregne posisjonene til fem forskjellige tilstander, som vil beregne forskyvningene mellom hver av tilstandene og reflektere disse til utdatavinduet.
    MERK: Forskyvningsverdiene er integrert i tilstandene for videre bruk (figur 3). Finjustering utføres for å gi høy nøyaktighet av plasseringen av hver tilstand (figur 3). Denne finjusteringen hjelper deg med å finne den nøyaktige plasseringen i alle de fem tilstandene. Finjustering er avgjørende for innsamling av enkeltpartikkeldata. Derfor anbefales det på det sterkeste å utføre finjustering før avbildning.

6. Datainnsamlingsprosedyre ved hjelp av Latitude-S

  1. Klikk på Capture-paletten.
    MERK: Vanligvis samles atlasdata ved lav forstørrelse (115x) for å visualisere de fleste rutenettplassene.
  2. Velg størrelsen på atlaset for å dekke hele rutenettet eller deler av rutenettet basert på kravet (f.eks. 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 eller 8 x 12).
    MERK: 16 x 16 atlasstørrelse dekker hele rutenettet.
  3. Klikk på Capture-knappen for å fange atlaset.
    MERK: Hovedvinduet i Latitude-S-navigasjonen åpnes og fyller den tilgjengelige plassen i DigitalMicrograph (tilleggsfigur S5). Tre bilderuter i hovednavigasjonsvinduet viser bilder av systemtilstandene med tre forskjellige forstørrelser. Det samlede atlaset vises for tiden i sin nåværende oppkjøpstilstand i ruten lengst til venstre. Fliser i atlaset fylles opp etter hvert som hver fangst inntreffer.
  4. Velg rutenettet basert på istykkelsen ved å navigere på atlaset (Tilleggsfigur S5). Når de ønskede rutenettplassene er valgt, klikker du på Planlegg-knappen og observerer flisene i rutenettet firkantet fyll opp når hver rutenett firkant er fanget.
  5. Klikk Tidsplan-knappen når rutenettplassene er valgt.
  6. Velg et representativt hull i rutenettet ved å legge til posisjonen. Når et hullbilde er anskaffet, definerer du dataene og fokusposisjonene og lagrer oppsettet som en mal (Tilleggsfigur S6).
  7. Klikk på Auto find, gi hullstørrelsen (f.eks. R1.2/1.3), og klikk på Finn-knappen i programmet, noe som vil føre til at Find-programmet automatisk finner hullene basert på hulldiameteren. Deretter klikker du på Mark-knappen for å legge til malen (figur 4) og legge til røde sirkelmerker i alle hullene i ett rutenett eller delvis rutenett.
  8. Sett opp intensiteten for å fjerne hullene fra rutenettplassen og isforurensningen (figur 4).
    MERK: Til slutt vil de valgte hullene bli merket med gult for planlegging av datainnsamlingen.
  9. Klikk på Planlegg-knappen i Latitude-oppgaver etter at du har lagt hullene gjennom Automatisk søk.
    MERK: Før du planlegger den automatiserte datainnsamlingen, må du kontrollere at væske nitrogentanknivået er tilstrekkelig, at turbopumpen for autoloader er av, og at RAID-stasjonsplassen er ledig. Oppgavebehandling for Latitude-S viser antall atlas-, rutenettstorg-, hull- og datatilstander som er planlagt for datainnsamling (figur 5). I Latitude-S GUI vil ulike fargevalg være synlige, og betydningen av de forskjellige fargevalgene vises: 1. Gult angir at de ikke er planlagt. 2. Grønn indikerer planlagt; 3. Blå indikerer ervervet; 4. Rød indikerer mislyktes.

7. Kryo-EM-databehandling

MERK: Cryo-EM bildebehandling av spike protein er beskrevet i detalj i nyere litteratur25.

  1. Utfør bildebehandling av spikeprotein av SARS-CoV2 ved hjelp av RELION 3.011.
  2. Screen filmbildene som er samlet inn ved hjelp av Latitude-S manuelt, og utfør stråleindusert bevegelseskorrigering av de enkelte filmene ved hjelp av MotionCor2-programvare9. Utfør den første screeningen av bevegelseskorrigerte mikrografer manuelt ved hjelp av cisTEM programvarepakke14.
    MERK: Nesten 85% av de automatisk anskaffede mikrografene var av god kvalitet, og data hadde signal innen 3.7-5.2 Å, som beregnes ved hjelp av cisTEM software14 (Supplemental Figure S7A,B).
  3. Behandle dataene ved hjelp av RELION 3.0-programvarepakken11.
    1. Plukk spikepartikler manuelt og underkast dem 2D-klasseklassifisering (tilleggsfigur S7C). Bruk den beste 2D-klassen som referanse for å autoplukke 3 99 842 enkeltspisspartikler fra mikrografene ved hjelp av RELION autoplukkverktøyet11.
      MERK: Tre runder med 2D-klassifisering ble utført før partiklene ble utsatt for 3D-klassifisering (supplerende figur S8). Omtrent 2.55.982 enkeltpartikler ble valgt ut til 3D-klassifisering, og datasettet ble klassifisert i seks klasser. Den endelige 3D auto-raffinement ble utført med den beste klassen; 85 227 spikepartikler ble hentet fra 3D-klassifiseringen.
    2. Etter automatisk raffinement, utfør per partikkeldefokusforbedring med riktige strålevinkelparametere for oppløsningsforbedring. Deretter utsetter du partiklene for bayesiansk polering ved hjelp av RELION 3.0-programvarepakken11. Til slutt bruker du det polerte partikkelsettet til en ny runde med 3D auto-raffinement ved hjelp av RELION 3.011.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I den nåværende pandemisituasjonen spiller cryo-EM en nøkkelrolle i å karakterisere strukturene til ulike proteiner fra SARS-CoV-226,27,28,29, som kan bidra til å utvikle vaksiner og legemidler mot viruset. Det er et presserende behov for fartsfylt forskningsinnsats med begrensede menneskelige ressurser for å bekjempe koronavirussykdommen i 2019. Datainnsamling i enpartikkel cryo-EM er et tidkrevende, men avgjørende skritt i strukturbestemmelsen av makromolekyler. Den siste utviklingen innen automatisk datainnsamling i cryo-EM har gjort det mulig med begrenset menneskelig innblanding i datainnsamlingen. Latitude-S-programvaren er en viktig programvarepakke for automatisk datainnsamling som brukes her for automatisert datainnsamling av renset SARS-CoV2 spike protein.

Cryo-EM datainnsamling av SARS-CoV-2 spike protein ble utført med en 200 keV cryo-EM utstyrt med en K2 Summit DED. Lokalitetene for datainnsamling på nettet med ønskelig istykkelse og partikkelfordeling ble merket manuelt. Stillingene ble markert parallelt under datainnsamlingen i bakgrunnen. I de merkede posisjonene utførte Latitude-S-programvaren automatisert datainnsamling med en nominell forstørrelse på 42 200x ved pikselstørrelsen 1,17 Å på prøvenivå. Konfigurasjonen for datainnsamling ved 42 200x forstørrelse ble allerede forhåndsinnstilt og testet. Totalt ble det registrert 40 rammer i 8 s med elektrondosen på 2 e−/Å2 per ramme; Dermed ble en totaldose på 80 e−/Å2 brukt til datainnsamling (tilleggstall S9). Dataene ble samlet inn i et defokusområde på -0,75 μm og −2,25 μm, med3000 filmfiler samlet inn på to dager. Hver 4 h ble periodiske kontroller og justeringer utført av programvaren for å sikre at alle filmfilene som ble samlet inn over 48 timer var av god kvalitet, og det var ingen stråleskift eller justeringsskift. Dataene ble samlet inn uavhengig uten menneskelig innblanding. I tillegg stopper Latitude-S automatisk avbildningen på tidspunktet for flytende nitrogenfylling, noe som reduserer unødvendig vibrasjon eller mekanisk drift i bildene.

Som nevnt i protokolldelen ble den første screeningen av bevegelseskorrigerte mikrografer utført manuelt ved hjelp av cisTEM-programvare14. Basert på screeningen ble de fleste dataene funnet å være innenfor signalområdet 3,7-5,2 Å (Supplerende figur S7A). Dette antyder at den automatiske datainnsamlingen ved hjelp av Latitude-S er god, og de fleste dataene er egnet for 3D-rekonstruksjon med høy oppløsning. I tillegg ble bilder samlet inn ved defokusområdet (-0,75 til -2,25 μm), og ulike defokusområder ble manuelt kontrollert av cisTEM14. De innsamlede dataene var svært nær installasjonsdefokusområdet i Latitude-S (Tilleggsfigur S7A, B).

Databehandling ble utført ved hjelp av RELION 3.0-programvarepakken11. Spikepartikler ble manuelt plukket for å beregne gjennomsnittet i 2D-klassen. Ulike strukturelle detaljer (helix og β-ark) er synlige i gjennomsnittet i 2D-klassen (Supplemental Figure S7C), noe som sterkt antyder at strukturell karakterisering med høy oppløsning er mulig ved hjelp av dette datasettet. 3D-klassifisering indikerer imidlertid også at spikeprotein har 1-reseptorbindingsdomene (RBD) åpen og all RBD-avslutningskonformasjon (Tilleggsfigur S8). 3D-klassifiseringen indikerer at klasse-1 har maksimalt antall partikler, som vises som en 1-RBD opp åpen konformasjon. Videre har klasse-3 og klasse-4 et lignende antall partikler, og begge modellene så ut til å ha all RBD ned nær konformasjon. Klasse-5 viser imidlertid en mellomliggende konformasjon, der 1-RBD er i mellomstilling. Imidlertid ble 1-RBD opp åpne konformasjoner av piggproteinet rekonstruert ved hjelp av C1-symmetri, og den samlede oppløsningen er 4,4 Å (figur 6 og supplerende figur S10). På samme måte ble alle avslutningskonformasjoner i RBD (klasse 3 og klasse 4) raffinert sammen med C3-symmetri, og den totale oppløsningen ved 0,143 FSC er ~3,9 Å (figur 7).

Den generelle bildebehandlingen indikerer at spikeproteinet vedtar alle RBD-er på nært hold og 1-RBD opp åpen konformasjon. I tillegg ble det identifisert en mellomliggende konformasjon av piggproteinet. Den høyoppløselige cryo-EM-strukturen til S2-underdomenet til piggproteinet indikerer sidekjedene til individuelle aminosyrerester (figur 6B og figur 7C). Alle 3D-rekonstruksjoner og kryo-EM-resultater ligner sterkt på funn i nylig publisert litteratur25. Imidlertid ble den høyoppløselige cryo-EM-strukturen til piggproteinet karakterisert innen 15 dager, noe som bare er mulig på grunn av automatiske kryo-EM-datainnsamlingsprotokoller og automatisk partikkelplukkingsprogramvare. Derfor kan automatiske programvarepakker for datainnsamling, inkludert Latitude-S, bidra betydelig til karakterisering av flere høyoppløselige cryo-EM-strukturer av biologiske makromolekyler.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt for automatisert datainnsamling ved hjelp av Latitude-S: Generelle trinn som skal følges før datainnsamling (klargjøring av rutenett, prøvelasting og mikroskopjustering). Datainnsamling er hoveddelen av dette manuskriptet, og rørledningen som skal følges under datainnsamlingen fremheves. Forkortelser: cryo-EM = kryo-elektronmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Oppsett av forskjellige tilstander for innsamling av enkeltpartikkeldata ved hjelp av Latitude-S GUI. (A) Latitude-S-programvarepakke for datainnsamling i DM3-programvaredrakt. (B) Arbeidsflyt for datainnsamlingsprosedyren. (C) Utvidelse av hvert panel. Forkortelse: GUI = grafisk brukergrensesnitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Finjustering for å sette opp høy nøyaktighet for fokusering og bildeanskaffelse. Finjustering utføres på fem tilstander a. Atlas, b. Hole, c. Data, d. Grid, e. Focus. Fokuser hver tilstand ved å plassere det røde merket på samme posisjon. Det anbefales på det sterkeste å utføre finjustering før du starter en ny økt, noe som vil bidra til å utføre avbildning i en bestemt posisjon. Bildeanskaffelse i en bestemt posisjon (uten større skift) avhenger helt av nøyaktigheten av den fine justeringen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Automatisk valg av hull ved hjelp av Latitude-S. Automatisk funn av hull for datainnsamling utføres automatisk basert på hullstørrelse. (A) Viser posisjonen til hullfinnevektoren for automatisk å finne hullene. Skalastang = 20 μm. (B) Viser merkingen av hull ved hjelp av hullfinnevektoren og justerer intensiteten for å fjerne markøren fra kantområdet og isforurensningen. Skalastenger = 20 μm (venstre) og 10 μm (midten). (C) Viser automatisk tilsetning av hullene for avbildning (gul). Skalalinje = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Live view av datainnsamling. (A) Stillingene er merket med gult, grønt, blått og rødt basert på status for datainnsamling i hver posisjon. (B) Fargekode for overvåking av statusen for datainnsamling. Grønn: Planlagt, Gul: Ikke planlagt, Blå: Anskaffelse, Rød: Mislyktes. Det venstre panelet viser flere hull farget grønt (planlagt) og noen få hull merket blå (ervervet); skala bar = 10 μm. Det midterste panelet viser 4300x forstørrelse av et individuelt hull. I dette bildet av et hull (midtpanel) viser den blå firkantboksen fokusområdet, og den grønne firkantboksen viser bildeområdet. skala bar = 1000 nm. Panelet til høyre viser det innhentede bildet. Det ekstreme høyre panelet viser de planlagte bildenumrene, den totale tiden som kreves for avbildning, og hvor mange bilder som er planlagt for avbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Spike 3D-modus med 1RBD åpen. (A) Automatisk raffinert og skjerpet spike protein kart over 1-RBD opp åpen er representert i side,topp og bunn visninger. (B) EM-kart er utstyrt med krystallstruktur for bedre visualisering av sidekjedene. De uthevede områdene på kartet har tettheter for sidekjeder. Forkortelser: 3D = tredimensjonal; RBD = reseptorbindingsdomene; EM = elektronmikroskopi; NTD = N-terminaldomene; S1 = underenhet 1; S2 = underenhet 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: All RBD-avslutningskonformasjon av spikeprotein. (A) Automatisk raffinert og skjerpet spike proteinkart over alle RBD-avslutningskonformasjoner representert i side- og toppvisninger. (B) EM-kart er utstyrt med krystallstruktur for bedre visualisering av sidekjedene. Pilene viser at regionene på kartet har tettheter for sidekjeder (C). Forkortelser: RBD = reseptorbindingsdomene; EM = elektronmikroskopi; NTD = N-terminaldomene; S1 = underenhet 1; S2 = underenhet 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur S1: Brukergrensesnitt for bildeanskaffelse i Latitude-S: Ulike mikroskopkontrollere (f.eks. åpne/lukke kolonneventilen, skjerminnsatsen/tilbaketrekkingen styres av Latitude-S GUI. Kolonneventil, kamera, skjermstatus og flytende nitrogenpåfylling kan styres i venstre panel. Nederst i dette panelet ser ulike kalibreringsparametere grønne ut (f.eks. forstørrelse, bjelkevinkel, objektivt fokus). Hvis en parameter ser svart ut, betyr det at parameteren ikke er riktig optimalisert. Derfor bør alle parametere optimaliseres før du starter en ny økt. Forkortelse: GUI = grafisk brukergrensesnitt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: Representasjon av Atlas-tilstand. Ulike Atlas-tilstander som viser rutenetttorg og hvilken type is som dannes. (A-F) Ulike Atlas-størrelser er også uthevet. (A, B, D, F) Et tykt ismønster er uthevet. (C, D) Brutte firkanter er uthevet. Tykk is og ødelagte områder (merket i figuren) er ikke egnet for avbildning. (E, F) Gode rutenett firkanter for avbildning; A, B, C, D og F viser rutenettplassene som passer for bildebehandling med høy oppløsning. Tykke isgitter firkanter og ødelagte rutenett firkanter må imidlertid utelukkes. Skalastenger = 100 μm (A-C), 50 μm (D, E) og 25 μm (F). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S3: Representasjon av rutenetttilstand og hulltilstand. Rutenetttilstand og tilsvarende hulltilstand vises i bildet. (A, E) Tomt hull, (F, G) tykk is, (E) isforurensning og (A, B, C, D, E og G) egnet istykkelse er merket i bildet. Egnede istykkelseshull er valgt for bildeanskaffelse (A, B, C, D, E og G). Skalastenger = 10 μm (A, E, F, G), 2 μm (B), 50 μm (C), 5 μm (D). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S4: Hullreferanse for automatisk avbildning. Hullbilde (QUANTIFOIL-Holey Carbon grid QUANTIFOIL R 1.2/1.3) fanges opp og lagres for fremtidig referanse. Størrelsen på hullreferansen kan varieres basert på de forskjellige typene rutenett. Det anbefales å alltid fange opp hullreferansen før du starter en ny økt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S5: Bildeopptakspanel ved ulike forstørrelser og hullvalg. (A) Opptakspanelet viser innstillingene for datainnsamling. (B) Hovednavigasjonsvinduet i Latitude-S viser tre påfølgende forstørrelser. I Atlas-tilstand (150x) velges rutenettplassene for datainnsamling (venstre panel, skalalinje = 50 μm). I høyere forstørrelse (380x) er en enkelt firkant fokusert (midtpanel, skalalinje = 20 μm). Ytterligere høyere forstørrelse (4300x), hull inne i hver firkant er fokusert (høyre panel, skalastang = 5 μm). Disse forstørrelsene vil imidlertid endres i henhold til størrelsen og formen på rutenettene. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S6: Opprette en mal for hullvalg og avbildning. Malgenerering utføres ved å legge til en posisjon på hullet for data, og fokuset er plassert ved siden av hullet på karbonoverflaten. Fokuset skal plasseres på karbonområdet slik at bjelkediameteren ikke skal berøre noe tilstøtende hull. Skalastenger = 20 μm (venstre panel), 10 μm (midtpanel), 1000 nm (høyre panel). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S7: Cryo-EM-avbildning av SARS-CoV2 ved hjelp av Latitude-S og bildescreening. (A) Screening av oppkjøpte mikrografer: 1D CTF-passform, 2D CTF-passform og CTF-parametere; estimering av SARS-CoV2 spike proteindata ved hjelp av cisTEM. 1D CTF-passform og Thon-ring viser at det samlede signalet er 4,8 Å. (B) Mikrografer med to forskjellige defokusverdier av piggproteinet anskaffes ved hjelp av Latitude-S. Skalastenger = 50 nm. (C) Endelig gjennomsnitt for 2D-klasse. Gjennomsnittet i 2D-klassen viser topp-, bunn- og sidevisninger av piggproteinet. Alle detaljene med høy oppløsning er synlige i gjennomsnitt i 2D-klassen. Forkortelser: cryo-EM = kryo-elektronmikroskopi; 1D = endimensjonal; 2D = todimensjonal; CTF = kontrastoverføringsfunksjon; SARS-CoV2 = alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S8: Databehandling av SARS-CoV2 spike proteindata som er samlet inn ved hjelp av Latitude-S-programvare. Bildet viser arbeidsflyten som fulgte for behandling av kryo-EM-dataene til spikeprotein. 3D-klassifisering av spikeprotein utføres ved hjelp av Relion 3.0. Klasse-1 viser 1-RBD opp åpen konformasjon. Klasse-3 og klasse-4 viser all RBD ned nær konformasjon av spike-protein. Klasse-5 viser mellomkonformasjonen av piggproteinet. Forkortelser: cryo-EM = kryo-elektronmikroskopi; 3D = tredimensjonal; RBD = reseptorbindingsdomene; SARS-CoV2 = alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S9: Dosefraksjonert bilde tatt som referanse for endelig bildeinnhenting. Dosefraksjoneringsbilder er tatt med en eksponering på 8,0 s og 0,2 s/rammeeksponering. Klikk på Automatisk lagring-knappen i nærheten av kameraet for å lagre filmfilene automatisk. Etter bildeinnhenting, klikk på bildet og lagre de dose-fraksjonerte bildeparametrene ved hjelp av den oppdaterte bildeknappen i datainnsamlingstilstanden. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S10: Vinkelfordeling og Fourier-skallkorrelasjon av det genererte SARS-CoV-2 1 RBD opp åpen konformasjonstoppproteinkart. (A) Vinkelfordeling av den endelige 3D-modellen av 1-RBD opp åpen konformasjon av piggproteinet. Blå representerer lavere verdier, og rødt representerer høyere verdier for den normaliserte partikkelfordelingen. (B) Fourier shell korrelasjonskurve som viser 4.4 Å oppløsning av 1-RBD opp åpen konformasjon av spike protein, estimert ved cut-off. Forkortelser: 3D = tredimensjonal; RBD = reseptorbindingsdomene; SARS-CoV2 = alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2; FSC = Fourier skallkorrelasjon. Klikk her for å laste ned denne filen.

Atlas-bildetilstand Atlas 115
Forstørrelse 115, Pikselstørrelse 34,7 nm
Indikert defokus 4,38 mm
Spotstørrelse 8
Lysstyrke 934400
Modus BILDEBEHANDLINGILM
Binning 1
Eksponeringstid 1,0 s
Tilstand for rutenettundersøkelse Rutenett 380
Forstørrelse 380, Pikselstørrelse 11,2 nm
Indikert defokus 2,37 mm
Spotstørrelse 8
Lysstyrke 626200
Modus BILDEBEHANDLINGILM
Binning 1
Eksponeringstid 1,0 s
Tilstand for hullundersøkelse Hull 3400
Forstørrelse 3400, Pikselstørrelse 1,20 nm
Indikert defokus -0,75 μm
Spotstørrelse 7
Bjelke diameter 8,81 μm
Modus BILDEBEHANDLINGILM, SA, Mh
Binning 1
Eksponeringstid 1,0 s
Fokustilstand Fokus 45k
Forstørrelse 45 000, pikselstørrelse 0,0924 nm
Indikert defokus 4,51 μm
Spotstørrelse 6
Bjelke diameter 0,716 μm
Modus BILDEBEHANDLINGILM, SA, Mh
Binning 1
Eksponeringstid 1,0 s
Acqisition-tilstand Data 45k
Forstørrelse 45 000, pikselstørrelse 0,0924 nm
Oppsett av defokus Min: -4500 nm, Maks: -1500 nm, Trinn: 250 nm
Spotstørrelse 6
Bjelke diameter 0,752 μm
Modus BILDEBEHANDLINGILM,SA,Mh
Binning 1
Eksponeringstid Total eksponering på 8 s for 20 bilder
Kameraoppsett Telt, Få normalisert, Defekt korrigert
Oppsett av datalagring MRC

Tabell 1: Sammendrag av oppsett av Latitude-S-tilstand.

Spesifikasjon K2-base K2-toppmøtet
TEM driftsspenning 200-400 kV
Sensorens aktive område 19,2 mm × 18,6 mm
Sensorstørrelse i piksler 3838 × 3710 7676 × 7420 Super-
Resolusjon
Fysisk størrelse på bildepunkt 5 μm
Binning 1–8x
Avlesning av sensor Et vilkårlig område
Forstørrelse i forhold til film 1,3–1,5x
Sensorens utlesingshastighet 50 fulle fps 400 fulle fps
Overføringshastighet til datamaskin 8 fulle fps 40 fulle fps
Bildevisning 8 fulle fps 10 fulle fps
DQE-ytelse (300 kV) >0,30 (topp) >0,25 ved 0,5 av fysisk Nyquist >0,7 (topp) >0,50 ved 0,5 av fysisk Nyquist >0,06 ved 1,25 fysisk Nyquist
Programvare Gatan mikroskopi suite inkludert DigitalMicrograph

Tabell 2: Kameraspesifikasjoner.

Alternativ for konfigurasjon Verdi
Mikroskop Type Talos Arctica G2
Høy spenning 200 kV
Kilde XFEG
Linse Cryo Twin
Vakuum system Talos TMP IGP
Eksempel på laster Automatisk innlasting

Tabell 3: Konfigurasjon av mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Latitude-S er et intuitivt brukergrensesnitt som gir et miljø der du automatisk kan sette opp og samle tusenvis av mikrografer eller filmfiler med høy oppløsning på to dager. Det gir enkel navigering på tvers av rutenettene og opprettholder plasseringen av mikroskopstadiet mens det beveger seg fra lav forstørrelse til høy forstørrelse. Hvert trinn i datainnsamlingen med Latitude-S er tidseffektiv, med funksjoner som et enkelt brukergrensesnitt, rask strømming av data med hastighet på opptil 4,5 GB/s og samtidig visning av data under anskaffelse. I tillegg ble forhåndskalibrert dosefraksjonering, doserate, fokus og forstørrelsesparametere lett lastet inn på nytt for å starte en ny økt med automatisk datainnsamling og spare tid.

Å innhente data automatisk i fravær av konstant overvåking og uten å gå på kompromiss med kvaliteten på datasettet er en utfordrende og tidkrevende oppgave. Automatisert datainnsamling ved hjelp av Latitude-S-programvare er praktisk når tid og ressurser er store begrensninger, spesielt under denne pandemien. Imidlertid har flere kryo-EM-strukturer av ulike proteiner av SARS-CoV-2 blitt løst de siste månedene, noe som vil hjelpe farmasøytiske selskaper med å utvikle vaksiner. Ulike laboratorier bruker forskjellige typer programvarepakker for automatisk datainnsamling til å samle inn data. Vi brukte Latitude-S med en K2 Summit DED for cryo-EM automatisk datainnsamling på hullete karbonnett eller hjemmelagde GO-belagte rutenett30.

Denne studien ble utført ved hjelp av de ovennevnte parametrene i protokolldelen, som gir sterke bevis på at Latitude-S er en passende og ideell programvarepakke for automatisk datainnsamling for single-particle cryo-EM. Det anbefales imidlertid på det sterkeste å følge visse protokoller før du starter bildet ved hjelp av et K2-kamera. K2 direkte deteksjonskamera krever grunnleggende vedlikeholdsrutiner for å oppnå høyest ytelse. Regelmessig gløding av kameraet til 50° i 24 timer hjelper sensoren til å yte optimalt ved å redusere bakgrunnsstøyen og forurensningen på overflatenivå. Men etter kamera annealing, oppdatering av forsterkning og mørke referanser av kameraet er et obligatorisk skritt (tar ~ 45 min) før du utfører noen bildeoppkjøp.

Selv om Latitude-S er en stabil og brukervennlig programvarepakke for automatisk innsamling av kryo-EM, er det viktig å optimalisere ulike parametere (forstørrelser, spotstørrelse, lysstyrke og doseringshastighet) i 5 forskjellige tilstander av Latitude-S i begynnelsen. Forstørrelsen av hull eller gittertilstander avhenger av hullstørrelsene til hullgitteret eller hullgittertypene (f.eks. R2/2 eller R1.2/1.3 eller R 0.6/1). For eksempel er størrelsen på rutenetthullstørrelsen R0,6/1 0,6 μm, og hullstørrelsen på R2/2-rutenettet er 2 μm. Dermed kreves to forskjellige typer forstørrelse for å visualisere hullene riktig for rutenetttyper R0.6 / 1 og R2 / 2 i rutenett- og hulltilstandene i Latitude-S.

Derfor vil forstørrelsesinnstillingene for ulike typer rutenett i 5 forskjellige tilstander være variable. Spotstørrelsen og lysstyrken avhenger sterkt av forstørrelsen. Derfor kan disse verdiene endres ved forskjellige forstørrelsesverdier. Derfor anbefales det å optimalisere de forskjellige parametrene til de 5 forskjellige tilstandene til Latitude-S ved hjelp av forskjellige typer kryo-EM-rutenett før du starter automatisk datainnsamling. Når alle parametrene er optimalisert og lagret, er det imidlertid enkelt å laste inn alle parametrene på nytt basert på brukerens krav og bruke Latitude-S ved forskjellige forstørrelser eller rutenetttyper.

En viktig fordel med å bruke K2 med Latitude-S er at brukerne enkelt kan regulere den åpne/lukke stråleventilen, sette inn/trekke inn kameraet, sette inn/trekke inn fosforskjermen på mikroskopet og regulere flytende nitrogenpåfylling ved hjelp av GUI fra Latitude-S. Eventuelle andre alternativer (for eksempel pistolvinkel, pistolskift, stråleskift, dreiepunkter, C2 blenderåpningssentrering, rotasjonssenter, komafri justering) er imidlertid ikke tilgjengelige via K2 Latitude-S GUI Tab (tilleggsfigur S1 og figur 2). I løpet av de lange timene med datainnsamling kan strålens posisjon skifte.

Latitude-S kan utføre automatiserte periodiske kontroller og rettelser for å holde oversikt over systemets stabilitet gjennom hele datainnsamlingsperioden. Stabiliteten til systemet opprettholdes ved å sentrering av strålen og oppdatere de mørke referansene. Den konstante sjekken sikrer den høye kvaliteten på de innhentede dataene. I Latitude-S korrigeres eusentrisk høyde (Z-høyde) bare én gang før datainnsamlingen, og den eusentriske høyden beregnes automatisk av Latitude-S når den endrer rutenettet. Fokuset måles og justeres automatisk basert på det brukerdefinerte fokusområdet. Programmet tilbakestiller trinn Z-posisjonen hvis den overskrider den angitte terskelverdien. Denne stabiliteten styres gjennom systemstabilitetspaletten. Imidlertid, som andre automatiske datainnsamlingspakker, har Latitude-S også noen begrensninger.

Latitude-S kan ikke beregne den eusentriske høyden (Z-høyden) hvis rutenettet er ujevnt. I dette scenariet kan den ikke samle inn data, eller defokusverdiene vil være helt utenfor området. Derfor bør brukerne være ekstremt forsiktige med å klargjøre rutenettene uten bøying og bilde bare flate overflategitter ved hjelp av Latitude-S. I motsetning til Leginon, SerialEM og UCSF-Image er ikke Latitude-S en fritt tilgjengelig programvarepakke. Latitude-S er kompatibel med Gatan-kameraer, inkludert filtrerte eller frittstående K2-, K3- og K3-basekameraer for direkte gjenkjenning, i tillegg til Rio- og OneView-kameraer. En annen viktig ulempe for brukerne er at den ikke er kompatibel med andre populære DED-er som Falcon DED. Dette gjelder imidlertid også for EPU, en annen automatisk programvarepakke for datainnsamling, som er tilgjengelig med kryomikroskop og bare kompatibel med Falcon-kameraet. Imidlertid er EPU også funksjonell med K2 / K3 med et energifilter (BioQuantum K3 Imaging Filter), men ikke med et frittstående K2 / K3-kamera.

Latitude-S er ganske lik EPU, SerialEM, AutoEM, AutoEMation og Leginon, som er programvarepakker som brukes til automatisk datainnsamling for single-particle cryo-EM. Latitude-S er imidlertid bare kompatibel med K2 DED- eller K3 DED- eller BioQuantum K3-bildefilter. I tillegg leveres kontinuerlig teknisk støtte av firmaet for Latitude-S-brukere. Denne tekniske støtten er gunstig for små brukergrupper, som trenger å bruke K2 DED-, K3 DED- eller BioQuantum K3 Imaging Filter-enhetene for datainnsamling og ikke har noen forkunnskaper om hvordan du konfigurerer eller bruker gratis programvarepakker som SerialEM og Leginon.

Det finnes mange andre funksjoner, for eksempel mikrokrystallelektrondiffraksjon (microED), tomografi og energidispergeringsspektrometri (EDS), som er tilgjengelig i forskjellige andre versjoner av Latitude. Derfor kan brukere bruke den samme programvarepakken for datainnsamling i andre modi. Så vidt vi vet er datainnsamling for microED, tomografi og EDS ikke tilgjengelig i EPU eller andre programvarepakker. Derfor kan denne Latitude-programvarepakken være nyttig for forskjellige formål i tillegg til automatisk datainnsamling i kryoem med én partikkel. SerialEM og Leginon, begge gratis programvarepakker, er imidlertid egnet for Falcon- eller K2/K3-kameraer og er ekstremt nyttige for nye brukere. Latitude-S er imidlertid ikke fritt tilgjengelig, noe som kan være en ulempe med denne programvarepakken.

Oppsummert er det automatiske datainnsamlingsverktøyet Latitude-S like bra som andre automatiske programvarepakker for datainnsamling (f.eks. Latitude-S er en ekstremt stabil og brukervennlig programvarepakke for datainnsamling, som er tilgjengelig med filtrerte eller frittstående K2-, K3- og K3-basekameraer for direkte deteksjon, i tillegg til Rio- og OneView-kameraer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende eller økonomiske interessekonflikter å erklære.

Acknowledgments

Vi anerkjenner Institutt for bioteknologi, Institutt for vitenskap og teknologi (DST) og vitenskap, og Departementet for personalutvikling (MHRD), India, for finansiering og cryo-EM-anlegget ved IISc-Bangalore. Vi anerkjenner DBT-BUILDER Program (BT / INF / 22 / SP22844 / 2017) og DST-FIST (SR / FST / LSII-039 / 2015) for National Cryo-EM anlegget på IISc, Bangalore. Vi anerkjenner økonomisk støtte fra Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 og SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Vi takker Ms. Ishika Pramanick for å forberede cryo-EM-rutenett, kryo-EM-datainnsamling og utarbeide materialtabellen. Vi takker også Mr. Suman Mishra for kryo-EM bildebehandling og for å hjelpe oss med å forberede tallene. Vi takker prof. Raghavan Varadarajan for å hjelpe oss med å få den rensede piggproteinprøven for denne studien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blotting paper Ted Pella, INC. 47000-100 EM specimen preparation item
Capsule Thermo Fisher Scientific 9432 909 97591 EM specimen preparation unit
Cassette Thermo Fisher Scientific 1020863 EM specimen preparation unit
C-Clip Thermo Fisher Scientific 1036171 EM specimen preparation item
C-Clip Insertion Tool Thermo Fisher Scientific 9432 909 97571 EM specimen preparation tool
C-Clip Ring Thermo Fisher Scientific 1036173 EM specimen preparation item
EM grid (Quantifoil) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
Glow discharge Machine Quorum N/A Quorum GlowQube glow discharge machine
K2 DED Gatan Inc. N/A Cryo-EM data collection device (Camera)
Latitude S Software Gatan Inc. Imaging software
Loading station Thermo Fisher Scientific 1130698 EM specimen preparation unit
Talos 200 kV Arctica Thermo Scientific™ N/A Cryo-Electron Microscope
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A EM specimen preparation unit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
  2. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  3. Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
  4. Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
  5. Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  8. McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
  9. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  10. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  11. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  12. Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
  15. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  16. Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
  17. Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
  18. Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  20. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  21. Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
  22. Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
  23. Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
  24. Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
  25. Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
  26. Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
  27. Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
  28. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  29. Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
  30. Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 173 kryo-EM Latitude-S enkeltpartikkelanalyse SARS-CoV-2 Spike-Protein Talos Arctica
Brukervennlig, høy gjennomstrømning og helautomatisk datainnsamlingsprogramvare for kryo-elektronmikroskopi med én partikkel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, A., P., S., Gulati, S.,… More

Kumar, A., P., S., Gulati, S., Dutta, S. User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62832, doi:10.3791/62832 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter