Summary
Pinpricking basalhodet til den svarte pepperplanten er en kort og tidsbesparende metode for å skade den. Her ga vi detaljerte trinn med en video for å infisere svarte pepperplanter.
Abstract
Piper nigrum L. (svart pepper) er et typisk treaktig vintre som er en økonomisk viktig krydderavling over hele verden. Svart pepperproduksjon påvirkes betydelig av rotrotsykdom forårsaket av Phytophthora capsici, som har alvorlig påvirket industriutviklingen som et "choke point" -problem. Imidlertid er den molekylære genetiske motstandsmekanismen i svart pepper uklar, noe som fører til langsom fremgang i utviklingen av nye svarte peppervarianter. Et effektivt inokulasjons- og presist prøvetakingssystem for Phytophthora capsici på svarte pepperplanter er avgjørende for å studere denne plantepatogeninteraksjonen. Hovedmålet med denne studien er å demonstrere en detaljert metodikk der basalhodet til svart pepper er inokulert med Phytophthora capsici, samtidig som det gir en referanse for inokulering av treaktige vinplanter. Basalhodet til den svarte pepperplanten ble pinpricked for å skade den, og mycelialpellets dekket de tre hullene for å beholde fuktigheten slik at patogenet kunne infisere planten godt. Denne metoden gir en bedre måte å løse ustabiliteten som skyldes tradisjonelle inokulasjonsmetoder, inkludert jorddryn eller rotdipping. Det gir også et lovende middel for å studere virkningsmåten mellom planter og andre jordbårne plantepatogener i landbrukspresisjonsavl.
Introduction
Svart pepper (Piper nigrum L.) er en woody klatrer og en av de viktigste krydderavlingene. Det er kjent som "King of Spices"1 og dyrkes i over 40 land og regioner over hele Asia, Afrika og Latin-Amerika. Phytophthora rotrot er den mest ødeleggende sykdommen i svart pepper, og er forårsaket av oomycete Phytophthora capsici. Dette patogenet infiserer også cucurbits, eggplanter, chilipepper og tomater 2,3. Med svart pepper kan en hel avling noen ganger desimeres av denne sykdommen. Utvidelsen av pepperplantingsområder er begrenset som følge av utilgjengeligheten av resistente varianter, noe som har betydelig hindret utviklingen av den kinesiske svarte pepperindustrien. En effektiv inokulasjon og et presist prøvetakingssystem for Phytophthora capsici på svarte pepperplanter er avgjørende for å studere denne plantepatogeninteraksjonen.
Identifisering og screening av resistens i bakterieplasmaressurser er det grunnleggende kravet for å undersøke patogenets patogenisitet og avl og utnyttelse av resistente varianter. En mye brukt tilnærming er å bruke en rekke identifikasjonsmetoder basert på plantearter og patogengrupper. Nåværende identifikasjonsmetoder inkluderer populasjonsidentifikasjon, individuell identifikasjon, organidentifikasjon, vevsidentifikasjon, celleidentifikasjon, biokjemisk identifikasjon og molekylær identifikasjon, som har blitt utviklet de siste årene 4,5. Det har vært suksess på disse områdene, men det er også mange problemer. Uansett hvilken metode som er valgt, er de grunnleggende kravene til plantemotstandsidentifikasjon konsistente, inkludert klare mål, pålitelige resultater og metoder som er enkle, raske og enkle å standardisere. Dette prinsippet må også følges ved identifisering av svart peppermotstand.
Under naturlige feltforhold kan identifisering av sykdomsresistens påvirkes av mange miljøfaktorer. Derfor ble det foreslått at frittliggende blader og irrigerte røtter brukes i laboratoriet for å identifisere sykdomsresistens. Unge blader fra friske planter ble inokulert in vitro i laboratoriet, og det syke bladerområdet ble målt ved å inokulere patogenet for å identifisere sykdomsresistensen til plante6. In vitro bladinokulering kan imidlertid bare brukes til generell resistensidentifikasjon og ikke for molekylære interaksjonsstudier. Til tross for dette presenterer den sykdomsresistente statusen ofte i den irrigerte rotinokulasjonen, noe som forårsaker usikkerhet i oppfølgingsstudien av molekylær avl for sykdomsresistens. Derfor er raske og enkle innendørs deteksjonsmetoder avgjørende. Denne studien tar sikte på å gi en metode for resistensidentifikasjon i laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av svarte pepperskjæringsplanter for infeksjon
- Ta en fem-node kutting, ca 40 cm lang med en diameter på 0,5 cm, fra en sunn og kraftig voksende ortopedisk gren av svart pepper ved hjelp av en desinfisert beskjæringskniv eller sekateurer. Beskjær de tre nedre nodene i de plagiotrope grenene, med de to øverste nodene igjen med ca. 10 blader intakt.
- Forbered rooting substrat som inneholder jord og dyregjødsel (kummis eller sauemøkk) i forholdet 1:1. Autoklaver rotsubstratet ved 121 °C i 20 minutter.
- Sett stikkene inn i rotsubstratet i en vinkel på ca. 50°, med den tredje noden som bare berører overflaten av substratet og aksillærknoppen på denne noden over substratet.
MERK: Posen som brukes her har følgende dimensjoner: høyde på 40-60 cm, diameter på 25-30 cm. - Hell 10-20 L vann over plantens røtter. Plasser stikkene i et drivhus med 90% skygge ved en temperatur på 25-30 °C for rooting og vekst.
2. Forplantning av Phytophthora capsici (P. capsici)
MERK: En bestand av Phytophthora capsici kultur opprettholdes i plantebeskyttelseslaboratoriet til Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences7.
- Pensle og rengjør potetknollerne under rennende vann fra springen og kutt deretter 200 g poteter i terninger på 1 cm3. Legg noen av kubene i et beger som inneholder 800 ml dobbeltdestillert vann (ddH2O) og kok i 20 min.
- Filtrer kjøttkraft gjennom dobbel gasbind ved hjelp av tyngdekraftfiltrering. Forbered potet dextrose agar (PDA) ved å tilsette 20 g dekstrose og 15 g agar til filtratet og toppe volumet opp til 1 L med ddH2O. Autoklaver blandingen ved 121 °C i 20 min8.
- Hell 20 ml av den steriliserte PDA i flytende form i en 9 cm diameter rund Petri-tallerken inne i en laminær luftstrømshette. La PDA-platene med lokk stå åpne inne i laminær luftstrømshette over natten som et middel til å forhindre kondens.
- Bruk en inokulasjonssløyfe for å hente mycelia fra Phytophthora capsici lager inne i et reagensrør. Plasser inokulumet med den myceliale siden i kontakt med PDA i en Petri-tallerken.
3. Infeksjon av svart pepper
- Inkubasjon
- Identifiser et område 5 cm over substratoverflaten og nær røttene på stammen for inokulering.
- Kjerne ut en disk av mycelia 0,5 cm i diameter på den voksende kanten av Phytophthora capsici kultur på PDA i en Petri parabolen ved hjelp av en stopper borer.
- Skade stammen ved hjelp av en sprøytenål og lag tre hull i et trekantet mønster på det valgte inokulasjonsområdet. Dekk hvert hull med en mycelial disk. Plasser hullene nær hverandre for å sikre at det sårede området er helt dekket med mycelialskivene.
- Dekk mycelialskivene med steriliserte fuktede bomullsputer som et middel til å forhindre tørking. Bind puten på stammen med en polyetylenstrimmel for å opprettholde plasseringen av de inokulerende diskene.
MERK: Ved 8 timer etter inokulering ble de inokulerte hullene svarte og lesjonen forlenget etter hvert som tiden gikk. Bladene ble gule og falt av, og den inokulerte planten døde 7-10 dager etter inokulering. Ingen lesjoner utviklet i kontrollanleggene. De fleste genene uttrykte seg annerledes etter inokulering med Phytophthora capsici i forhold til kontrollgruppen. Histopatologisk analyse av det infiserte vevet viste at Phytophthora capsici kolonisert i xylem.
- Prøv plantematerialene av interesse og oppbevar ved -80 °C i flytende nitrogen til bruk i etterfølgende studier.
MERK: Flytende nitrogen, plastposer, markørpenner, grensaks og andre materialer ble tilberedt før forsøkene. - Etter at de spesifikke plantematerialene er prøvet for bruk, autoklaverer du alle gjenværende plantematerialer, Phytophthora capsici kultur og kulturmedium, og alle instrumenter og labware som brukes i dette inokulasjonsarbeidet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser symptomene på svarte pepperblader etter P. capsici inokulasjon. Figur 2 viser symptomene på sorte pepperstengler etter P. capsici inokulasjon. Patogenet smittet den svarte pepper på basalstammen; symptomer, inkludert bladgulering, visning, xylem og karsvaring vises gradvis. Figur 3 viser de fleste genene uttrykt annerledes etter inokulering med Phytophthora capsici sammenlignet med kontrollgruppen. Figur 4 har vist Phytophthora capsici kolonisert i xylem ved histopatologisk analyse av infisert vev.
Figur 1: Symptomene på svart pepperblader etter P. capsici inokulasjon7. CK: kontrollgruppe; Inokulert: etter inokulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Symptomet på sorte pepperstammer etter P. capsici inokulering7. Inokulert: etter inokulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Detaljerte uttrykksprofiler av genene i de svarte pepperrøttene. Feilfelt i tallene angir standardfeilen for uttrykksnivåer fra tre biologiske replikasjoner. CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24 og 48 på x-aksen refererer til henholdsvis 8, 12, 24 og 48 h på kontrollen og 8, 12, 24 og 48 timer, etter inokulering med P. capsici. Y-aksen representerer det relative uttrykksnivået sammenlignet med allestedsnærværende. Hver kolonne representerer gjennomsnittsverdien pluss SD (standardavvik) fra tre biologiske replikeringer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Histopatologiske analyser av infisert vev. Sammenligningen mellom toluidinblå O-farging alene (venstre kolonne) og bomullsblå og safranin O dobbeltfarging (høyre kolonne) (20X). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien ble basalhodet pinpricked til skade og gir et effektivt inokulasjonssystem i den svarte pepperplanten. Mycelial pellets dekket deretter de tre hullene for å beholde fuktighet og gjøre det mulig for patogenet å infisere planten godt. Etter inokulering ble bladene gule og falt av og de inokulerte plantene døde. Ingen lesjoner utviklet i kontrollanleggene. De fleste gener uttrykte seg annerledes etter inokulering med Phytophthora capsici i forhold til kontrollgruppen. Soppsykdommer er ansvarlige for strukturelle og fysiologiske lidelser i et betydelig antall avlinger, noe som fører til redusert produktivitet og økonomiske tap for produsentene. Strukturelle studier som bruker histologiske teknikker på modus for penetrasjon og kolonisering av plantevev av sopp gir en detaljert indikasjon på samspillet mellom patogenet og plantevevet. Disse studiene har avdekket viktige aspekter for å forstå monocycle av sykdommer. Histopatologisk analyse av infisert vev viste Phytophthora capsici kolonisert i xylem. Denne metoden gir et bedre middel for å løse ustabiliteten som er forårsaket av tradisjonelle inokulasjonsmetoder, inkludert jorddryn eller rotdipping. En effektiv inokulasjon og presist prøvetakingssystem for Phytophthora capsici på svarte pepperplanter er avgjørende for å studere denne plantepatogeninteraksjonen. Det gir også et lovende middel for å studere virkningsmåten mellom planter og andre jordbårne plantepatogener i landbrukspresisjonsavl.
Samtidig representerer denne protokollen en mer effektiv måte å gi referanse for inkubasjon av treaktig vintre. I tidligere studier ble patogener inokulert ved rotdipping med sporfjæring dyrket i V8 medium9. Det tar 7 dager før sporefjæringen er klar, mens bruken av PDA til kultur Phytophthora capsici tar bare 5 dager. PDA-platen ble forseglet ved hjelp av gjennomtrengelig kirurgisk tape som et middel til å unngå forurensning fra andre bakterier og sopp. Kulturene ble holdt ved romtemperatur. Metoden som brukes i denne studien kan spare mer tid og utføres raskere. Svart pepper er et treaktig vintre med mange sukkerarter og fenoler10, og zoosporene produsert av Phytophthora capsici forekommer vanligvis i jord, noe som gjør det vanskelig å infisere svarte pepperviner og forårsake infeksjon ustabilitet i roten11. Denne protokollen gir bedre resultater, noe som muliggjør en sterk interaksjon mellom vinplanter og jordbårne patogener. Påvisning av den dynamiske prosessen mellom planter og patogener er synlig og praktisk.
Den vannende rotmetoden er rask og tidsbesparende, men et problem forblir uløst for svart pepper. Phytophthora capsici er et jordbåren patogen som generelt infiserer planterøtter via sporangia og zoospores12. I naturen er sporangia i stand til å spre seg via regn og vanning. Når dyreparkene er festet til planteoverflaten, kan bakterierørene raskt utvikle seg og trenge inn i plantevevet, noe som resulterer i infeksjon 13,14. Dette kan føre til usikkerhet om at valg av hyphae som infeksjonskilde vil være lik sporefjæringen. Metoden som brukes i denne studien starter med å pinpricking basalhodet til den svarte pepperplanten for å skade den. Det skadede området er deretter dekket med Phytophthora capsici og fuktighet beholdes, og sikrer at patogenet kan infisere planten godt. Denne metoden er bedre til å løse ustabiliteten forårsaket av tradisjonelle inokulasjonsmetoder, inkludert jorddryn eller rotdipping. Det er også en lovende metode for å studere virkningsmåten mellom planter og andre jordbårne plantepatogener i landbrukspresisjonsavl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av National Key R&D Program of China (2020YFD1001200), China Agriculture Research System (CARS-11), det spesifikke forskningsfondet til Innovasjonsplattformen for akademikere i Hainan-provinsen (YSPTZX202154), Natural Science Foundation i Hainan-provinsen i Kina (321RC652), og Natural Science Foundation of China (No. 31601626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
- Gordo, S. M., et al. High-throughput sequencing of black pepper root transcriptome. BMC Plant Biology. 12 (1), (2012).
- Leonian, L. H. Stem and fruit blight of Peppers caused by Phytophthora capsici sp. Nov. Phytopathology. 12 (9), 401-408 (1922).
- Ding, X., et al. Priming maize resistance by its neighbors: Activating 1,4-benzoxazine-3-ones synthesis and defense gene expression to alleviate leaf disease. Frontiers in Plant Science. 6, 830 (2015).
- Fonseca, C. E. L., Vianda, D. R., Hansen, J. L., Pell, A. N. Associations among forage quality traits, vigor, and disease resistance in alfalfa. Crop Science. 39 (5), 1271-1276 (1999).
- Altier, N. A., Thies, J. A. Identification of resistance to Pythium seedling disease in Alfalfa using a culture plate method. Plant Disease. 79 (4), 341-345 (1995).
- Pratt, R. G., Rowe, D. E. Evaluation of simplified leaf inoculation procedures for identification of quantitative resistance to Sclerotinia trifoliorum in Alfalfa seedling. Plant Disease. 82 (10), 1161-1164 (1998).
- Hao, C., et al. De novo transcriptome sequencing of black pepper (Piper nigrum L.) and an analysis of genes involved in phenylpropanoid metabolism in response to Phytophthora capsici. BMC Genomics. 17 (1), 1-14 (2016).
- Dong, C., et al. Field inoculation and classification of maize ear rot caused by Fusarium verticillioides. Bio-protocol. 8 (23), 3099 (2018).
- English, J. T., Laday, M., Bakonyi, J., Schoelz, J. E., Érsek, T. Phenotypic and molecular characterization of species hybrids derived from induced fusion of zoospores of Phytophthora capsica and Phytophthora nicotianae. Mycological Research. 103 (8), 1003-1008 (1999).
- Chatterjee, S., et al. Antioxidant activity of some phenolic constituents from green pepper (Piper nigrum L.) and fresh nutmeg mace (Myristica fragrans). Food Chemistry. 101 (2), 515-523 (2007).
- Pfender, W. F. Production of sporangia and release of zoospores by Phytophthora megasperma in soil. Phytopathology. 67 (5), 657-663 (1977).
- Nagila, A., Schutte, B. J., Sanogo, S., Idowu, O. J. Chile pepper sensitivity to mustard seed meal applied after crop emergence. HortScience. 56 (2), 1-7 (2021).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsica. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Hardham, A., Gubler, F. Polarity of attachment of zoospores of a root pathogen and pre-alignment of the emerging germ tube. Cell Biology International Reports. 14 (11), 947-956 (1990).
